Целевая доставка доксорубицина с использованием липосом, функционализированных анти-EpCAM-аптамером: эффективность в моделях колоректальной карциномы C26

Аннотация

В данном исследовании поверхность PEGилированных нанолипосомальных препаратов доксорубицина (DOX) (Каэликс®) была функционализирована анти-EpCAM (эпителиальная молекула клеточного адгезиона) аптамером методом постинсерции анти-EpCAM-аптамера, конъюгированного с DSPE-mPEG₂₀₀₀. Были определены размер, заряд, профиль освобождения, цитотоксичность и клеточное поглощение формулировки. Характеризация ED-lip продемонстрировала незначительное увеличение размера и PDI вместе со снижением дзета-потенциала, что подтвердило эффективность постинсерции. Результаты флюориметрии и флуоресцентной микроскопии показали, что ED-lip значительно повышает уровень клеточного поглощения на линии C26 по сравнению с Caelyx®. ED-lip также проявил более выраженные цитотоксические эффекты, что подтверждает эффективность анти-EpCAM-аптамера как таргетингового лиганда. Фармакокинетика и биодистрибуция формулировок у мышей с тumeurs C26 показали, что ED-lip не изменяет профиль распределения DOX по сравнению с Caelyx®. Кроме того, ED-lip эффективно улучшил накопление DOX в опухоли и продлил выживание животных. Эти результаты указывают на перспективность функционализации Caelyx® анти-EpCAM-аптамером для лечения рака и необходимость дальнейших исследований.

Введение

Наносистемы доставки лекарств (НСДЛ) размером 100–200 нм пассивно аккумулируются в микросреде опухоли за счет эффекта усиленного проникновения и удержания (EPR). Это происходит через ослабленный эндотелиальный покров и слабый лимфатический отток. Однако недавние данные показывают, что менее 1% введенного препарата достигает опухоли [1]. Неспособность проникать через плотную внеклеточную матрицу (ВКМ) опухоли, возвращение освободившегося препарата в кровоток и гетерогенность опухолей — основные причины этого неудачи [2]. Для улучшения опухолевой аккумуляции НСДЛ используются различные стратегии с эндогенными и экзогенными стимулами [3]. Такие системы могут реагировать на экзогенные стимулы, например свет, и применяться для визуализации опухолей [4]. Существует множество неорганических наноматериалов с антиопухолевой активностью [5, 6], однако их токсичность и экологическая безопасность требуют тщательного изучения [7–11].

Активная таргетированная доставка — важный подход, позволяющий НСДЛ эффективнее доставлять терапевтические агенты в опухоль, минимизируя воздействие на здоровые ткани [12, 13]. Идеальный таргетинговый агент — молекула, имеющая аффинность к белкам или рецепторам на поверхности клеток, гиперэкспрессированным в определенных тканях [14].

Эпителиальная молекула клеточного адгезиона (EpCAM) — трансмембранный гликопротеин, рассматриваемый как кандидат для активного таргетинга. Показано, что в здоровых эпителиальных клетках EpCAM экспрессируется на низком уровне, тогда как в раковых клетках его экспрессия возрастает до 1000 раз [15–17]. В процессе канцерогенеза локализация EpCAM смещается с базальной и базолатеральной мембран нормального эпителия на апикальную поверхность опухолевых эпителиальных клеток [18]. Такая дифференциальная экспрессия делает EpCAM привлекательной мишенью для доставки лекарств, повышающей терапевтический индекс [19].

EpCAM является маркером раковых стволовых клеток (РСК) или инициирующих опухоль клеток (ИОК), и его гиперекспрессия ассоциируется с неблагоприятным прогнозом [20]. РСК/ИОК обладают способностью к самообновлению и играют ключевую роль в развитии опухоли и метастазировании [21]. Гиперекспрессия EpCAM отмечена в РСК различных солидных опухолей [22]. В последнее время аптамеры привлекли внимание как перспективные таргетинговые лиганды для НСДЛ [23, 24]. Аптамеры — олигонуклеотидные последовательности ДНК или РНК, формирующие вторичные и третичные структуры со специфической аффинностью к мишеням, например рецепторам на поверхности клеток [23, 24]. Они обладают преимуществами перед антителами: неиммуногенны, имеют низкую молекулярную массу (8–25 кДа), химическую и термическую стабильность, а их синтез и модификация дешевы и масштабируемы [25]. Селективная таргетировка НСДЛ через анти-EpCAM-аптамер — эффективная стратегия доставки химиотерапевтических агентов в микросреду опухоли [19, 26]. Различные исследования подтвердили, что наноносители, функционализированные анти-EpCAM-аптамером, улучшают доставку антиопухолевых препаратов в опухолевые клетки [15, 27, 28].

Цель работы — разработать анти-EpCAM ДНК-аптамер (SYL3C)-PEGилированные нанолипосомы, загруженные доксорубицином (ED-lip), как модель НСДЛ. Функционализация выполнялась методом EDC/NHS-сочетания между аминогруппой аптамера и карбоксилгруппой DSPE-mPEG₂₀₀₀, с последующей постинсерцией в липосому (рис. 1). ED-lip характеризовали по размеру, дзета-потенциалу, эффективности инкапсуляции доксорубицина, профилю освобождения и цитотоксичности. Затем оценивали, улучшают ли ED-lip клеточное поглощение in vitro и доставку DOX в опухоль у мышей с колоректальной карциномой C26.

Рис. 1. Приготовление анти-EpCAM-функционализированного Caelyx® (ED-lip). a Связывание анти-EpCAM-аптамера с DSPE-mPEG₂₀₀₀ посредством ковалентной связи первичных аминов (-NH2) аптамера с карбоксилгруппой (-COOH) DSPE-mPEG₂₀₀₀. b Метод постинсерции для приготовления анти-EpCAM-функционализированного Caelyx® (ED-lip).

Результаты и обсуждение

Caelyx® — PEGилированный липосомальный доксорубицин, один из наиболее широко используемых химиотерапевтических агентов и первый нанопрепарат, одобренный FDA для лечения рака яичника, саркомы Капоши, связанной со СПИД, и множественной миеломы. Caelyx® пассивно проникает в опухоль за счет эффекта EPR [29]. Несмотря на значительное улучшение фармакокинетики и полупериода выведения DOX, основные ограничения Caelyx® — недостаточное клеточное поглощение и низкая скорость освобождения препарата в опухоли [29]. Здесь мы использовали аптамер SYL3C как таргетинговый лиганд для функционализации липосомального доксорубицина (ED-lip) с целью таргетирования EpCAM на поверхности раковых клеток, обеспечивая активную доставку DOX в конкретную мишень.

Конъюгация DSPE-mPEG₂₀₀₀ с аптамером

Для конъюгации аминофункционализированных анти-EpCAM-аптамеров с активированной карбоксилгруппой DSPE-mPEG₂₀₀₀-COOH использовалась химия сочетания EDC/NHS. Преимущество этой реакции — стабильность образующейся амидной связи и снижение неспецифических взаимодействий между аптамерами [30]. Аптамеры можно модифицировать первичным амином или тиолгруппой для ковалентной конъюгации с активированным карбоксилом или малеимидной группой DSPE-PEG₂₀₀₀ соответственно [31]. Тиол-модифицированные аптамеры конъюгировались с малеимидной группой DSPE-PEG₂₀₀₀, затем пост-инсертировались в структуру липосомы для декорирования внешней поверхности [32]. Важное ограничение тиол-малеимидной химии — окисление тиолгрупп аптамеров при хранении с образованием дисульфидных связей (S-S) между двумя модифицированными аптамерами. Такие димерные аптамеры не могут участвовать в реакции конъюгации [30]. Использование реакций EDC/NHS повышает выход продукта и эффективность метода постинсерции.

Аптамеры имеют преимущества перед антителами: легкость синтеза и масштабирования, низкая системная токсичность и отсутствие иммуногенности [33]. После конъюгации аптамера с липидом использовали метод постинсерции для получения анти-EpCAM-аптамер-декорированного Caelyx® (ED-lip). Метод постинсерции прост и эффективен для присоединения аптамеров к поверхности липосом и обеспечивает высокую степень встраивания аптамеров [34].

Для оценки постинсерции анти-EpCAM-аптамера на липосоме использовали гель-электрофорез в агарозе. Как показано на рис. 2, отрицательно заряженные аптамеры мигрировали в геле, их полосы были визуализированы, тогда как для формулировки ED-lip соответствующей полосы не было, так как ED-lip оставался в колодце и не мог двигаться через гель. Эти результаты подтвердили успешную постинсерцию аптамер-конъюгированных мицелл в поверхность липосом.

Рис. 2. Агарозный гель-электрофорез формулировки ED-lip. Образцы загружены в агарозный гель. Визуализация УФ-светом. Колодцы, соответствующие маркеру, свободному аптамеру и PL-конъюгированным аптамерам, обозначены. Отсутствие соответствующей полосы в липосом-аптамере подтверждает постинсерцию.

Физико-химическая характеристика ED-lip

Физико-химическая характеристика Caelyx® и ED-lip представлена в таблице 1. Размер и заряд подготовленных формулировок показали, что модификация Caelyx® анти-EpCAM-аптамером не оказывает значимого влияния на размер частиц (p > 0.05). Размер липосом до инсерции аптамера (Caelyx®) составлял ~96 нм с PDI 0.11, после постинсерции (ED-lip) размер частично увеличился до 117 нм с PDI 0.14, что все равно является желательным для доставки в опухоль. Предыдущие исследования также показывали, что включение таргетинговых лигандов приводит к увеличению размера и PDI липосом [35, 36]. Кроме того, дзета-потенциал ED-lip (−19.25 мВ) стал более отрицательным, чем у Caelyx® (−12 мВ). Показано, что конъюгация РНК-аптамера в липосому приводит к снижению дзета-потенциала [37]. Увеличение размера и более отрицательный дзета-потенциал ED-lip свидетельствуют об успешной постинсерции конъюгированных аптамеров на поверхности липосомы [38]. Эти результаты согласуются с нашим предыдущим исследованием, показывавшим, что присоединение аптамера к поверхности Caelyx® приводит к незначительному увеличению размера частиц и более отрицательному дзета-потенциалу аптамер-функционализированного Caelyx® [38, 39]. Однако эффективность постинсерции должна проверяться с точки зрения времени и температуры инкубации для получения более эффективных постинсертированных липосом с лучшими размером и PDI. Эффективность инкапсуляции Caelyx® и ED-lip составляла 100% (см. таблицу 1).

Количество аптамеров, постинсертированных на поверхность липосомы, определялось описанным методом [6]. Общее содержание фосфолипидов в липосомальной формулировке, определенное фосфатным анализом, составляло 14 мМ. Поскольку среднее число липидных молекул в липосоме среднего размера 100 нм равно 8×10⁴, число липосом в каждом миллилитре составляет ~10¹⁴ [38]. Молекулярная масса аптамера — г/моль. Число DSPE-mPEG₂₀₀₀-аптамеров определялось методами фосфатного анализа, в которых моли фосфатных молекул соответствуют молам конъюгированных молекул. Исходя из этих данных, число молекул аптамера на каждый мл аликвоты раствора составляет 10¹⁵.

Профиль освобождения DOX

Инсерция аптамер-конъюгированных мицелл на внешнюю поверхность Caelyx® могла повлиять на профиль освобождения DOX. Поэтому оценивали освобождение DOX из ED-lip по сравнению с Caelyx® в 5% декстрозе с 50% ФСС. Эта среда имитирует поведение освобождения формулировок в плазме [40]. На рис. 3 показано, что в течение 24 часов исследования нет значимой разницы в освобождении DOX из Caelyx® и ED-lip, и освобождаются только незначительные количества DOX. Это согласуется с нашими предыдущими исследованиями, показывавшими, что инсерция аптамера на поверхность липосомы не влияет на стабильность мембраны и профиль освобождения DOX [38, 39]. Это обусловлено в первую очередь стабильностью формулировки Caelyx®, полученной методом дистанционной загрузки, управляемой pH-градиентом [41].

Рис. 3. Исследование освобождения. Профиль утечки DOX из Caelyx® и ED-lip при 37 °C в присутствии 50% ФСС в декстрозе в течение 24 часов. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка (SEM) (n = 3).

Клеточное взаимодействие и клеточное поглощение (флуоресцентная микроскопия)

Клеточное взаимодействие и поглощение липосомальных формулировок оценивали при 4 °C и 37 °C (рис. 4). Оценка таргетинговой эффективности ED-lip показала отсутствие различий в средних интенсивностях флуоресценции (MFI) клеток CHO-K1, обработанных Caelyx® и ED-lip, при 4 °C и 37 °C (рис. 4a, c). Однако данные продемонстрировали, что таргетированный ED-lip имеет значительно более высокое поглощение клетками C26 по сравнению с Caelyx® при 4 °C и 37 °C (рис. 4b, d), что было статистически значимо при 37 °C (p < 0.0001). ED-lip показал значимое поглощение по сравнению с Caelyx® (p < 0.001). Эти результаты указывают на то, что ED-lip повышает таргетинговую специфичность благодаря более высокой аффинности анти-EpCAM-аптамера к линии C26 по сравнению с клетками CHO-K1. Свободный DOX свободно проходит через липидный бислой и входит в клетку, поэтому имеет наивысшее клеточное поглощение среди формулировок и наивысшую цитотоксичность. В случае Caelyx® PEGилирование ограничивает скорость эндоцитоза и снижает цитотоксичность. Однако наличие анти-EpCAM-аптамера на поверхности липосомы (ED-lip) ускоряет интернализацию формулировки в клетки и повышает ее цитотоксичность по сравнению с Caelyx® [38]. Данные флуоресцентной микроскопии показали, что разница в клеточном поглощении ED-lip и свободного DOX в линии C26 при 37 °C незначительна (рис. 5). Однако масштабирование на основе интенсивности интернализированного DOX, представленное в таблице 2, показало, что и ED-lip, и DOX имеют статистически значимые различия с Caelyx® в клеточном поглощении C26 (p < 0.001). Хотя клетки C26 экспрессируют низкий уровень EpCAM на своей поверхности [42], данные этого исследования указывают на то, что наличие анти-EpCAM-аптамера может ускорить процесс интернализации липосом [43].

Рис. 4. Клеточное взаимодействие и поглощение липосомальных формулировок, оцененное при 4 °C и 37 °C. a Взаимодействие формулировок с клетками CHO-K1 при 4 °C и 37 °C. b Взаимодействие формулировок с клетками C26 при 4 °C и 37 °C. c График средних MFI формулировок на клетках CHO-K1 и C26. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 3). ****p < 0.0001.

Рис. 5. Флуоресцентная микроскопия. Результаты клеточной интернализации DOX на линиях C26, визуализированные флуоресцентной микроскопией. Клетки окрашены DAPI. И свободный DOX, и ED-lip показывают более высокий уровень интернализации DOX по сравнению с Caelyx®. Клетки рассматривались под увеличением ×200.

Исследование цитотоксичности

Цитотоксические эффекты свободного DOX, Caelyx® и формулировок ED-lip показаны на рис. 6. Различные концентрации формулировок использовали для обработки клеток в течение 1, 3 и 6 часов, затем инкубировали еще 72 часа. Данные показали, что все формулировки воздействуют на клетки в зависимости от времени и дозы. Жизнеспособность клеток C26, обработанных формулировкой ED-lip, снизилась по сравнению с клетками, обработанными Caelyx®. Поскольку клетки CHO-K1, как EpCAM-отрицательные, демонстрируют более слабую реакцию на ED-lip по сравнению с клетками C26, можно предположить, что анти-EpCAM-аптамер повышает специфическую доставку Caelyx® к мишеневым клеткам. Эти результаты подтверждают специфическое клеточное поглощение ED-lip клетками C26. Они подчеркивают важность использования таргетированной доставки лекарств со специфическими таргетинговыми агентами для селективной доставки препарата в мишеневые клетки с снижением побочных эффектов за счет избегания офф-таргетного воздействия [44]. Как сообщалось ранее, активная таргетировка Caelyx® специфическими лигандами, такими как аптамеры и антитела, приводит к увеличению активного таргетинга опухоли и специфической доставке препарата в мишеневые клетки, что, в свою очередь, повышает терапевтическую эффективность DOX [35, 39].

Рис. 6. In vitro цитотоксический эффект (IC50) ED-lip, Caelyx® и свободного доксорубицина против клеток CHO и C26 после разных времен экспозиции. Данные представлены в мкг/мл ± SEM (n = 3). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

Биодистрибуция и фармакокинетика

Для оценки влияния анти-EpCAM-аптамера на биодистрибуцию DOX вводили дозу 10 мг/кг ED-lip и Caelyx® мышам с подкожными опухолями колоректального рака C26. Концентрация DOX в плазме через 3, 12, 24, 48 и 72 часа после инъекции Caelyx® и ED-lip показана на рис. 7. Результаты показывают, что поведение плазменных концентраций DOX в обеих группах было похожим, и значимых различий между формулировками не выявлено. Как показано в таблице 3, конъюгация анти-EpCAM-аптамера с поверхностью липосомы незначительно снизила полупериод циркуляции с 39.3 до 34.2 часов и MRT с 47.6 до 42.9 часов (см. таблицу 3). Фармакокинетические параметры указывают на то, что конъюгация анти-EpCAM-аптамера на липосоме незначительно снижает t_½ и MRT, что согласуется с предыдущими отчетами, демонстрирующими, что конъюгация аптамера на поверхности липосомы ускоряет клиренс липосом [38]. Адсорбция белков и последующее удаление мононуклеарной фагоцитарной системой (МФС) могут быть причиной ускорения клиренса лиганд-конъюгированных наночастиц [45].

Рис. 7. Плазменный уровень DOX. Результаты концентрации в зависимости от времени количества DOX в крови через 3, 12, 24, 48 и 72 часа после инъекции. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 3).

На рис. 8 показаны концентрации DOX в основных собранных органах в группах, получивших Caelyx® и ED-lip. Наиболее важным побочным эффектом свободного DOX является кардиотоксичность, риск которой Caelyx® значительно снижает [46]. Биодистрибуция ED-lip в печени, легких и селезенке значительно выше, чем у Caelyx®, в момент 3 часа. Наличие проницаемых сосудов и увеличение размера и PDI ED-lip после постинсерции могут быть причинами большего накопления ED-lip в этих тканях на ранних этапах. Показано, что увеличение размера наночастиц до 150 нм усиливает их накопление в печени, легких и селезенке [47]. Тем не менее, результаты биодистрибуции ясно демонстрируют механизм EPR в накоплении наночастиц в опухоли. Рис. 8 показывает, что и ED-lip, и Caelyx® постепенно накапливаются в зоне опухоли, достигая максимума примерно к 12 часам, оставаясь на плато до 24 часов, а затем постепенно уменьшаясь к 48 и 72 часам. Интересно, что во всех временных точках (3, 12, 24, 48 и 72 часа) накопление ED-lip в опухоли значительно выше, чем Caelyx®, что может быть связано с эффективностью активного таргетинга анти-EpCAM-аптамером. Эти результаты указывают на то, что присоединение аптамера на поверхность липосомы не влияет на распределение DOX в почках. Следовательно, анти-EpCAM-аптамеры эффективно способствуют опухолевой проникновению липосом, что также может быть связано с гиперекспрессией молекул EpCAM в эндотелиальных клетках сосудов опухоли [48]. Ранее показано, что анти-EpCAM-аптамеры могут улучшить проникновение в ксенотрансплантированные опухоли [49]. РСК/ИОК также являются мишенью анти-EpCAM-терапии. Введение анти-EpCAM-аптамеров как таргетингового лиганда для таргетирования EpCAM показало перспективные эффекты в таргетировании РСК [22, 50]. Здесь можно предположить, что часть эффективного антиопухолевого эффекта ED-lip может быть обусловлена успешным таргетированием РСК.

Рис. 8. Тканевая биодистрибуция. Результаты биодистрибуции DOX в сердце, опухоли, печени, легких, селезенке и почках. Концентрации (мкг/г) приведены через 3, 12, 24, 48 и 72 часа после инъекции для каждого органа. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 3). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

In vivo антиопухолевая активность

Терапевтическая эффективность ED-lip оценивали в модели колоректальной карциномы C26. Размер опухоли, масса тела и выживание мониторили в течение почти 2 месяцев, результаты суммированы на рис. 9 и в таблице 4. Данные указывают, что ED-lip не оказывает явного влияния на массу тела мышей, как и Caelyx® (рис. 9a). Как показано на рис. 9b, после внутривенного введения Caelyx® и ED-lip скорость роста опухоли эффективно подавлялась до 30-го дня после инъекции, и значимых различий между липосомальными группами не было. После 30 дней после инъекции скорость роста опухоли ускорялась, однако в группах, получавших препараты, она все равно была ниже, чем в группе, получавшей ФСБ. Разница между группой Caelyx® и ED-lip не была значимой в течение 30 дней после инъекции. Результаты выживания представлены в виде кривой Каплана-Мейера. Рис. 9c показывает, что ED-lip улучшает кривую выживания по сравнению с ФСБ или Caelyx®. Основные показатели исследования выживания суммированы в таблице 4. У трех мышей группы ED-lip опухоли полностью исчезли, поэтому медианное время выживания (MST) для этой группы не определено. Лечение ED-lip увеличило TTE с 41.1 до 49.7 дней и привело к эффективной антиопухолевой активности с 90.27% TGD с неопределенным MST из-за полного исчезновения опухоли у трех мышей (см. таблицу 4).

Рис. 9. In vivo терапевтическая эффективность формулировок у самок мышей BALB/c с колоректальной карциномой C26. Мыши получали одиночную внутривенную инъекцию формулировок (10 мг/кг). a Профиль процентного изменения массы тела мышей BALB/c в каждой экспериментальной группе. b Динамика размера опухоли у мышей BALB/c. c График выживания для мышей BALB/c. Данные представлены как среднее ± SD (n = 5).

Данные о размере опухоли демонстрируют, что ED-lip может драматически подавлять рост опухоли. Результаты анализа выживания показали, что лечение ED-lip увеличивает MST и TTE. Группа, получившая ED-lip, имела более высокий TGD% и была более эффективной по сравнению с Caelyx®. Наши выводы согласуются с высоким уровнем концентрации DOX в ткани опухоли группы, получившей ED-lip. Следовательно, аптамер-конъюгированный липосомальный DOX улучшает проникновение и, следовательно, повышает накопление препарата в зоне опухоли, что, в свою очередь, приводит к увеличению эффективности Caelyx® и более высокому TGD% в данных выживания. В совокупности эти данные указывают на то, что анти-EpCAM-аптамеры могут служить важными таргетинговыми агентами для доставки лекарств.

Заключение

Мы поверхностно функционализировали Caelyx® анти-EpCAM (SYLC3) аптамером методом постинсерции (ED-lip). Флюориметрия и флуоресцентная микроскопия показали высокий уровень поглощения DOX клетками C26, что указывает на то, что аптамер может ускорить процесс интернализации ED-lip. Фармакокинетические данные показали, что постинсерция DSPE-mPEG-EpCAM не меняет фармакокинетику DOX по сравнению с Caelyx®. Однако тканевая биодистрибуция показала более высокое накопление ED-lip в опухоли по сравнению с Caelyx® даже через 72 часа после инъекции. Мы продемонстрировали, что ED-lip обладает улучшенными терапевтическими эффектами у мышей с опухолями C26. Улучшенные параметры выживания мышей, получивших ED-lip, свидетельствуют о том, что EpCAM-таргетированные липосомы с DOX являются перспективным носителем для доставки препаратов для лечения рака и заслуживают дальнейшего изучения.

Материалы и методы

Материалы

5′-Амино-анти-EpCAM ДНК-аптамер (последовательность 5′ -CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3′) (SYL3C) приобретен в BIONEER (биотехнологическая компания, Тэджон, Южная Корея). DSPE-mPEG₂₀₀₀-COOH приобретен в Avanti Polar Lipids (Алабастер, АЛ). Dowex®, 1-Этил-3-(3-диметиламинпропил) карбодиимид (EDC), N-Гидроксисукцинимид (NHS), пениллин стрептомицин и Fluoroshield™ с DAPI приобретены в Sigma-Aldrich (Сент-Луис, MO). Коммерчески доступный Caelyx® приобретен в компании Behestan Darou (Тегеран, Иран).

Конъюгация DSPE-mPEG₂₀₀₀ с аптамером

Анти-EpCAM-аптамер связывали с DSPE-mPEG₂₀₀₀ посредством ковалентной связи первичных аминов (-NH2) анти-EpCAM-аптамера с карбоксилгруппой (–COOH) DSPE-mPEG₂₀₀₀ (рис. 1). Конъюгация выполнялась методом EDC/NHS-сочетания [51]. Кратко: DSPE-mPEG₂₀₀₀ диспергировали в буфере 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота (MES) (pH 6.5) и добавляли 400 мМ EDC и 100 мМ NHS. Дисперсию помешивали 15 мин для активации карбоксилгрупп липида. Затем добавляли анти-EpCAM-аптамер и помешивали следующие 2 часа при комнатной температуре в темноте. Молярное соотношение липид:анти-EpCAM-аптамер было 1:1, а молярное соотношение EDC/NHS — 10-кратное по отношению к липиду.

Модификация Caelyx® с DSPE-mPEG-Анти-EpCAM Аптамер

ED-lip синтезировали методом постинсерции. Для постинсерции мицеллы DSPE-mPEG-анти-EpCAM-аптамера добавляли к 1 мл Caelyx® на 30 мин при 60 °C. Количество DSPE-mPEG-EpCAM-аптамера определяли по методу Бартлетта фосфатного анализа [52]. Исходя из приблизительного числа липосом на миллилитр Caelyx® (~10¹⁴), объем DSPE-mPEG-анти-EpCAM подбирали так, чтобы достичь 10 аптамеров на каждую липосому [36]. Агарозный гель-электрофорез использовали для подтверждения постинсерции [39].

Физико-химическая характеристика

Размер частиц, индекс полидисперсности (PDI) и поверхностный заряд определяли методом динамического рассеяния света (DLS) (Nano-ZS; Malvern, UK). Для удаления свободного DOX липосомы смешивали с смолой Dowex® и вращали 60 мин, затем прогоняли через колонки Poly-Prep (Bio-Rad Laboratories Inc.) для удаления Dowex® [53]. Количество DOX в липосомальных формулировках определяли с помощью флуоресцентного спектрофотометра LS-45 (Perkin-Elmer, UK) (экскаitation: эмиссия 485:590 нм).

Исследование освобождения

Для оценки освобождения DOX 1 мл формулировки добавляли к 9 мл декстрозы (с 50% фетового бычьего сывороточного белка (ФСС)) и в определенные интервалы времени (0, 1, 2, 4, 6, 12 и 24 часа) забирали образцы. После удаления свободного DOX смолой Dowex® количество препарата, оставшегося в липосомах, определяли флуоресцентным спектрофотометром и рассчитывали процент освобождения [39].

Клеточная культура

Клеточные линии колоректальной карциномы C26 и китайского хомяка (CHO-K1) приобретены в Пастеровском институте Ирана. Клетки культивировали в среде RPMI1640 с 10% ФСС (Gibco, Thermos Fisher Scientific, США) и 100 МЕ/мл пениллин, 100 мг/мл стрептомицин. Клетки инкубировали при 37 °C с 5% CO₂ и 95% влажностью.

Анализ клеточного взаимодействия и клеточного поглощения

Клеточное взаимодействие и поглощение формулировок оценивали при 4 °C и 37 °C соответственно. Выбрали две клеточные линии: CHO-K1 и C26. Клетки посевали в каждую ячейку 12-ячеистой пластинки (2.5 × 10⁵ на ячейку). После ночной инкубации при 37 °C добавляли обработки и пластинки помещали при 4 °C и 37 °C на еще 3 часа. Затем клетки промывали ФСБ, трипсинизировали. Флуоресцентная интенсивность DOX определяли флюориметрией (BD FACSCalibur). Данные анализировали программой FlowJo версии 7.0.

Оценка флуоресцентной микроскопией

1 × 10⁶ клеток C26 на ячейку посевали в 6-ячеистые пластинки, в которые предварительно вставляли стерильные стеклы для микроскопии. После ночной инкубации при 37 °C и 5% влажности клетки обрабатывали свободным DOX, Caelyx® и ED-lip в течение 24 часов для полного клеточного поглощения [54]. Затем клетки промывали ФСБ и фиксировали 4% формальдегидом. Стеклы окрашивали Fluoroshield™ с DAPI и монтировали на предметных стеклах. Обработки проводили в триplicates. С каждого стекла выбирали шесть зон под увеличением ×200. Внутренняя флуоресценция DOX использовалась для оценки клеточного поглощения препарата. Масштабирование выполняли на основе процента клеток, показавших клеточное поглощение DOX в каждом микроскопическом поле: 1: 0–20%, 2: 20–40%, 3: 40–60%, 4: 60–80%, 5: 80–100%.

Оценка цитотоксичности

Значения IC50 свободного DOX, Caelyx® и ED-lip определяли методом МТТ. Для этого клетки CHO-K1 и C26 посевали с плотностью 5 × 10³ клеток на ячейку в 96-ячеистых пластинках при 37 °C. После ночной инкубации липосомальные формулировки и раствор свободного DOX серийно разбавляли в среде без ФСС и добавляли к клеточным культурам, инкубировали 1, 3 и 6 часов при 37 °C. Затем клетки промывали и инкубировали 72 часа. Оптическую плотность (OD) измеряли спектрофотометрическим абсорбционным методом при 570 нм на фоне 630 нм на микропластинкочитайтере Stat-Fax 2100 (Awareness Technology Inc. США). Затем рассчитывали значения IC50.

Животные исследования

Самки мышей BALB/c (4–6 недель, 18–20 г) содержали в отдельных клетках при 22 ± 2 °C на стандартной гранулированной диете и воде ad libitum. Для анестезии использовали внутрибрюшное (i.p.) введение кетамина и ксилазина (100 мг/кг кетамин и 10 мг/кг ксилазин) [55]. Подкожно в правый бок вводили 3 × 10⁵ клеток C26 на мышь в 60 мкл ФСБ. Через две недели после инокуляции, когда размеры опухоли достигли ~5 мм³, мышей случайным образом разделяли на 3 группы (n = 3 для биодистрибуции и n = 5 для антиопухолевого исследования в группе). Все экспериментальные протоколы одобрены комитетом по этике животных Медицинского университета Машхад и выполнялись в соответствии с международными правилами, учитывающими права животных.

Исследования биодистрибуции и фармакокинетики

Через 14 дней после инокуляции опухоли мышей вводили дозу 10 мг/кг Caelyx® и ED-lip внутривенно (i.v.) через хвостовую вену. Контрольная группа получала 200 мкл раствора ФСБ. В определенные интервалы (3, 12, 24, 48 и 72 часа) после инъекции мышей умиротворяли и собирали образцы крови и тканей (печень, селезенка, почки, легкие, сердце и опухоль). Затем концентрацию доксорубицина в каждом образце измеряли по флуоресцентной интенсивности с помощью флуоресцентного спектрофотометра LS-45 (Perkin-Elmer, UK). Фармакокинетические параметры рассчитывали некомпартментальным анализом профилей концентрации в крови во времени. Вычисляли площадь под кривой концентрация-время (AUC), площадь под кривой первого момента (AUMC), полупериод выведения (t_1/2), объем распределения (V_d), C_max, T_max, среднее время пребывания (MRT) и клиренс (Cl).

In vivo антиопухолевая активность

Для оценки антиопухолевой активности, через 10 дней после инокуляции, мышам с пальпируемыми опухолями вводили одиночную i.v. дозу 10 мг/кг Caelyx® и ED-lip. Мыши, получившие ФСБ, служили негативным контролем. Определяли параметры: время до достижения конечной точки (TTE), процент задержки роста опухоли (TGD), медианное время выживания (MST) и выживание. В течение исследования наблюдали за здоровьем и изменением массы тела мышей. Объем опухоли измеряли цифровым штангенциркулем и рассчитывали по формуле:

$$ \mathrm{Объем}\ \mathrm{опухоли}=(\mathrm{Высота}\times \mathrm{Длина}\times \mathrm{Ширина})\times 0.52 $$

С учетом этических аспектов, мышей исключали из исследования, если рост опухоли > 1000 мм³, потеря массы > 20% или наблюдались признаки слабости.

Статистический анализ

Данные анализировали с помощью GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, CA, США). Данные представлены как среднее ± SEM по крайней мере трех независимых экспериментов. t-критерий Стьюдента использовали для оценки результатов исследования освобождения, флюориметрии и биодистрибуции формулировок. ANOVA применяли для оценки результатов флуоресцентной микроскопии и объемов опухолей. Метод Каплана-Мейера использовали для расчета параметров выживания: TTE, MST и TGD%. P < 0.05 считалось статистически значимым.