Биосовместимые наночастицы как платформа для повышения противоопухолевой эффективности комбинации цисплатин-тетрадрин

Введение

С развитием комплексной терапии опухолей соединения платины играют важную роль в лечении различных онкологических заболеваний, среди которых в клинике широко применяется цисплатин (ЦДДП) [1, 2]. В настоящее время CDDP по-прежнему играет важную роль в сочетании с иммунотерапией опухолей, показывая благоприятный эффект на злокачественные опухоли, такие как немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) [3]. Однако эти химиотерапевтические агенты всегда достигают противоопухолевой активности за счет нежелательной токсичности [4], поэтому терапевтические агенты, которые могут снизить токсичность и повысить эффективность химиотерапии, постоянно исследуются [5, 6]. Тетрандрин (Tet) является членом бис-бензилизохинолинового алкалоида [7], демонстрируя удовлетворительный эффект сенсибилизации к химиотерапии. Наша предыдущая работа продемонстрировала, что комбинация Tet и CDDP действительно обладает выраженной синергической противоопухолевой активностью за счет ингибирования экспрессии генов, связанных с химиотерапевтическими агентами, включая эксцизионную репарацию кросс-комплементационной группы 1 (ERCC1), тимидилатсинтазу (TS), β- тубулин III и др. [8]. Однако клиническое применение Tet страдает его плохой растворимостью в воде и низкой биодоступностью при приеме внутрь [7]. Более того, гидрофильный CDDP наиболее легко распределяется во внеклеточном матриксе (ECM), в то время как гидрофобный Tet, проникающий через липидные мембраны, может переноситься через клетки, поэтому два препарата не могут работать вместе. Следовательно, важно найти способ, который может эффективно доставлять два препарата одновременно, улучшая противоопухолевый эффект с уменьшением побочных эффектов.

Последние достижения в области нанотехнологий позволяют использовать новые подходы к диагностике и лечению рака [9, 10]. Наночастицы (НЧ), сконструированные из амфифильных сополимеров, особенно полиэтиленгликоля (ПЭГ), известны своей способностью снижать адгезию сывороточного белка и предотвращать поглощение ретикулоэндотелиальной системой (RES) [11]. Если они используются для переноса гидрофобных лекарств, наноносители тактично увеличивают растворимость и продлевают, а также увеличивают нахождение лекарства в кровообращении и опухоли [12]. С клиническим применением сополимерных НЧ биосовместимость НЧ привлекает все большее внимание. Например, недавние открытия показали, что некоторые введенные наночастицы диоксида титана, диоксида кремния и золота ускоряют интравазацию и экстравазацию раковых клеток на животных моделях [13]. НЧ, полученные из наноматериалов с хорошей биосовместимостью и безопасностью, особенно одобренные FDA, являются лучшими кандидатами в качестве носителей лекарственных средств.

Предварительно нам удалось сконструировать НЧ, нагруженные CDDP [14, 15], и НЧ, нагруженные Tet, с использованием полиэтиленгликоль-поли (капролактон) (PCL-PEG) [16], противоопухолевые эффекты которых были продемонстрированы in vivo. В этом исследовании мы использовали PEG-PCL для совместной доставки CDDP и Tet. Обладая почти нейтральным зарядом, ПЭГ образует гидрофильную оболочку наночастицы, которая скрывает антигенные эпитопы и предотвращает иммунологические реакции [14]. Изображения с флуоресцентного микроскопа продемонстрировали, что клетка может поглощать как гидрофильные, так и гидрофобные агенты, доставляемые НЧ. Результаты исследований in vitro не только на различных линиях опухолевых клеток, но и на опухолевых тканях показали, что НЧ CDDP-Tet ингибируют рост опухоли более эффективно, чем свободные лекарственные средства. При исследовании in vivo в группе НП наблюдались повышенная противоопухолевая эффективность и уменьшение побочных эффектов. Кроме того, ¹⁸ Визуализация FDG-PET / CT показала самую низкую скорость метаболизма опухоли в группе НЧ и, таким образом, указав на способность НЧ CDDP-Tet задерживать рост опухоли.

Методы

Материалы

Реагенты и клетки

CDDP (молекулярная формула PtCl ₂ (NH ₃ ) ₂ ) был приобретен у Shandong Boyuan Pharmaceutical Co. Ltd. (Цзинань, Китай) [15]. Тетрандрин (молекулярная формула C ₃₈ H ₄₂ N ₂ О ₆ ) был получен в виде порошка чистотой> 98% от Jiangxi Yibo Pharmaceutical Development Company (Цзянси, Китай) [16]. Метоксиполиэтиленгликоль [MePEG; Средневесовую молекулярную массу (Mw =4 кДа; Nanjing Well Chemical Co. Ltd. China) дегидратировали азеотропной перегонкой с толуолом, а затем сушили в вакууме при 50 ° C в течение 12 ч перед использованием. ε-Капролактон (ε-CL; Aldrich , США) очищали сушкой над CaH ₂ при комнатной температуре с последующей перегонкой при пониженном давлении. Поливиниловый спирт (ПВС; степень полимеризации =500, степень алкоголизации =88%; Shanghai Dongcang International Trading Co. Ltd., Китай) и октоат двухвалентного олова (молекулярная формула SnCl2) (Sigma) использовали в полученном виде. Среду RPMI 1640 (Gibco, США), сыворотку крови теленка (Lanzhou Minhai Bioengineering, Китай) и диметилтиазолибромид 2,5-дифенилтетразолия (MTT; Amersco, США) использовали в полученном виде.

Линия хорошо дифференцированных клеток рака желудка человека MKN ₂₈ , линия клеток колоректальной аденокарциномы человека LoVo, линия клеток рака шейки матки человека Hela и линия клеток гепатомы мыши H ₂₂ были получены из Шанхайского института клеточной биологии (Шанхай, Китай). Все клеточные линии размножали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% бычьей сыворотки, пенициллина (100 Ед / мл), стрептомицина (100 г / мл), пирувата, глутамина и инсулина при 37 ° C в водонасыщенной атмосфере с 5% CO ₂ .

Синтез сополимеров

Как описано ранее [16, 17], сополимеры мПЭГ – ПКЛ и НО-ПКЛ были синтезированы сополимеризацией с раскрытием цикла. Вкратце, заранее определенное количество ε-CL добавляли в пробирку для полимеризации, содержащую PEG и небольшое количество октоата двухвалентного олова (0,1% мас. / Мас.). Затем трубку подсоединяли к вакуумной системе, герметично закрывали и помещали в масляную баню при 130 ° C на 48 часов. Для синтеза сополимеров HO-PCL заданное количество ε-CL и октоата двухвалентного олова добавляли в полимеризационную трубку без сушки. После завершения полимеризации неочищенные сополимеры растворяли с хлороформом и осаждали в избыточном количестве холодного метанола для удаления непрореагировавшего мономера и олигомера. Затем осадки фильтровали и несколько раз промывали водой перед тщательной сушкой при пониженном давлении.

Приготовление наночастиц с полной загрузкой CDDP

Предварительно определенное количество наночастиц, нагруженных CDDP и Tet, было приготовлено методом двойной эмульсии (DE) [14, 18]. CDDP и Tet эмульгировали с 1 мл раствора дихлорметана (DCM), содержащего 5 мг mPEG-PCL и 15 мг HO-PCL, обработкой ультразвуком в течение 15 с (15 Вт) на ледяной бане (раствор W1). Затем добавляли 4 мл 3% (мас. / Об.) Раствора ПВС W2 и обрабатывали ультразвуком в течение 30 с для получения эмульсии W1 / O / W2. Двойную эмульсию разбавляли 50 мл 0,3% (мас. / Об.) Водного раствора ПВС и DCM выпаривали в вакууме. Полученные наночастицы были собраны, промыты и высушены вымораживанием (рис. 1).

Схема получения НЧ CDDP-Tet

Контент для загрузки лекарств и эффективность инкапсуляции

Для определения содержания загруженного лекарственного средства лиофилизированный порошок НП с CDDP-Tet растворяли в диметилформамиде (ДМФ) и 30 л этого раствора смешивали с 30 л 2 ммоль / л HCl с последующим добавлением 2,94 мл 0,2 ммоль / л SnCl ₂ раствор в 2 ммоль / л HCl. Поглощение при 403 нм измеряли через 1 ч по калибровочной кривой с использованием спектрофотометра Shimadzu UV-1205 (Киото, Япония). Затем можно было рассчитать общее количество лекарства в NP. Содержание загрузки лекарственного средства и эффективность инкапсуляции, соответственно, были получены по формулам. (1) и (2):

Цитотоксичность наночастиц in vitro и исследование биосовместимости

Исследования сотовой связи

На основании нашей предыдущей работы [15], клетки LoVo были помещены на покрытие 6-пористой пластины с размером примерно 5 × 10 ⁵ клетки каждой поры и инкубировали в течение 24 ч (37 ° C, 5% CO ₂ ). В поры добавляли НЧ с родамином B (21 мкг / мл). После инкубации в течение 2 ч паштет промывали PBS при 4 и 37 ° C по 3–4 раза каждый. Затем клетки LoVo на покровных стеклах подвергали флуоресцентному микроскопу.

Анализ цитотоксичности

Цитотоксичность препаратов in vitro определялась стандартными анализами МТТ с использованием MKN28 и H ₂₂ Сотовые линии. Вкратце, клетки высевали в 96-луночный планшет при плотности 5000 клеток на лунку за 24 ч до анализа. Затем клетки подвергали воздействию серии доз свободного CDDP, свободного Tet, свободного CDDP плюс Tet и наночастиц, нагруженных CDDP-Tet. После инкубации в каждую лунку добавляли 20 мкл раствора МТТ с концентрацией 5 мг / мл и планшет инкубировали в течение 4 ч, позволяя жизнеспособным клеткам трансформировать желтый МТТ в темно-синие кристаллы формазана, которые растворяли в 200 мкл диметилового эфира. сульфоксид (ДМСО). Оптическую плотность (OD) каждой лунки измеряли с помощью ридера ELISA (ELX800 Biotek, США) с использованием тестовой и эталонной длин волн 490 и 630 нм соответственно. Жизнеспособность клеток определяли по следующей формуле:

Совместимость холостых наночастиц in vitro также определялась с помощью тестов МТТ с использованием MKN ₂₈ и H ₂₂ Сотовые линии. Все результаты, полученные при анализе МТТ, были подтверждены повторением эксперимента как минимум в трех независимых случаях и трехкратным тестированием каждый раз.

Анализ апоптоза

Набор Annexin V-FITC (Bender MedSystem, США) был принят для изучения изменения скорости апоптоза клеток. МКН ₂₈ клетки помещали в культуральную чашку диаметром 6 см в течение 24 часов. Культуральные среды были заменены на 1 мкг / мл свободного CDDP, 1 мкг / мл загруженных CDDP НЧ и 200 мкг / мл холостых НП соответственно. Контрольную группу заменили питательными средами без лекарств. Фермент добавляли через 48 часов культивирования. Затем клетки собирали, 2 раза промывали PBS и ресуспендировали в 100 мкл буфера. Добавляли по очереди 5 мкл аннексина V и 1 мкл PI, перемешивали и выдерживали 15 мин при комнатной температуре без воздействия света. Добавляли 400 мл буфера и подвергали процессу FCM (BD FACS Canto TM, США) для анализа скорости апоптоза клеток.

Анализ реакции на лекарственные препараты (HDRA)

HDRA проводилась согласно нашим предыдущим исследованиям [14, 19]. Вкратце, самцам мышей ICR вводили подкожно в оба подмышечных пространства 4–6 × 10 ⁶ H ₂₂ клетки в физиологическом растворе. Когда опухоль достигла 400–600 мм ³ по объему мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков, отбирали образцы из свежих образцов, дважды промывали физиологическим раствором, погружали в раствор Хэнка и делили на куски весом приблизительно 15 мг. Образцы ткани помещали в 24-луночный планшет, в который квадратные желатиновые губки размером 1 см были погружены в среду RPMI 1640 с добавлением 20% фетальной телячьей сыворотки и сульфата амикацина (100 МЕ / мл), содержащего свободный CDDP или CDDP- загруженные НЧ в двух разных концентрациях. Четыре образца опухоли инкубировали без какого-либо лекарства в качестве контроля. Затем ткани культивировали в течение 7 дней при 37 ° C и 5% CO ₂ . . Добавляли смешанный раствор коллагеназы I типа (100 мкл, 0,6 мг / мл) и МТТ (100 мкл, 5 мг / мл) в 100 мг / мл сукцината натрия. После инкубации в течение еще 24 ч формазан МТТ экстрагировали 1 мл ДМСО, и 100 мкл раствора из каждой лунки переносили в лунки 96-луночного микропланшета. OD каждой лунки в микропланшете измеряли с использованием считывающего устройства для ELISA с тестовой и эталонной длинами волн 490 и 630 нм, соответственно. Жизнеспособность тканей рассчитывалась по следующей формуле (4):

Противоопухолевая эффективность in vivo

Измерение объема опухоли

Самцам мышей ICR весом от 18 до 20 г имплантировали клеточную линию мышиной гепатомы H ₂₂ и используется для оценки относительной эффективности НЧ, нагруженных CDDP-Tet. Выращивание мышей в условиях отсутствия определенных патогенов (SPF) проводили в соответствии с руководящими принципами, утвержденными Комитетом по уходу за животными больницы Drum Tower. 0,2 мл клеточной суспензии, содержащей 4–6 × 10 ⁶ H ₂₂ клетки вводили подкожно в левую подмышечную впадину мышей. Мыши были разделены на 6 групп:контрольная группа (физиологический раствор), группа холостых НП, группа свободного CDDP (3 мг / кг), группа свободного CDDP плюс Tet (CDDP 3 мг / кг + Tet 7,2 мг / кг) и группа CDDP- Группа НЧ, нагруженных Tet (CDDP 3 мг / кг + Tet 7,2 мг / кг). Каждая группа состояла из 6 мышей. Лечение начиналось через 7-8 дней после имплантации, и этот день был обозначен как «День 0». Каждое животное взвешивали во время лечения, чтобы дозировки могли быть скорректированы для достижения заявленных доз в мг / кг. В течение всего эксперимента животных также взвешивали через день.

Иммунофлуоресцентный анализ

Опухолевые ткани мышей в контрольной группе, которые получали свободный CDDP плюс Tet и CDDP-Tet NP, отбирали для гистологического наблюдения на 21-й день после обработки. Опухоли рассекали и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, обычно перерабатывали в парафин и делали срезы толщиной 5 мм. Срезы тканей наблюдали под конфокальным микроскопом Zeiss LSM510 Meta после того, как образцы были окрашены (40,6-диамидино-2-фенилиндолом) (DAPI, синий) и маркировкой концов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP (TUNEL, зеленый) [20] .

¹⁸ ФДГ-ПЭТ / КТ

Затем мышам из группы свободного CDDP плюс Tet и группы НЧ, нагруженных CDDP-Tet, на 6-й день после лечения получали изображения ПЭТ / КТ. Перед инъекцией изотопов проводилось 4-часовое голодание. 14,8 МБк (400 лКи) из ¹⁸ Ф-ФДГ вводили через хвостовую вену в качестве радиоактивного индикатора. Изображения были получены с помощью комбинированного сканера ПЭТ / КТ (Jemini JXL, Philips, США). ПЭТ-изображения с высоким разрешением и такое же поле КТ-изображения были получены у мышей через 45 минут после введения ¹⁸ Ф-ФДГ. ПЭТ-изображения были скорректированы на ослабление и разброс на основе данных КТ. Слияние изображений выполнялось автоматической системой слияния изображений с использованием программного обеспечения, поставляемого поставщиком. Максимальные значения поглощения ФДГ в опухоли были получены для расчетов стандартного значения поглощения (SUV) с поправками на массу тела и введенную активность.

Статистические методы

Статистический анализ данных проводился с использованием t Стьюдента. контрольная работа. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, а значения P <0,05 были приняты как статистически значимая разница.

Результаты

Синтез и характеристика сополимеров

Согласно нашему предыдущему исследованию, мы синтезировали НЧ с ПЭГ-ПКЛ и НО-ПКЛ (оптимальное соотношение 1:3) [14]. Диаметр, полидисперсность, среднечисловая молекулярная масса (Mn) и средневесовая молекулярная масса (Mw) оптимальных сополимерных наночастиц PEG-PCL показаны в дополнительном файле 1:Таблица S1. При загрузке CDDP и Tet также измеряли содержание загрузки лекарственного средства и эффективность инкапсуляции (дополнительный файл 1:таблица S2), которые аналогичны таковым для сополимерных NP PEG-PCL, загруженных CDDP. Однако содержание загрузки лекарственного средства и эффективность загрузки у Tet ниже, чем у загруженных Tet сополимерных наночастиц PEG – PCL, что может иметь какое-то отношение к компонентам HO-PCL.

Посредством динамического рассеяния света (DLS) диаметр сополимерных наночастиц ПЭГ-ПКЛ, нагруженных CDDP-Tet, составлял 359,1 ± 5,3 нм с полидисперсностью около 0,231. При наблюдении с помощью ПЭМ и АСМ (дополнительный файл 1:рис. S1a и S1b) НЧ имели правильную сферическую форму и аналогичные размеры, которые совпадали с данными DLS. Кроме того, в наночастицах диспергированы мелкие капли, что подтверждает, что наночастицы действительно представляют собой структуру двойной эмульсии.

Использование сотовыми сетями NPs с полной загрузкой CDDP

Загрузка частиц флуоресцентными красителями применялась в качестве обычного метода исследования клеточного поглощения, который реализует визуальное обнаружение и обнаружение в реальном времени. Мы продемонстрировали, что насыщенные красителем НЧ могут проникать в клетки посредством эндоцитоза. В этом исследовании родамин-B является гидрофильным и может быть обнаружен в канале флуоресценции PI, который используется для моделирования CDDP. Как показано в моделировании Tet, кумарин-6 является гидрофобным, сигнал которого может приниматься по каналу флуоресценции FITC. После совместной инкубации с НЧ, нагруженными кумарином-6 и родамином-B в течение 2 часов, клетки LoVo детектировали с помощью флуоресцентной микроскопии и оптической линзы (200 ×). Как видно на рис. 2, сигналы флуоресценции могут быть обнаружены в канале флуоресценции PI, канале флуоресценции FITC, а также в канале двойной флуоресценции PI / FITC. Результаты подтвердили, что НЧ могут переносить кумарин-6 и родамин-B в опухолевые клетки одновременно, на основании чего мы можем сделать вывод, что CDDP и Tet могут загружаться в НЧ и поглощаться опухолевыми клетками одновременно.>

Фотографии клеток LoVo после 2 часов окрашивания НЧ, нагруженных родамином B и кумарином-6 (200 ×; полоса:50 мкм). а Морфология клеток под световой микроскопией, б морфология клеток под флуоресцентным микроскопом (канал флуоресценции PI), c морфология клеток под флуоресцентным микроскопом (канал флуоресценции FITC) и d морфология клеток под флуоресцентным микроскопом (двойной канал флуоресценции PI / FITC)

Цитотоксичность наночастиц in vitro

Цитотоксичность свободных CDDP, свободных Tet, свободных CDDP плюс Tet и НЧ, нагруженных CDDP-Tet, сравнивали в клеточной линии желудка MKN28. Концентрация Tet была в 2,4 раза больше, чем концентрация CDDP. Как показано на фиг. 3, цитотоксичность НЧ, нагруженных CDDP-Tet, была наиболее сильной среди четырех групп. Разница в цитотоксичности между группой свободного Tet и NPs и тремя другими группами свободных лекарственных средств стала заметной с увеличением концентрации. Подобные результаты наблюдались в клетках рака шейки матки человека Hela и клетках гепатоцеллюлярной карциномы H ₂₂ (Дополнительный файл 1:Рис. S2a, S2b).

Цитотоксичность наночастиц in vitro. а Жизнеспособность клеток MKN28 после совместного культивирования с лекарствами в течение 48 часов. Концентрация Tet была в 2,4 раза больше, чем концентрация CDDP. б Фотографии клеток MKN28 под световой микроскопией (200 ×) после совместного культивирования с лекарствами в течение 48 ч

Изучение токсичности холостых НЧ проводилось в нашей предыдущей работе. В предыдущем исследовании холостые НЧ имели низкую токсичность для линий опухолевых клеток, что указывало на то, что холостые НЧ обладают удовлетворительной биосовместимостью [14, 16].

Анализ апоптоза in vitro НЧ, загруженных CDDP-Tet

Мы измерили влияние 1 мкг / мл свободного CDDP, 2,4 мкг / мл свободного Tet, свободного CDDP плюс Tet (1 мкг / мл + 2,4 мкг / мл) и НЧ, нагруженных CDDP-Tet (1 мкг / мл + 2,4 мкг / мл) на скорость апоптоза клеток MKN28 после совместного культивирования в течение 48 часов. Скорость апоптоза клеток рассчитывали как Q2 + Q4 (показано на фиг. 4). Изменение скорости апоптоза клеток было сходным для групп со свободным CDDP плюс Tet, со свободным CDDP и со свободным Tet (рис. 4a-c). Однако скорость апоптоза клеток MKN28, индуцированная НЧ, нагруженными CDDP-Tet, была значительно выше, чем у трех других групп (рис. 4d).

Анализ апоптоза in vitro методом проточной цитометрии a бесплатный CDDP, b бесплатный Тет, c бесплатный CDDP + Tet и d НЧ CDDP-Tet

Анализ реакции на лекарственные препараты (HDRA)

Для более полной оценки противоопухолевой эффективности НЧ мы оценили противоопухолевые эффекты свободных CDDP, свободных CDDP плюс Tet и НЧ, нагруженных CDDP-Tet, на H ₂₂ клеточные линии с использованием HDRA. В качестве клинического метода для прогнозирования химиочувствительности HDRA более достоверно моделирует практическое состояние опухолевых тканей, чем цитологический эксперимент [19], на результаты которого могут влиять микросреда и микроструктура опухолевой ткани, такие как проникновение лекарственного средства, значения внеклеточного pH, интерстициальный давление жидкости и т. д.

Концентрация Tet в 2,4 раза больше, чем концентрация CDDP. Как показано на фиг. 5, при самой низкой концентрации противоопухолевый эффект группы свободного CDDP и Tet был лучше, чем у CDDP, но эффекты были аналогичными при увеличении концентрации лекарственного средства. Согласно анализу апоптоза, НЧ, нагруженные CDDP-Tet, имели значительно лучший противоопухолевый эффект среди трех групп при всех испытанных концентрациях.

Тест гистокультуры на лекарственный препарат

Анализ противоопухолевой эффективности in vivo

Оценка эффективности и побочных эффектов

Мышиные модели, образованные H ₂₂ приживление клеточной линии обрабатывали 3 мг / кг свободного CDDP, свободного CDDP вместе с Tet (CDDP 3 мг / кг + Tet 7,2 мг / кг), НЧ, нагруженных CDDP-Tet (CDDP 3 мг / кг + Tet 7,2 мг / кг). кг) соответственно. Опухоли были получены через 12 дней после лечения препаратом. Размеры опухоли определяли каждые 2 дня, чтобы определить наиболее оптимальную доставку лекарственного средства. Как показано на кривой роста опухоли (фиг. 6), тенденция роста опухоли в контрольной группе, а также в группе с пустыми наночастицами была сходной, но в трех других группах с доставкой лекарства наблюдалось заметное ингибирование опухоли. По сравнению с группой свободного CDDP, группа свободного CDDP плюс Tet показала лучшую противоопухолевую эффективность в течение первых 6 дней. Однако через 6 дней разница в степени ингибирования опухоли между двумя группами начала сужаться, и через 10 дней свободный CDDP плюс Tet оказал еще более худшее противоопухолевое действие.

Объем опухоли установленного H ₂₂ ксенотрансплантаты у мышей ICR во время терапии при различных режимах лечения. В день 0 мышей лечили разными стратегиями, как показано на рисунке:3 мг / кг свободного CDDP, свободного CDDP вместе с Tet (CDDP 3 мг / кг + Tet 7,2 мг / кг) и НЧ, нагруженных CDDP-Tet ( CDDP 3 мг / кг + Tet 7,2 мг / кг) соответственно. Среднее ± SD ( n =6) каждой группы

В течение первых 6 дней противоопухолевые эффекты групп NP, содержащих свободный CDDP плюс Tet и CDDP, нагруженные Tet, были сходными. Следовательно, мыши, получавшие НЧ, нагруженные CDDP-Tet, показали лучшую противоопухолевую эффективность с 6 дня после лечения. Дополнительный файл 1. На рисунке S3a показаны опухоли разных размеров для каждой группы. Объем опухоли в группе НЧ, нагруженных CDDP-Tet, был наименьшим, что можно рассматривать как прямое отражение выраженного противоопухолевого эффекта. В дополнение к способности ингибировать опухоль, по сравнению с группой свободного CDDP или свободного CDDP плюс Tet, было меньше кровеносных сосудов, расположенных на поверхности опухоли). Точно так же, как показано в Дополнительном файле 1:Рисунок S3b, плотность сосудов была самой низкой в ​​группе NP по сравнению с контрольной группой и группой со свободным CDDP плюс Tet.

Для дальнейшего изучения соотношения апоптотических клеток в опухолевой ткани in vivo был проведен анализ TUNEL для обнаружения апоптотических клеток. Как показано на фиг. 7, апоптотические клетки в опухолях могут быть окрашены зеленой флуоресценцией, чтобы указать на апоптоз. Объединенные изображения показывают меньшее количество зеленых флуоресцентных областей в контрольной группе и группе Free CDDP плюс Tet, что указывает на присутствие меньшего количества апоптотических клеток. Более того, большое количество зеленых флуоресцентных областей наблюдалось в группе, обработанной НЧ CDDP-Tet, что указывает на большое количество апоптотических клеток. Результаты подтвердили, что НЧ CDDP-Tet могут способствовать апоптозу опухоли in vivo.

Апоптотические клетки были обнаружены с помощью анализа TUNEL (зеленый) и совместно окрашены ядерным окрашиванием DAPI (синий)

В дополнение к лучшей противоопухолевой эффективности, чем группа со свободным CDDP и свободным CDDP плюс Tet, НП, нагруженные CDDP-Tet, также проявляли меньше побочных эффектов. Как показано на фиг. 8a, свободный CDDP и свободный CDDP плюс Tet вызвали значительную потерю веса по сравнению с контрольной группой, что указывает на токсичность при прямой доставке лекарственного средства. Кривая изменения веса пустой группы НЧ была аналогична кривой для контрольной группы, предполагая, что токсичность холостых НЧ можно не принимать во внимание. Потеря веса, вызванная НЧ, нагруженными CDDP-Tet, и контрольной группой была сопоставима в течение первых 6 дней. С 6 по 12 день уровни веса мышей в группе NP были немного ниже, чем в контрольной группе, но были выше, чем в группе со свободным CDDP или свободным CDDP плюс Tet. Примечательно, что группа свободного CDDP плюс Tet способствовала очевидной потере веса и уменьшала аппетит мышей в течение первых 4 дней, что указывает на то, что абсорбция лекарств была вредной для всего организма. Напротив, НЧ, нагруженные CDDP-Tet, могут медленно высвобождаться в тканях и поддерживать концентрацию в стабильной степени; таким образом, побочные эффекты были явно снижены по сравнению с прямой доставкой лекарства. Затем побочные эффекты лечения также оценивали с помощью биопсии печени (рис. 8b). По сравнению с контрольной группой, граница между клетками печени группы двойного лекарственного препарата без покрытия размыта, некоторые клетки печени имеют раздутые изменения, тела клеток сокращаются, ядерный пикноз и повышенная эозинофилия (желтая стрелка), в то время как в группе двойного лекарственного средства группа наночастиц. Структура стволовых клеток в норме, межклеточное пространство чистое, явных патологических изменений нет. Эти результаты свидетельствуют о незначительном ухудшении качества, вызванном доставкой NP.

Оценка побочных эффектов a масса тела установленная H ₂₂ ксенотрансплантаты у мышей ICR во время терапии при различных режимах лечения. б Образцы печени, окрашенные HE, были исследованы под световым микроскопом (400 ×)

ПЭТ – КТ

Чтобы лучше сравнить терапевтический эффект in vivo в каждой группе, мышам выполняли компьютерную томографию, ПЭТ / КТ на 6-й день после лечения. Объединенные изображения КТ и ПЭТ показаны на рис. 9. ПЭТ / КТ - это эффективный метод отражения метаболических изменений через ¹⁸ Обнаружение поглощения ФДГ [21]. Как показано на КТ (фиг.9), объем опухоли в группе свободного CDDP плюс Tet и группы НЧ, нагруженных CDDP-Tet, был сопоставим (фиг.9a), но скорость метаболизма опухоли в группе свободного CDDP плюс Tet была значительно выше, чем в группе свободных CDDP плюс Tet. NPs group (Fig. 9b). The decreased intensity at the tumor site of the murine received CDDP-Tet-loaded NPs symbolized poor metabolism rate of the tumor, and thereby indicating the capability of NPs to retard tumor growth.

Male ICR mice bearing a subcutaneous H₂₂ tumor at the left axillary (arrows). CT, PET and fused PET/CT images are arranged in the figure from left to right. Tumor metabolic rate in free CDDP plus Tet group (blue arrow) was significantly higher than NPs group (yellow arrow)

Обсуждение

Considering the heterogeneity and complexity of tumor, combination therapy has become a standard strategy in the clinical treatment of tumor [22]. Nevertheless, simple combination of two individual therapeutics can't necessarily reach anticipated effect because of the different physicochemical and pharmacokinetic properties of the two drugs [23]. To deliver different drugs to tumor cells in a synergistic ratio, a combination therapy vehicle has been designed in this study. CDDP is hydrophilic while Tet is hydrophobic, which cause problems for the loading method. In this study, we used the amphiphilic copolymer with PCL as the hydrophobic core and PEG as the hydrophilic corona [14]. By the improved double emulsion method, Tet located in the oil layer and CDDP located in the water layer, the unique structure imparts the NPs with the capacity to simultaneous encapsulation of Tet and CDDP to form NPs. CDDP and Tet are located in different layers of NPs, resulting in low interfering effect and high stability [24].

The combination therapy vehicle loaded with CDDP and Tet can enhance the efficacy of CDDP-Tet combination. Not only in the cellular experiments, CDDP-Tet NPs also significantly inhibit tumor tissue viabilities in the HDRA assays, validating the anti-tumor effect of the NPs in the model which take into account of tumor microenvironment [19]. As to in vivo study, antitumor efficacy was observed in tumor volume change, which demonstrated that CDDP-Tet NPs effectively suppressed tumor growth with lower proliferation level. ¹⁸ FDG-PET/CT imaging revealed that the glucose metabolism of the tumors in the CDDP-Tet group was inhibited more prominently and early by inducing higher apoptosis level of tumors, which was confirmed in the immunofluorescence assays [21]. Compared with free CDDP plus Tet, CDDP-Tet NPs are faster and safer to take effect, which can be explained by the three mechanisms as follows.

Firstly, as a lipid-soluble drug, Tet can hardly distribute in the ECM and therefore rarely diffuse around tumor cells [9]. Located in the oil phase of NPs, Tet is endowed with better solubility and bioavailability, reaching the tumor sites in the same synergistic ratio as CDDP. Furthermore, CDDP, which used to have systemic side effect, once carried by the nanoparticle, can easily reach the interstitium of tumor tissues from leaky tumor blood vessels and be held within the tumor on account of pressure made by destitute lymphatic drainage [25]. The more CDDP tumor tissues hold, the less damage will be done to normal organs. As a result of passive targeting strategies, CDDP-Tet NPs are much safer than free CDDP plus Tet, which can be observed in the murine body weight changes and liver biopsies.

Drug resistance is regarded as one of the greatest challenges in cancer treatment, not only because of genetic changes at the level of a single cell, but also due to tumor tissues and microenvironment [26]. On one hand, Tet is alkaline, so it will be protonated in the acidic tumor microenvironment and thus can’t cross the electronegative tumor cytomembranes, which is called pH-induced physiological drug resistance [27]. On the other hand, large distances between blood vessels in solid tumors and high interstitial fluid pressure contribute to limited distribution of CDDP and Tet [28]. Carried by the nanovehicle, Tet can enter tumor cells via endocytosis without influence of tumor microenvironment, overcoming the pH-induced physiological drug resistance. The small size of nanocarriers allows them to enter tumor vasculature and preferentially accumulating at the tumor site in vivo [29, 30].

In summary, this study represents an example of delivering a chemotherapeutic drug along with a chemosensitizer simultaneously. Carried by the NPs, both drugs are targeted to tumor site passively, reducing systemic toxicity. Besides, NPs offer a solution to physiological drug resistance by helping the chemosensitizer enter tumor cells more and faster, which play an important role in improving the efficacy of tumor chemotherapy. Therefore, we believed that this PEG–PCL block copolymeric NPs could be a promising carrier for combined chemotherapy.

Conclusions

Based on our previous studies [8, 14, 16], this paper investigated the application of PEG–PCL/HO-PCL NPs for delivery of the combination of two drugs with different physicochemical properties. For in vitro studies, NPs exhibited superior antitumor effect with great biocompatibility. Enhanced antitumor efficacy was observed in tumor volume change and ¹⁸ FDG-PET/CT Imaging as to in vivo study in murine model. The mice in NPs group also exhibited reduced side effects. Additionally, the apoptosis rate of tumor cells was promoted by NPs in both in vitro and in vivo studies. In summary, this block copolymeric NPs could be a promising carrier for the delivery of Cisplatin–Tetradrine combinations and other combinations, with enhanced antitumor effect and reduced toxicity, for the treatment of cancer.

Доступность данных и материалов

The datasets used and/or analysed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

Сокращения

Tet:

Tetradrine

CDDP:

Cisplatin

NP:

Наночастицы

PEG–PCL:

Poly(ethyleneglycol)–polycaprolactone

HO-PCL:

Polycarprolactone

ECM:

Extracellular matrix

PEG:

Полиэтиленгликоль

RES:

Reticuloendothelial system

DMF:

Диметилформамид

SPF:

Отсутствие специфических патогенов

Mn:

Среднечисленная молекулярная масса

Mw:

Средневесовая молекулярная масса

DLS:

Динамическое рассеяние света