Повышение антиопухолевой эффективности терапии цисплатин-тетрадрин через биосовместимую наночастичную доставку

Аннотация

Комбинированная терапия была стандартной стратегией в клинической лечебной практике опухолей. Мы продемонстрировали, что комбинация тетрадрина (Tet) и цисплатина (CDDP) демонстрирует выраженную синергистическую антиопухолевую активность, но неизбежные побочные эффекты ограничивают их терапевтическую концентрацию. Учитывая различные физикохимические и фармакокинетические свойства двух препаратов, мы загрузили их вместе в наноносой улучшенным методом двойной эмульсии. Наночастицы (НЧ) приготовляли из смеси поли(этиленгликол)–поликапролактона (PEG–PCL) и поликапролактона (HO-PCL), поэтому CDDP и Tet могут быть локализованы в НЧ одновременно, что приводит к низкому интерференционному эффекту и высокой стабильности. Изображения флуоресцентного микроскопа раскрыли клеточное поглощение как гидрофильных, так и гидрофобных агентов, доставленных НЧ. In vitro исследования на различных опухолевых клеточных линиях и опухолевых тканях раскрыли увеличенные скорости ингибирования опухоли и апоптоза. Что касается in vivo исследований, превосходная антиопухолевая эффективность и сниженные побочные эффекты наблюдались в группе НЧ. Более того, ¹⁸FDG-PET/CT визуализация продемонстрировала, что НЧ более выраженно снижали метаболическую активность опухолей. Наши результаты предполагают, что блок-кополимерные НЧ PEG–PCL могут быть перспективным носителем для комбинированной химиотерапии с надежной эффективностью и незначительными побочными эффектами.

Введение

С развитием комплексной терапии опухолей платиновые соединения играют важную роль в лечении различных раков, среди которых цисплатин (CDDP) широко используется в клинике [1, 2]. В настоящее время CDDP все еще значим при комбинировании с опухолевой иммунотерапией, показывая благоприятный эффект на злокачественные опухоли, такие как неклеточный рак легкого (НКРЛ) [3]. Однако эти химиотерапевтические агенты всегда достигают антиопухолевой активности ценой нежелательной токсичности [4], поэтому терапевтические агенты, которые могут снизить токсичность и усилить эффективность химиотерапии, неуклонно исследуются [5, 6]. Тетрадрин (Tet) является членом бис-бензилизохинолинового алкалоида [7], демонстрируя удовлетворительный эффект в сенсибилизации к химиотерапии. Наша предыдущая работа продемонстрировала, что комбинация Tet и CDDP действительно имеет выраженную синергистическую антиопухолевую активность путем ингибирования экспрессии генов, ассоциированных с химиотерапевтическими агентами, включая группу эксцизионного восстановления перекрестной комплементации 1 (ERCC1), Тимидилат Синтазу (TS), β-тюбулин III и т.д. [8]. Однако клиническое применение Tet страдает от его плохой водорастворимости и низкой оральной биодоступности [7]. Более того, гидрофильный CDDP наиболее легко распределяется во внеклеточной матрице (ВКМ), в то время как гидрофобный Tet проникает липидные мембраны и может транспортироваться через клетки, поэтому два препарата не могут действительно работать вместе. Поэтому необходимо найти способ, который может эффективно доставлять два препарата одновременно, улучшая антинеопластический эффект со сниженными побочными эффектами.

Недавние достижения в области нанотехнологий управляют новыми подходами для диагностики и лечения рака [9, 10]. Наночастицы (НЧ), построенные с амфифильными кополимерами, особенно полиэтиленгликолем (PEG), известны своими способностями снижать адгезию сывороточного белка и предотвращать поглощение ретикулоэндотелиальной системой (RES) [11]. Если используются для переноса гидрофобных препаратов, наноносоители увеличивают растворимость тактично и продлевают, а также увеличивают пребывание препарата в кровяном течении и опухоли [12]. С клиническим использованием кополимерных НЧ, биосовместимость НЧ привлекает все больше внимания. Например, недавние находки раскрыли, что некоторые инъецируемые диоксид титана, кремнезем и золотые наночастицы ускоряют интравазацию и экстравазацию раковых клеток в животных моделях [13]. НЧ, приготовленные из наноматериалов с хорошей биосовместимостью и безопасностью, особенно одобренных FDA, являются лучшими кандидатами для носителей препаратов.

Предварительно мы умудрились построить CDDP-загруженные НЧ [14, 15] и Tet-загруженные НЧ с использованием полиэтиленгликол-поли(капролактон) (PCL–PEG) [16], чьи in vivo антиопухолевые эффекты оба были продемонстрированы. В данном исследовании мы использовали PEG-PCL для ко-доставки CDDP и Tet. С близким к нейтральному зарядом PEG формирует гидрофильную оболочку наночастицы, которая маскирует антигенные эпитопы и предотвращает иммунологическую реакцию [14]. Изображения флуоресцентного микроскопа продемонстрировали, что клетки могут поглощать как гидрофильные, так и гидрофобные агенты, доставленные НЧ. Результаты in vitro исследований не только на различных опухолевых клеточных линиях, но и на опухолевых тканях раскрыли, что CDDP-Tet НЧ ингибируют рост опухоли более эффективно, чем свободные препараты. Когда исследовано in vivo, увеличенная антиопухолевая эффективность и уменьшенные побочные эффекты наблюдались в группе НЧ. Более того, ¹⁸FDG-PET/CT визуализация показала наименьший уровень метаболизма опухоли в группе НЧ, и тем самым указывая на способность CDDP-Tet НЧ задерживать рост опухоли.

Методы

Материалы

Реактивы и клетки

CDDP (молекулярная формула PtCl₂(NH₃)₂) покупали у Shandong Boyuan Pharmaceutical Co. Ltd. (Цзинань, Китай) [15]. Тетрадрин (молекулярная формула C₃₈H₄₂N₂O₆) получали в виде порошка с чистотой > 98% от Jiangxi Yibo Pharmaceutical Development Company (Цзяньси, Китай) [16]. Метоксиполиэтиленгликол [MePEG; средняя молекулярная масса по весу (Mw = 4 кДа; Nanjing Well Chemical Co. Ltd. Китай] обезвоживали азеотропной дистилляцией с толуолом и затем вакуумно сушили при 50 °C 12 ч перед использованием. ε-Капролактон (ε-CL; Aldrich, США) очищали сушкой над CaH₂ при комнатной температуре с последующей дистилляцией под сниженным давлением. Поливиниловый спирт (PVA; степень полимеризации = 500, степень алкоголизации = 88%; Shanghai Dongcang International Trading Co. Ltd., Китай) и октат стаन्नозный (молекулярная формула SnCl₂) (Sigma) использовали как полученные. RPMI 1640 среда (Gibco, США), телячья сыворотка (Lanzhou Minhai Bioengineering, Китай), и диметилтиазолил-2,5-дифенилтетразолиевый бромид (MTT; Amersco, США) использовали как полученные.

Человеческая хорошо дифференцированная клеточная линия желудочного рака MKN₂₈, человеческая клеточная линия колоректального аденокарциномы LoVo, человеческая клеточная линия цервикального рака Hela, и мышиная клеточная линия гепатомы H₂₂ получали от Шанхайского института клеточной биологии (Шанхай, Китай). Все клеточные линии размножали в среде RPMI 1640, дополненной 10% бычьей сывороткой, пенициллином (100 Ед/мл)-стрептомицином (100 г/мл), пируватом, глутамином и инсулином при 37 °C в водонасыщенной атмосфере с 5% CO₂.

Синтез кополимеров

Как мы описали ранее [16, 17], mPEG–PCL и HO-PCL кополимеры синтезировали методом кольцевого открытия кополимеризации. Кратко, предопределенное количество ε-CL добавляли в полимеризационную трубку, содержащую PEG и небольшое количество октата стаन्नозного (0,1% м/м). Трубку затем подключали к вакуумной системе, герметизировали и помещали в масляную баню при 130 °C на 48 ч. Для синтеза HO-PCL кополимеров предопределенное количество ε-CL и октат стаन्नозный добавляли в полимеризационную трубку без сушки. После завершения полимеризации сырые кополимеры растворяли хлороформом и выпадали в избыток холодного метанола для удаления нереагированного мономера и олигомера. Осадки затем фильтровали и промывали водой несколько раз перед тщательной сушкой под сниженным давлением.

Приготовление CDDP-Tet загруженных наночастиц

Предопределенное количество CDDP и Tet загруженных наночастиц приготовляли методом двойной эмульсии (DE) [14, 18]. CDDP и Tet эмульгировали с 1 мл дихлорметана (DCM) раствора, содержащего 5 мг mPEG–PCL и 15 мг HO-PCL, ультразвуком 15 с (15 Вт) в ледяной бане (раствор W1). Затем 4 мл 3% (м/об) PVA раствора W2 добавляли и ультразвуком 30 с для получения W1/O/W2 эмульсии. Двойная эмульсия разбавляли в 50 мл 0,3% (м/об) водного раствора PVA и DCM испаряли под вакуумом. Полученные наночастицы собирали, промывали и сушили сублимацией (Рис. 1).

Содержание загруженного препарата и эффективность инкапсуляции

Для определения содержания загруженного препарата, сублимированный CDDP-Tet загруженный НЧ порошок растворяли в диметилформамиде (DMF), и 30 л этого раствора смешивали с 30 л 2 ммоль/л HCl с последующим добавлением 2,94 мл 0,2 ммоль/л раствора SnCl₂ в 2 ммоль/л HCl. Абсорбция при 403 нм измерялась через 1 ч с отсылкой к калибровочной кривой с использованием спектрофотометра Shimadzu UV-1205 (Киото, Япония). Общее количество препарата в НЧ могло быть тогда рассчитано. Содержание загруженного препарата и эффективность инкапсуляции соответственно получали уравнениями (1) и (2):

Содержание загруженного препарата (%) = (Вес препарата в наночастицах) / (Вес наночастиц) × 100%

Эффективность инкапсуляции (%) = (Вес препарата в наночастицах) / (Вес загружаемого препарата) × 100%

In vitro цитотоксичность наночастиц и исследование биосовместимости

Исследования клеточного поглощения

На основе нашей предыдущей работы [15], клетки LoVo помещали на крышку 6-колбовой пластины примерно по 5 × 10⁵ клеток каждая колба и инкубировали 24 ч (37 °C, 5% CO₂). НЧ с родамином B (21 мкг/мл) добавляли в колбы. После инкубации 2 ч пластина промывалась 4 °C и 37 °C PBS 3–4 раза каждая. Клетки LoVo на стеклянных пластинках затем подвергали флуоресцентному микроскопу.

Цитотоксичность анализ

In vitro цитотоксичность препаратов определяли стандартными MTT анализами с использованием клеточных линий MKN28 и H₂₂. Кратко, клетки посевали в 96-колбовой пластине с плотностью 5000 клеток на колбу 24 ч до анализа. Затем клетки подвергали серии доз свободного CDDP, свободного Tet, свободного CDDP плюс Tet и CDDP-Tet загруженных наночастиц. После инкубации 20 мкл 5 мг/мл раствора MTT добавляли в каждую колбу и пластину инкубировали 4 ч, позволяя жизнеспособным клеткам трансформировать желтый MTT в темно-синие формазановые кристаллы, которые растворяли в 200 мкл диметилсульфоксида (DMSO). Оптическая плотность (OD) каждой колбы измерялась ELISA считывателем (ELX800 Biotek, США) с тестовыми и референсными длинами волн 490 и 630 нм соответственно. Клеточная жизнеспособность определялась следующей формулой:

Клеточная жизнеспособность (%) = OD (тестовая колба) / OD (референсная колба) × 100%

In vitro совместимость пустых наночастиц также определялась MTT анализами с использованием клеточных линий MKN₂₈ и H₂₂. Все результаты, полученные из MTT анализов, подтверждались повторением эксперимента минимум на трех независимых случаях и тестированием в трипликате каждый раз.

Апоптоз анализ

Набор Annexin V-FITC (Bender MedSystem, США) принимали для изучения изменения скоростей клеточного апоптоза. Клетки MKN₂₈ подвергали 6 см культурной чашке 24 ч. Культурные среды заменяли 1 мкг/мл свободным CDDP, 1 мкг/мл CDDP загруженными НЧ и 200 мкг/мл пустыми НЧ соответственно. Контрольная группа заменялась культурной средой без препаратов. Фермент добавляли после 48 ч культуры. Клетки затем собирали, промывали 2 раза PBS и ресуспендировали в 100 мкл буфера. Annexin V 5 мкл и PI 1 мкл добавляли по очереди, смешивали и выдерживали 15 мин при комнатной температуре без воздействия света. 400 мл буфера добавляли и подвергали процедуре FCM (BD FACS CantoTM, США) для анализа скоростей клеточного апоптоза.

Гистокультурный тест лекарственной реакции (HDRA)

HDRA выполняли согласно нашим предыдущим исследованиям [14, 19]. Кратко, самцы ICR мышей инъецировали подкожно в оба подмышечных пространства 4–6 × 10⁶ клеток H₂₂ в физрастворе. Когда опухоли достигали 400–600 мм³ в объеме, мышей жертвовали шейным переломом, и свежие образцы брали, промывали дважды физраствором, мачивали в растворе Ханкса и делили на куски весом примерно 15 мг. Тканевые образцы помещали в 24-колбованую пластину, в которую квадратные желатиновые губки с размерами 1 см были промокнуты в среде RPMI 1640, дополненной 20% фетовой бычьей сывороткой и амикацин сульфатом (100 МЕ/мл), содержащей свободный CDDP или CDDP загруженные НЧ в двух разных концентрациях. Четыре опухолевых образца инкубировали без какого-либо препарата как контроль. Ткани затем культивировали 7 дней при 37 °C 5% CO₂. Смешанный раствор Типа I коллагеназы (100 л, 0,6 мг/мл) и MTT (100 л, 5 мг/мл) в 100 мг/мл натриевой сукцинате добавляли. После инкубации еще 24 ч, MTT формазан извлекали 1 мл DMSO, и 100 л раствора из каждой колбы переносили в колбы 96-колбовой микроплиты. OD каждой колбы в микроплите измеряли ELISA считывателем с тестовыми и референсными длинами волн 490 и 630 нм соответственно. Жизнеспособность тканей рассчитывалась согласно следующей формуле (4):

Тканевая жизнеспособность (%) = (OD (тест) / Вес (тест/мг)) / (OD (контроль) / Вес (контроль/мг)) × 100%

In vivo антиопухолевая эффективность

Измерение объема опухоли

Самцы ICR мыши с весом между 18 и 20 г имплантировали мышиной гепатомой клеточной линией H₂₂ и использовали для квалификации относительной эффективности CDDP-Tet загруженных НЧ. Выращенные в специфически патоген-свободных (SPF) условиях, мыши использовали в соответствии с руководством, одобренным Комитетом по уходу за животными в больнице Drum Tower. 0,2 мл клеточной суспензии, содержащей 4–6 × 10⁶ клеток H₂₂, инъецировали подкожно в левое подмышечное пространство мышей. Мышей разделяли на 6 групп: контрольная группа (физраствор), группа пустых НЧ, группа свободного CDDP (3 мг/кг), группа свободного CDDP плюс Tet (CDDP 3 мг/кг + Tet 7,2 мг/кг) и группа CDDP-Tet загруженных НЧ (CDDP 3 мг/кг + Tet 7,2 мг/кг). Каждая группа состояла из 6 мышей. Лечение начинали после 7–8 дней имплантации, и день обозначали как «День 0». Каждую мышь взвешивали в момент лечения, чтобы дозы могли быть скорректированы для достижения заявленных мг/кг доз. Животные также взвешивали каждый второй день на протяжении всего эксперимента.

Иммунофлуоресцентный анализ

Опухолевые ткани от мышей в контрольной группе и тех, кто получал свободный CDDP плюс Tet и CDDP-Tet НЧ, выбирали для гистологического наблюдения на 21-й день после лечения. Опухоли dissenкировали и фиксировали в 10% нейтральном буферизованном формалине, рутинно обрабатывали в парафин, резали толщиной 5 мм. Тканевые срезы наблюдали под конфокальным микроскопом Zeiss LSM510 Meta после того, как образцы окрашивали (40,6-диамидино-2-фенилиндол) (DAPI, синий) и терминальной деоксинуклеотидил трансферазы dUTP ник-энд маркировке (TUNEL, зеленый) [20].

¹⁸FDG-PET/CT визуализация

Мыши группы свободного CDDP плюс Tet и группы CDDP-Tet загруженных НЧ затем проходили PET/CT визуализацию на 6-й день после лечения. 4 ч голодания проводили перед инъекцией трассера. 14,8 МБк (400 мкКри) ¹⁸F-FDG инъецировали через хвостовую вену как радиотрассер. Изображения производили комбинированным PET/CT сканером (Jemini JXL, Philips, США). Высокоразрешающие PET изображения и то же поле зрения CT приобретали с мышами 45 мин после администрирования ¹⁸F-FDG. PET изображения корректировали на аттенуацию и рассеяние на основе CT данных. Фузия изображений выполнялась автоматической системой фузии изображений, используя программное обеспечение поставщика. Максимальные значения захвата FDG в опухоли получали для расчетов стандартного коэффициента захвата (SUV), применяя коррекции для веса тела и инъецированной активности.

Статистические методы

Статистические анализы данных выполняли с использованием t-теста Стьюдента. Данные перечислялись как среднее ± SD, и значения P < 0,05 принимались как статистически значимая разница.

Результаты

Синтез и характеристика кополимеров

Согласно нашему предварительному исследованию, мы синтезировали НЧ с PEG–PCL и HO-PCL (оптимальное соотношение было 1:3) [14]. Диаметр, полидисперсность, числовая средняя молекулярная масса (Mn) и весовая средняя молекулярная масса (Mw) оптимальных кополимерных НЧ PEG–PCL показаны в Дополнительном файле 1: Таблица S1. Когда загружены CDDP и Tet, содержание загруженного препарата и эффективность инкапсуляции также измерялись (Дополнительный файл 1: Таблица S2), которые были похожи на те CDDP-загруженных кополимерных НЧ PEG–PCL. Однако содержание загруженного препарата и эффективность загрузки Tet были меньше, чем у Tet-загруженных кополимерных НЧ PEG–PCL, что может быть связано с компонентами HO-PCL.

Через динамическое световое рассеяние (DLS), диаметр CDDP-Tet загруженных кополимерных НЧ PEG–PCL составлял 359,1 ± 5,3 нм с полидисперсностью около 0,231. Когда наблюдались TEM и AFM (Дополнительный файл 1: Рис. S1a и S1b), НЧ представляли правильную сферическую форму и похожие размеры, совпадающие с данными DLS. Также маленькие капли диспергированы в наночастицах, что подтверждает, что наночастицы действительно являются структурой двойной эмульсии.

Клеточное поглощение CDDP-Tet загруженных НЧ

Частицы, загруженные флуоресцентными красителями, применялись как обычный метод для изучения клеточного поглощения, который реализует визуальное и реальное время обнаружение. Мы продемонстрировали, что краситель-загруженные НЧ могут входить в клетки через эндоцитоз. В данном исследовании род아мин-B гидрофилен и может быть детектирован в канале флуоресценции PI, который используется для симуляции CDDP. Как симуляция Tet, кумарин-6 гидрофобен, чей сигнал может быть получен в канале флуоресценции FITC. После совместной инкубации с НЧ, загруженными кумарином-6 и родамином B 2 ч, клетки LoVo детектировали через флуоресцентную микроскопию и оптическую линзу (200×). Как видно на Рис. 2, флуоресцентные сигналы могут быть детектированы в канале флуоресценции PI, канале флуоресценции FITC, а также в канале двойной флуоресценции PI/FITC. Результаты подтвердили, что НЧ могут переносить кумарин-6 и родаминов B к опухолевым клеткам одновременно, на основе чего мы можем заключить, что CDDP и Tet могут быть загружены в НЧ и поглощены опухолевыми клетками одновременно.

In vitro цитотоксичность наночастиц

Цитотоксичность свободного CDDP, свободного Tet, свободного CDDP плюс Tet и CDDP-Tet загруженных НЧ сравнивали в желудочной клеточной линии MKN28. Концентрация Tet была в 2,4 раза больше концентрации CDDP. Как показано на Рис. 3, цитотоксичность CDDP-Tet загруженных НЧ была наиболее мощной среди четырех групп. Разница цитотоксичности между свободным Tet и группой НЧ и тремя другими группами свободных препаратов стала заметной с увеличением концентрации. Похожие результаты наблюдались в человеческих цервикальных раковых клетках Hela и гепатоцеллюлярных карциноме клетках H₂₂ (Дополнительный файл 1: Рис. S2a, S2b).

Токсикологическое исследование пустых НЧ проводилось в нашей предыдущей работе. В предыдущем исследовании пустые НЧ имели мало токсичности на опухолевых клеточных линиях, что указывало на то, что пустые НЧ обладают удовлетворительной биосовместимостью [14, 16].

In vitro анализ апоптоза CDDP-Tet загруженных НЧ

Мы измеряли влияние 1 мкг/мл свободного CDDP, 2,4 мкг/мл свободного Tet, свободного CDDP плюс Tet (1 мкг/мл + 2,4 мкг/мл) и CDDP-Tet загруженных НЧ (1 мкг/мл + 2,4 мкг/мл) на апоптотическую скорость клеток MKN28 после совместной культуры 48 ч. Апоптотическая скорость клеток рассчитывалась как Q2 + Q4 (показано на Рис. 4). Изменение апоптотических скоростей клеток было похожим между группами свободного CDDP плюс Tet, свободного CDDP и свободного Tet (Рис. 4a–c). Однако апоптотическая скорость клеток MKN28, индуцированная CDDP-Tet загруженными НЧ, была значительно выше, чем у трех других групп (Рис. 4d).

Гистокультурный тест лекарственной реакции (HDRA)

Для более комплексной оценки антиопухолевой эффективности НЧ мы оценили антиопухолевые эффекты свободного CDDP, свободного CDDP плюс Tet и CDDP-Tet загруженных НЧ на клеточных линиях H₂₂ с использованием HDRA. Как клинический метод для предсказания хемосенситивности, HDRA имитирует практические условия опухолевых тканей более аутентично, чем цитологический эксперимент [19], чьи результаты могут быть влияни микросредой и микроструктурой опухолевой ткани, такими как проникновение препарата, внеклеточные pH значения, интерстициальное жидкое давление и т.д.

Концентрация Tet в 2,4 раза больше концентрации CDDP. Как показано на Рис. 5, при наименьшей концентрации антиопухолевой эффект свободной группы CDDP и Tet был лучше, чем CDDP, но эффекты были похожи с увеличением концентрации препарата. В соответствии с анализом апоптоза, CDDP-Tet загруженные НЧ имели значительно лучший антиопухолевой эффект среди трех групп при всех протестированных концентрациях.

In vivo анализ антиопухолевой эффективности

Оценка эффективности и побочных эффектов

Муриные модели, сформированные путем инграфтирования клеточной линии H₂₂, лечились 3 мг/кг свободным CDDP, свободным CDDP вместе с Tet (CDDP 3 мг/кг + Tet 7,2 мг/кг), CDDP-Tet загруженными НЧ (CDDP 3 мг/кг + Tet 7,2 мг/кг) соответственно. Опухоли извлекали 12 дней после лечения препаратами. Размеры опухолей детектировали каждые 2 дня для определения наиболее оптимального содержания доставки препарата. Как показано на кривой роста опухоли (Рис. 6), тренд роста опухоли контрольной группы, а также группы пустых наночастиц были похожи, но существовало заметное ингибирование опухоли в других трех группах с доставкой препарата. По сравнению с группой свободного CDDP, группа свободного CDDP плюс Tet демонстрировала лучшую антиопухолевую эффективность в течение первых 6 дней. Однако после 6 дней разница скорости ингибирования опухоли между двумя группами начала сужаться и после 10 дней свободный CDDP плюс Tet имел даже худший антиопухолевой эффект.

В течение первых 6 дней антиопухолевые эффекты группы свободного CDDP плюс Tet и группы CDDP-Tet загруженных НЧ были похожи. Следовательно, мыши, получившие CDDP-Tet загруженные НЧ, показывали лучшую антиопухолевую эффективность с 6-го дня после лечения. Дополнительный файл 1: Рис. S3a отображает различные размеры опухолей каждой группы. Объем опухоли группы CDDP-Tet загруженных НЧ был наименьшим, что может рассматриваться как прямое отражение заметного антиопухолевого эффекта. Помимо способности ингибирования опухоли, по сравнению с группой свободного CDDP или свободного CDDP плюс Tet, на поверхности опухоли было меньше кровеносных сосудов. Аналогично, как показано в Дополнительном файле 1: Рис. S3b, сосудистая плотность была наименьшей в группе НЧ относительно контрольной группы и группы свободного CDDP плюс Tet.

Для дальнейшего изучения соотношения апоптотических клеток в опухолевой ткани in vivo, TUNEL анализ выполняли для обнаружения апоптотических клеток. Как показано на Рис. 7, апоптотические клетки в опухолях могут быть окрашены зеленой флуоресценцией для индикации апоптоза. Объединенные изображения показывают меньше зеленых флуоресцентных областей в контрольной группе и группе свободного CDDP плюс Tet, указывая на наличие меньшего количества апоптотических клеток. Более того, большое количество зеленых флуоресцентных областей наблюдалось в группе, леченной CDDP-Tet НЧ, указывая на большое количество апоптотических клеток. Результаты подтвердили, что CDDP-Tet НЧ могут способствовать опухолевому апоптозу in vivo.

Помимо лучшей антиопухолевой эффективности, чем у свободного CDDP и свободного CDDP плюс Tet группы, CDDP-Tet загруженные НЧ также демонстрировали меньше побочных эффектов. Как показано на Рис. 8a, свободный CDDP и свободный CDDP плюс Tet вызывали значительную потерю веса по сравнению с контрольной группой, указывая на токсичность при прямой доставке препарата. Кривая изменения веса группы пустых НЧ была похожа на контрольную группу, предполагая, что токсичность пустых НЧ может быть пренебрежена. Потеря веса, вызванная CDDP-Tet загруженными НЧ и контрольными группами, была сопоставима в течение первых 6 дней. С 6-го по 12-й день уровни веса мышей в группе НЧ были слегка ниже, чем в контрольной группе, но выше, чем в группе свободного CDDP или свободного CDDP плюс Tet. Стоит отметить, что группа свободного CDDP плюс Tet способствовала очевидной потере веса и снижению аппетита мышей в течение первых 4 дней, что указывает на то, что абсорбция препаратов была вредна для всего организма. В противовес, CDDP-Tet загруженные НЧ могут высвобождаться медленно в тканях и поддерживать концентрацию на стабильном уровне; поэтому побочные эффекты были заметно снижены по сравнению с прямой доставкой препарата. Затем побочные эффекты лечения также оценивали биопсией печени (Рис. 8b). По сравнению с контрольной группой, граница между клетками печени группы двойного наготого препарата размыта, некоторые клетки печени имеют баллионные изменения, клеточные тела сжимаются, ядерная пикноз и увеличенная эозинофилия (желтая стрелка), в то время как группа двойного препарата наночастиц. Структура стволовых клеток нормальна, межклеточное пространство ясно, и нет очевидных патологических изменений. Эти результаты предполагали, что доставка НЧ вызывала малое нарушение.

PET–CT

Для лучшего сравнения in vivo терапевтического эффекта каждой группы, мыши проходили CT, PET/CT сканирование на 6-й день после лечения. Фузионные изображения CT и PET сканирования отображены на Рис. 9. PET/CT — эффективный метод в отражении метаболических изменений через обнаружение захвата ¹⁸FDG [21]. Как показано на CT сканировании (Рис. 9), объем опухоли группы свободного CDDP плюс Tet и группы CDDP-Tet загруженных НЧ были сопоставимы (Рис. 9a), но метаболический уровень опухоли в группе свободного CDDP плюс Tet был значительно выше, чем в группе НЧ (Рис. 9b). Сниженная интенсивность в области опухоли мыши, получившей CDDP-Tet загруженные НЧ, символизировала низкий метаболический уровень опухоли, и тем самым указывая на способность НЧ задерживать рост опухоли.

Обсуждение

Учитывая гетерогенность и сложность опухоли, комбинированная терапия стала стандартной стратегией в клиническом лечении опухоли [22]. Тем не менее, простое сочетание двух индивидуальных терапевтических средств не может обязательно достичь ожидаемого эффекта из-за различных физикохимических и фармакокинетических свойств двух препаратов [23]. Для доставки разных препаратов к опухолевым клеткам в синергистическом соотношении, транспортное средство комбинированной терапии было спроектировано в данном исследовании. CDDP гидрофилен, в то время как Tet гидрофобен, что вызывает проблемы для метода загрузки. В данном исследовании мы использовали амфифильный кополимер с PCL как гидрофобное ядро и PEG как гидрофильную корону [14]. Улучшенным методом двойной эмульсии Tet локализовался в масляной фазе, а CDDP в водной фазе, уникальная структура придает НЧ способность к одновременной инкапсуляции Tet и CDDP для формирования НЧ. CDDP и Tet локализованы в разных слоях НЧ, что приводит к низкому интерференционному эффекту и высокой стабильности [24].

Транспортное средство комбинированной терапии, загруженное CDDP и Tet, может усилить эффективность комбинации CDDP-Tet. Не только в клеточных экспериментах, CDDP-Tet НЧ также значительно ингибируют жизнеспособность опухолевых тканей в анализах HDRA, подтверждая антиопухолевой эффект НЧ в модели, учитывающей микросреду опухоли [19]. Что касается in vivo исследования, антиопухолевая эффективность наблюдалась в изменении объема опухоли, что продемонстрировало, что CDDP-Tet НЧ эффективно подавляют рост опухоли с более низким уровнем пролиферации. ¹⁸FDG-PET/CT визуализация раскрыла, что глюкозный метаболизм опухолей в группе CDDP-Tet был ингибирован более выраженно и рано индуцированием более высокого апоптотического уровня опухолей, что было подтверждено в иммунофлуоресцентных анализах [21]. По сравнению с свободным CDDP плюс Tet, CDDP-Tet НЧ быстрее и безопаснее вступают в действие, что может быть объяснено тремя механизмами следующим образом.

Во-первых, как липофильный препарат, Tet с трудом распределяется в ВКМ и поэтому редко диффундирует вокруг опухолевых клеток [9]. Локализованный в масляной фазе НЧ, Tet наделен лучшей растворимостью и биодоступностью, достигая опухолевых мест в том же синергистическом соотношении, что и CDDP. Более того, CDDP, который обычно имел системные побочные эффекты, однажды доставленный наночастицей, может легко достигнуть интерстиуму опухолевых тканей из просачивающихся опухолевых кровеносных сосудов и удерживаться внутри опухоли из-за давления, создаваемого бедным лимфатическим дренажем [25]. Чем больше CDDP удерживают опухолевые ткани, тем меньше ущерб будет нанесен нормальным органам. В результате пассивных таргетирующих стратегий, CDDP-Tet НЧ намного безопаснее, чем свободный CDDP плюс Tet, что можно наблюдать в изменениях веса тела мышей и биопсиях печени.

Медикаментозная устойчивость считается одной из величайших проблем в лечении рака, не только из-за генетических изменений на уровне отдельной клетки, но также из-за опухолевых тканей и микросреды [26]. С одной стороны, Tet щелочен, поэтому он будет протонирован в кислой микросреде опухоли и таким образом не сможет пересечь электрически негативные цитометаболы опухолевых клеток, что называется pH-индуцированной физиологической медикаментозной устойчивостью [27]. С другой стороны, большие расстояния между кровеносными сосудами в твердых опухолях и высокое интерстициальное жидкое давление способствуют ограниченному распределению CDDP и Tet [28]. Доставленные наноносойтелем, Tet может входить в опухолевые клетки через эндоцитоз без влияния микросреды опухоли, преодолевая pH-индуцированную физиологическую медикаментозную устойчивость. Маленький размер наноносоителей позволяет им входить в опухолевую васкулатуру и предпочтительно аккумулироваться в месте опухоли in vivo [29, 30].

В заключение, данное исследование представляет пример доставки химиотерапевтического препарата вместе с хемосенсибилизатором одновременно. Доставленные НЧ, оба препарата таргетируются к месту опухоли пассивно, снижая системную токсичность. Кроме того, НЧ предлагают решение физиологической медикаментозной устойчивости, помогая хемосенсибилизатору входить в опухолевые клетки больше и быстрее, что играет важную роль в улучшении эффективности химиотерапии опухоли. Поэтому мы считаем, что эти блок-кополимерные НЧ PEG–PCL могут быть перспективным носителем для комбинированной химиотерапии.

Заключения

Основываясь на наших предыдущих исследованиях [8, 14, 16], данная статья исследовала применение PEG–PCL/HO-PCL НЧ для доставки комбинации двух препаратов с разными физикохимическими свойствами. Для in vitro исследований НЧ демонстрировали превосходный антиопухолевой эффект с отличной биосовместимостью. Усиленная антиопухолевая эффективность наблюдалась в изменении объема опухоли и ¹⁸FDG-PET/CT визуализации в in vivo исследовании на мышиной модели. Мыши в группе НЧ также демонстрировали сниженные побочные эффекты. Дополнительно, апоптотическая скорость опухолевых клеток была способствована НЧ как в in vitro, так и in vivo исследованиях. В заключение, эти блок-кополимерные НЧ могут быть перспективным носителем для доставки комбинаций Цисплатин-Тетрадрин и других комбинаций, с усиленным антиопухолевым эффектом и сниженной токсичностью, для лечения рака.

Доступность данных и материалов

Наборы данных, использованные и/или проанализированные в течение текущего исследования, доступны у соответствующего автора по разумному запросу.

Аббревиатуры

Tet:

Тетрадрин

CDDP:

Цисплатин

NP:

Наночастица

PEG–PCL:

Поли(этиленгликол)–поликапролактон

HO-PCL:

Поликапролактон

ECM:

Внеклеточная матрица

PEG:

Полиэтиленгликол

RES:

Ретикулоэндотелиальная система

DMF:

Диметилформамид

SPF:

Специфически патоген-свободный

Mn:

Числовая средняя молекулярная масса

Mw:

Весовая средняя молекулярная масса

DLS:

Динамическое световое рассеяние