Оптимизация NIR-инициируемой гипертермии с наночастицами Cs0.33WO3 для лечения рака печени HepG2

Аннотация

Гипертермия — один из самых пациентоориентированных методов лечения онкологических заболеваний благодаря своей неинвазивности, минимальным побочным эффектам и токсичности, а также легкости внедрения, что стимулирует разработку новых терапевтических методов, таких как фототermalные дозирующие системы. В данном исследовании исследуются переменные фототermalных эффектов наночастиц (НЧ) Cs_0.33WO₃ — длительность облучения, плотность оптической мощности и концентрация НЧ — на клеточной линии рака печени HepG2 in vitro, что приводит к формулировке ближнеинфракрасного (NIR) облучаемого термического дозирования. НЧ с частицами размером 120 нм синтезированы через серию окислительно-восстановительных (REDOX) реакций, термического отжига и влажного помола. Последующая характеристика физических, составных, оптических и фототermalных свойств изучалась с помощью динамического светового рассеяния (DLS), энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDS), сканирующей и туннельной электронной микроскопии (SEM и TEM), рентгеновской дифракции (XRD) и видно-ближнеинфракрасной (VIS-NIR) фотоспектроскопии. Цитотоксичность НЧ и параметров облучения определяли для клеток HepG2. Инкубируя клетки с НЧ, верифицировали состояние эндоцитоза и определяли зависимость выживаемости клеток от переменных параметров фототermalного дозирования, поддерживая температуру среды в чашке Петри с клетками при температуре человеческого тела ~36,5 °C.

Введение

Глобально, в 2018 году злокачественные онкологические заболевания унесли около 10 миллионов жизней и добавили оцениваемые 18 миллионов новых случаев [1]. До сих пор, хотя химиотерапия, лучевая терапия, хирургическое удаление или их комбинации обеспечивают улучшение 5-летнего выживания чуть более 40% лечимых онкологических пациентов [2, 3], токсичная и деструктивная природа химикалов и ионного бомбардирования неизбежно вызывает множество побочных эффектов: выпадение волос, кардиотоксичность, бесплодие, хромосомные аномалии и многие другие [4, 5]. Такие жизнь-наносящие последствия сильно стимулировали развитие пациентоориентированной терапевтической медицины, включая НЧ-включающие соединения.

Нанотехнологии на основе уникальных материальных систем, структур, форм и атомной стехиометрии на масштабе ниже 100 нм дают беспрецедентные химические, физические и биохимические свойства, усиленные феноменами квантования, и уже нашли до klinических и in vitro применения во многих областях биомедицинской науки [6, 7]. Несмотря на недостатки химиотерапии, НЧ как носители доставки улучшают селективность выпуска лекарства в больной опухоль, облегчают поглощение лекарства опухолевыми клетками и в значительной степени снижают кумулятивную токсичность в здоровой ткани [8, 9]. Также качество изображения, производимое массивом НЧ-основанных модальностей визуализации, значительно улучшается с более высокой чувствительностью, более тонким пространственным разрешением и лучшей глубиной проникновения для раскрытия биодистрибуции, мониторинга поглощения лекарств, локализации опухоли и оценки эффективности лечения [10]. Помимо диагностической функции, НЧ, используемые с врожденными физическими свойствами, такими как радиочастотная (РЧ) аблиация или фототermalно рендерированная гипертермия, могут дополнительно наносить повреждения в желаемом месте с повышенной эффективностью [11–13], из которых вторая обычно предпочтительнее благодаря своевременному дозированию, меньшей степени боли, низким побочным эффектам и значительно сниженному риску ожогов тканей.

На данный момент материальные системы НЧ, способные индуцировать гипертермию при фотооблучении, включают золото (Au), цезий вольфрамат (CsWO₃), оксид железа, сульфид меди, графен и углеродные нанотрубки и продемонстрировали применимость наложения летальных повреждений на раковые клетки путем повышения внеклеточной или внутриклеточной температуры in situ [14–18]. Аналогично НЧ-усиленной РЧ-аблиации, уровень плотности инцидентной мощности фотонных источников является критической проблемой для клинической безопасности и комфорта пациента [11], и установлено, что максимальный предел экспозиции для человеческой кожи в диапазоне VIS и NIR волновых длин 400–980 нм составляет 0,2–0,726 Вт/см² согласно Международной комиссии по защите от неионизирующего излучения (ICNIRP), опубликованной в 2013 году [19]. Тем не менее, большинство плотностей оптической мощности, сообщаемых в предыдущих in vitro исследованиях раковых клеток, значительно превышали предел безопасности для кожных тканей, что может быть серьезным вопросом при лечении внутренних биологических тканей с низким порогом фотооблучения для уязвимости. Например, NIR плотность оптической мощности золотых (Au) НЧ, демонстрирующих эффективное уничтожение раковых клеток, варьировала от 2 до 80 Вт/см² при облучении не более 10 мин [13, 14, 20–22]. Аналогично, ассортимент других материальных систем, таких как оксиды графена [18], железо-платина (FePt) [23] и NaYF₄:Yb,Er нанокристаллы [24], требовали не менее 150 мВт/см² для инструментального развертывания.

Будучи относительно малоизученным материалом для in vitro экспериментов, несколько исследований сообщали об уничтожении шейноматовых раковых клеток (Hela) NIR-облученными CsWO₃ НЧ с не менее 0,72 Вт/см² [15, 25, 26], что находится вблизи предела экспозиции кожных тканей NIR диапазона, установленного ICNRP, и может вызывать делетериальные эффекты для здоровых тканей при длительной экспозиции [19]. Более того, температура среды культивирования, порождаемая комбинацией лечебной дозы концентрации НЧ, длительности фотоэкспозиции и оптической интенсивности, в прошлых исследованиях была значительно выше 40 °C, что непереносимо для здоровых человеческих клеток, и уровни смертности раковых клеток не были детализированы.

CsWO₃ НЧ исключительно абсорбируют в диапазоне NIR волновых длин от 800 нм до 2400 нм [27] и функционально подходят для биомедицинских применений. Несмотря на демонстрированную выдающуюся эффективность в элиминации раковых клеток, цитотоксичность все еще во многом неизвестна, и предоставление формулы дозирования концентрации НЧ с низкой цитотоксичностью, короткой длительностью облучения и плотностью оптической мощности в пределах предела безопасной фотоэкспозиции для кожных тканей все еще отсутствует.

Настоящее исследовательское изучение пытается оценить in vitro выполнимость уничтожения гепатических раковых клеток HepG2, культивированных в чашке Петри диаметром 5,2 см, используя нецитотоксичную концентрацию НЧ и плотность оптической мощности в пределах предела фотоэкспозиции кожных тканей, поддерживая температуру среды клеточной культуры при нормальной температуре человеческого тела 36,5 °C. В деталях, НЧ Cs_0.33WO₃ со средним размером частиц около 120 нм синтезированы с использованием последовательности редокс, термического отжига и влажного помола, и охарактеризованы по поверхностной морфологии, кристалличности, оптическим и временным фототermalным свойствам. Кроме того, фототermalные эффекты переменных дозовых параметров — длительности облучения, концентрации НЧ и плотности оптической мощности NIR облучения на центральной длине волны 980 нм — на коэффициенте выживаемости клеток рака печени HepG2 изучались и оценивались для разработки комбинации безопасной лечебной дозы.

Методы

В этом исследовании 102-е поколение клеточной линии гепатического рака HepG2, полученной из человеческой первичной опухоли, культивировалось как экспериментальная модель для оценки цитотоксичности, накладываемой NIR-облученными домашними НЧ Cs_0.33WO₃, и оценки терапевтической эффективности различных термических доз в пределах предела безопасности экспозиции кожных тканей и при нетоксичной концентрации НЧ.

Синтез НЧ Cs_0.33WO₃

Левая панель Рис. 1 иллюстрирует блок-схему процедуры синтеза наночастиц оксида цезия-вольфрама (Cs_0.33WO₃). Кратко, предварительные химикаты ((NH₄)₂WO₄) (Alfa Aesar, чистота 99,9%) и CsCl (Alfa Aesar, чистота 99,9%) растворяли отдельно в 100 мл DI воды, затем смешивали вместе при 25 °C под постоянным перемешиванием 250 об/мин с использованием магнитного мешалки в течение одного часа. После перемешивания температуру смеси в колбе регулировали до 180 °C и выдерживали до полного испарения водного содержимого. Полученный сухой белый порошок был финальным предкурсором материала Cs_0.33WO₃. С включенным чиллером, кварцевая лодка с предкурсорным порошком загружали в центр высокотемпературной трубчатой печи, давление внутри трубы приводили к 0,08 торр. Затем предкурсор нагревали при 500 °C с введением притока смеси газов H₂ и N₂ в соотношении 90:10 стандартных кубических см в минуту (SCCM) для облегчения реакции редокс. Через 1 ч приток H₂ отключали, поток N₂ регулировали до 100 SCCM, температуру печи повышали до 800 °C для термического отжига на один час. После завершения процессов чиллер и температурно-контролируемая печь выключали, кварцевую лодку охлаждали до комнатной температуры и извлекали из печной трубы. Полученный темно-синий порошок из кварцевой лодки — микронный (мк) Cs_0.33WO₃ порошок. Для дальнейшего уменьшения размера гранул порошка, 150 г смеси, состоящей из 15 г мк-порошка, 3,8 г кополимерного дисперганта для предотвращения агрегации частиц, 10 мкл антипенного агента и DI воды, приготовили, налили в пробковую чашу, содержащую 600 г циркониевых бусин, и устанавливали в камеру нанопомольного оборудования (Justnanotech Co., Taiwan). Со скоростью и температурой 2400 об/мин (RPM) и 15 °C НЧ производили помолом мк-порошка с 0,1 мм ZrO₂ бусинами 4 ч, и с 0,05 мм ZrO₂ бусинами еще 4 ч. Общая продолжительность каждого процесса помола не превышала 4 ч для избежания чрезмерной вязкости жидкости и любых ошибочных изменений физических размеров материала. Финальный раствор после помола просеивали через 0,22-мкм пористый фильтр для всей последующей характеристики и эксперимента. Флуоресцентная версия НЧ Cs_0.33WO₃ (fНЧ) готовили по следующему протоколу. Раствор из 2 мл флуоресцеина концентрации 28 мг/мл и 2 мл раствора НЧ Cs_0.33WO₃ 1,5 мг/мл приготовили в колбе и поместили в чашу ультразвукового шейкера на 15 мин. Затем раствор НЧ и диспергант смешивали в соотношении 1:1,25 и подвергали ультразвуковому шейкингу 15 мин. Полученный раствор промывали DI водой и центрифугировали на 10 000 об/мин 15 мин, повторяли дважды перед использованием.

Рис. 1. Схематичная иллюстрация экспериментальных процедур для синтеза материала, клеточной инкубации с НЧ и фототermalного анализа на раковых клетках. BCL, TEn и PD — аббревиатуры для биконкавой линзы, термического обрамления и чашки Петри соответственно; красная стрелка указывает местоположение для измерения профиля пучка.

Характеристика материала

Затем проводили характеристику НЧ Cs_0.33WO₃, включая статистические размеры частиц, кристаллическую структуру, структурную морфологию, контурную форму, VIS-NIR фотоабсорбцию, используя дзета-анализ (ZS90, Malvern, UK), XRD (D2 Phaser, Bruker AXS GmbH, Germany), SEM (SU-5000, Hitachi, Japan) в сочетании со встроенной энергодисперсионной спектрометрией (EDS), TEM (JEM-2100F, JEOL, Japan), динамическое световое рассеяние (DLS) (Delsa Nano C, Beckman Coulter, USA), UV-VIS-NIR спектрометр (V-750, Jasco, Japan) соответственно. XRD спектры получали сканированием рентгена по образцам в угловом диапазоне 20°–80° со скоростью 4°/мин. Сигнал дифракции от образца в зависимости от угла сканирования определяли и сравнивали со стандартным XRD спектром Cs_0.32WO₃ от карты JCPDS № 83-1334. Для подтверждения временной зависимости фототermalного свойства НЧ, настраивали простой экспериментальный аппарат из NIR лазера 980 нм и температурного зонда для зондирования температуры, порождаемой NIR-облученным раствором. Исследуемые растворы включали DI воду с разбавленными НЧ и смесь НЧ в клеточной среде. Диаметр оптического пучка для образцов в чашках Петри расширяли для покрытия всей поверхности чашки, создавая 0,05 Вт/см² оценочной плотности оптической мощности, иначе оставали неизменным 2 Вт/см². Оптическая установка, показанная на правой панели Рис. 1, используется для NIR облучения. В сердце оптической системы — NIR лазерный пучок, направленный к биконкавой линзе, расширяющей диаметр пучка от 4 мм до 5,2 см, эквивалентному диаметру поверхности чашки Петри, помещенной на нагревательную пластину, установленную на 36,8 °C, что является физиологической температурой для роста клеток; также чашка Петри окружена пластиковым цилиндрическим обрамлением для помощи в равновесии температуры окружающей среды и среды. Дополнительный файл 1: Рис. S1 иллюстрирует картирование оптической интенсивности NIR лазерного пучка, измеренное на выходе апертуры пучка, обозначенное красной стрелкой рядом с лазерным пучком на Рис. 1. Профиль пучка представляет 3D распределение оптической интенсивности и верифицирует однородность светового поля по всему открытию чашки Петри.

Цитотоксичность и фототermalные анализы

Для начала циклов клеточного культивирования подготовили 500 мл среды, состоящей из 440 мл питательной смеси Ham's F-12 и модифицированной среды Дюльбекко (HDMEM), 50 мл фетальной телячьей сыворотки (FBS), 5 мл L-глутамина и 5 мл P/S (Пенициллин-Стрептомицин), стерилизованной сетчатым фильтором с порой 0,22 мкм. Чашки Петри с клетками, 10 см или 5,2 см диаметром, заполняли соответственно 8 мл и 2 мл среды для первичного и субкультурирования и инкубировали в инкубаторе с 5% CO₂ при 37 °C. Наблюдение за ростом клеток и обновление среды проводили раз в два дня.

Для получения коэффициентов выживаемости для случаев клеточных анализов: (1) контроль без внешнего воздействия, (2) только NIR облучение, (3) инкубация с НЧ, (4) инкубация с НЧ с последующим NIR облучением, среду в чашке откачивали, добавляли 0,4 мл трипсина в чашку и помещали в инкубатор на ~10 мин. После подтверждения отachement клеток от стенок чашки, 10 мкл клеточной среды забирали из чашки и добавляли к 10 мкл раствора трипан-синего в микROCентрифужную пробирку, удаление остаточных плавающих НЧ проводили через несколько промывок фосфатно-буферным раствором (PBS). После подсчета клеток заполняли счетную пластинку 10 мкл окрашенного клеточного раствора через инъекционное отверстие, клетки наблюдали в фокальной плоскости стереомикроскопа и считали ручным счетчиком; каждая точка данных на всех рисунках, касающихся коэффициента выживаемости, была средним из трех экспериментальных испытаний (N = 3) плюс маржа стандартного отклонения.

Для подготовки оценки цитотоксичности НЧ и его фототermalных эффектов на коэффициент выживаемости клеток, среду в 5,2 см чашке удаляли, доливали нужное количество раствора НЧ в новой среде для получения массива тестовых концентраций: 2 мг/мл, 1,5 мг/мл, 1 мг/мл и 0,5 мг/мл, затем инкубировали на один день перед экспериментом.

Перед фототermalным анализом оценка цитотоксичности проводилась для изучения реакции клеток на массив концентраций НЧ следующим образом. Среду с клетками и НЧ забирали из инкубатора и аспирировали. 1 мл предварительно согретого PBS использовали для промывки раковых клеток и откачки остаточных плавающих CsWO₃ НЧ, не прошедших эндоцитоз, процедура повторялась несколько раз для обеспечения того, что любая потенциальная клеточная смертность не вызвана подъемом температуры НЧ в новой среде. После фототermalного лечения процедура подсчета реализовывалась для цитотоксичности и фототermalного анализа на клетках.

Результаты

Оптическая абсорбция и фототermalные свойства Cs_0.33WO₃ наноматериалов сильно зависят от кристаллической структуры, температуры после отжига, атомной стехиометрии и частичных размеров [28, 29].

Для характеристики поверхностной морфологии мк-порошка Cs_0.33WO₃ получали SEM изображения с увеличением 10 000X для визуального подтверждения иконической структуры колоночного гексагона, обозначенного красной стрелкой на Рис. 2а. Дополнительно, TEM изображения демонстрируют контурную форму и размеры гранул мк-порошка на Рис. 2б, где размер ~1 мкм или меньше. Геометрия НЧ в виде стержней и гистограмма DLS распределения наномасштабного размера, центрированная около 120 нм, также верифицированы и представлены на Рис. 2в и соответствующем вставке TEM изображения. Также кристаллическая характеристика мк-порошка и НЧ с XRD представлена на Рис. 2г. Как видно из XRD спектра мк-порошка на верхней панели, иконические плоскости кристаллизации вдоль (002), (102), (200), (112), (202), (212), (004), (220), (222), (204), (400) и (224) хорошо совпадают со стандартным спектром Cs_0.32WO₃ от карты JCPDS № 83-1334. Когда размер частиц мк-порошка уменьшается до 120 нм, интенсивности всех дифракционных пиков монотонно снижаются, и некоторые характеристические пики, указывающие на сильное NIR поглощение, такие как плоскости (102) и (220), становятся невидимыми в спектре. Подобно этому, идентификация атомных составляющих, цезия (Cs), вольфрама (W) и кислорода (O), показанная на Рис. 2д, не только подтверждает их атомное присутствие, но и аутентифицирует отношение атомных процентов Cs к W, 0,315, близкое к изначально спроектированной стехиометрии.

Рис. 2. Физическая и материальная характеристика. а SEM и б TEM изображения мк-порошка, в гистограмма DLS распределения размера НЧ, г XRD спектры мк-порошка и 120 нм НЧ, д EDS спектр с процентом атомного состава. Масштабные линии в а, б, в — 1,5 мкм, 200 нм и 100 нм соответственно.

Помимо материальной характеристики, оптические спектры абсорбции НЧ и временные профили фототermalной модуляции температуры измеряли и представлены на Рис. 3. На (а, б) показана зависимость NIR абсорбции и профили подъема температуры, индуцированной NIR-облученным раствором НЧ как функция концентрации НЧ, где временной профиль температуры 1 мг/мл достигает 40 °C и остается стабильным минимум 1 ч, подтверждая фототermalную стабильность и долговечность материала. Аналогично, временной профиль температуры на Рис. 3в иллюстрирует 5 повторных циклов в течение 190 мин, верифицируя фототermalную отзывчивость НЧ материала. На Рис. 3г временные температурные профили среды культивирования и НЧ-включенной среды, извлеченной из инкубатора, помещенной на нагревательную пластину и подвергшейся NIR облучению, стабилизируются около 37 °C в течение 10 мин, а температура чистого NIR-облученного раствора НЧ поднимается от 24,6 °C до 33,6 °C через 10 мин. Таким образом, учитывая фототermalную функциональность НЧ, NIR облучение для последующих экспериментов проводили 10 мин, 30 мин и 60 мин, сохраняю робастность НЧ во время экспериментальной сессии и потенциально применимо к доклиническим исследованиям.

Рис. 3. Оптические и фототermalные свойства. а Спектры оптической абсорбции и профили временного курса температуры NIR-облученного раствора НЧ в б, в кювете и в г чашке Петри. Ex символизирует профили случаев с расширенным пучком; концентрация НЧ 1,5 мг/мл и плотность оптической мощности 50 мВт/см² использованы в (г); длительность NIR облучения за цикл в в — 15 мин.

Далее, не токсичная доза экспериментальных параметров, включая длительность NIR облучения и концентрацию НЧ, определялась облучением клеток 1 ч и 2 ч при 50 мВт/см² и через прямое взаимодействие с НЧ концентраций 0,5 мг/мл, 1 мг/мл, 1,5 мг/мл и 2 мг/мл, показанными на Рис. 4а, б. Коэффициент выживаемости клеток оставался значительно выше 95% в течение 2 ч NIR облучения, подтверждая не токсичность клеток для длительной экспозиции 980 нм фотону, а также не токсичную концентрацию НЧ ниже 1,5 мг/мл.

Рис. 4. Анализ цитотоксичности экспериментальных параметров. Коэффициент выживаемости клеток HepG2 при дозировании а длительностью NIR облучения, б 120-нм НЧ различных концентраций. Длительность инкубации НЧ — один день; стандартное отклонение трех экспериментальных испытаний (N = 3) для каждой точки данных указано.

Цель дозирования раковых клеток при 1,5 мг/мл или ниже, которое почти не наносит повреждений клеткам HepG2, — изучить эффекты фототermalной дозы на раковые клетки без вмешательства врожденной токсичности НЧ. Чтобы изучить, могут ли NIR-облученные НЧ быть жизнеспособным решением для элиминации раковых клеток, клетки инкубировали с НЧ 1,5 мг/мл на день, затем подвергли NIR облучению 1 ч. Как видно из ярко-польных (BF) оптических изображений Рис. 5д–ж, число явно снижается, когда время экспозиции длится 1 ч (е) или 2 ч (ж). Количественно, коэффициент выживаемости монотонно снижается от 84,2% до 58,4% по мере увеличения длительности облучения от 10 мин до 1 ч, и линейная трендовая линия хорошо подходит среди разбросанных точек, предсказывая 20% выживаемости при облучении 2 ч. Дополнительно, Рис. 5з указывает, что для 1 ч облучения коэффициент выживаемости снижается от 73 до 58% по мере увеличения плотности оптической мощности от 12,5 до 50 мВт/см², подтверждая функциональность NIR-облученных НЧ как фототermalного триггера в разрушении раковых клеток.

Рис. 5. Фототermalный анализ. Коэффициент выживаемости клеток HepG2 при дозировании концентрацией НЧ 1,5 мг/мл вместе с NIR облучением. Соответствующие масштабные линии на а–в верхнем и д–ж нижнем рядах BF оптических изображений — 200 мкм и 100 мкм. Стандартное отклонение трех экспериментальных испытаний (N = 3) для каждой точки данных указано.

Кроме того, неопределенность о том, происходит ли такое фототermalное действие внутриклеточно или внеклеточно, решалась путем приготовления fНЧ, проведения той же процедуры промывки и инкубации, и наблюдения за внутриклеточным присутствием fНЧ. Рис. 6 иллюстрирует конфокальные BF (б, е) и флуоресцентные (а, д) изображения и их наложенные композиты (в, ж) клеток, инкубированных с и без fНЧ. Очевидно, клетки без инкубации fНЧ как контроль демонстрируют пренебрежимо малую зеленую флуоресценцию, в основном атрибутируемую клеточной автофлуоресценции, в резком контрасте с экспериментальным, где распределение зеленой флуоресценции вездесущно во всем цитоплазме на изображении. Средние интенсивности флуоресценции в изображениях контрольных и экспериментальных образцов также квантифицированы и представлены в гистограмме Рис. 6з, где флуоресценция fНЧ, прошедших эндоцитоз, как минимум в девять раз сильнее контроля.

Рис. 6. Оптические конфокальные изображения. а, д флуоресценция, б, е BF и в, ж композитные оптические изображения клеток HepG2, инкубированных с и без fНЧ, как соответствующие экспериментальные и контрольные группы, представлены в а–в верхнем и д–ж нижнем рядах вместе с з гистограммой средних интенсивностей флуоресценции. Масштабные линии — 20 мкм; длина волны лазерного возбуждения 488 нм.

Обсуждение

Концепция терапевтической гипертермии с использованием электромагнитных волн для лечения онкологических заболеваний датируется ранними 1900-х и преуспевала в отступлении некоторых форм злокачественностей, однако затухла из-за полезности лихорадко-индуцирующих антибактериальных агентов и отсутствия точной доступности к локальным опухолям интереса in situ [30]. Только в 1980-х интерес возродился с несколькими in vitro исследованиями, обнаружившими многие аспекты метаболических изменений, изменения опухолевой микрциркуляции и ацидолиза после гипертермического лечения, производящего летальные эффекты на раковые клетки [31]. Механистически, помимо прямой цитотоксичности, при которой раковые клетки проходят некроз с уменьшением апоптоза при приложенной температуре > 42 °C, сниженная скорость кровотока в ассоциации с более низкой охлаждающей способностью и низким pH (< 6,8) делают раковые клетки более восприимчивыми к нагреванию и следственно более высоким коэффициентом убийства клеток [32, 33]. Однако клинически, из-за векового недостатка неточной неспецифической локализации, гипертермия находила усиленную терапевтическую эффективность только при одновременном применении с химио- или лучевой терапией [34, 35].

НП-основанные материалы, позволяющие точную таргетировку и мониторинг, и имеющие широкий спектр физических свойств, таких как поверхностный заряд, флуоресценция, фототermalная конверсия, хорошо вписываются в нишу такой неточности в применении гипертермии. Однако, несмотря на доказанную полезность многих NIR-облученных НП материалов в исследованиях раковых клеток, предел безопасности фотоэкспозиции часто не хорошо изучен, как в случае CsWO₃ НП. CsWO₃ НП, хоть и показывают относительно низкую цитотоксичность при 1,5 мг/мл (Рис. 4б) по сравнению с рядом популярных НП материалов, таких как Ag, Au, графен, чьи пороги лежат на уровне 1 мкг/мл [18, 36, 37], все еще требуют 0,7 Вт/см² для эффективного уничтожения Hela клеток, несмотря на их сильное NIR поглощение в диапазоне 800–2400 нм [15, 25, 26].

Настоящее исследовательское изучение намерено разработать эффективную NIR-облучение-инициированную, Cs_0.33WO₃ НП-основанную термическую дозировочную формулу для in vitro клеток рака HepG2 как функцию концентрации НП, длительности облучения и плотности оптической мощности в пределах предела NIR экспозиции для кожных тканей.

Эксперимент начинается с синтеза НП, где поэтапная синтетическая процедура, включающая реакцию редокс, процесс отжига и метод влажного помола, описана на Рис. 1. Реакция редокс вкорпорирует крупные тернарные элементы, Cs в данном случае, в кольца октаэдрической структуры WO₆ в подходящей физической среде, позволяя формирование уникальной кристаллической структуры и включение свободного электрона в металлическое молекулярное соединение, что является внутренней причиной сильной фототermalной конверсии при NIR поглощении [26, 27]. Также последующие процессы отжига и влажного помола помогли уточнить кристаллическое формирование и уменьшить частичный размер, что дополнительно усиливает NIR фототermalную конверсию. Послеward, синтезированный раствор НП прошел серию физической и материальной характеристики, верифицирующей средний размер частиц 120 нм, критическую оптимизацию NIR поглощения, и аутентифицирующей атомный состав (Рис. 2). Дополнительно, соответствующие измерения дзета-потенциала для 0,5 мг/мл, 1 мг/мл и 1,5 мг/мл составили -53,2 мВ, -54,3 мВ, -60,1 мВ. Обычно процесс эндоцитоза является главным путем входа для большинства типов НП, и скорость поглощения как катионных, так и ионных НП для нефагоцитарных клеток выше, чем нейтральных сущностей, хотя первые работают лучше последних [38]. Также многие предыдущие отчеты находили негативно заряженные НП менее токсичными для нефагоцитарных клеток [39, 40], что является благоприятным достоинством при рассмотрении чрезмерного внутриклеточного накопления НП для фототermalной дозы, сопровождаемой низкой токсичностью.

Для установки тона для фототermalного анализа на клетках HepG2, оценка робастности НП как фототermalного нагревателя, ее долгосрочной стабильности на насыщенной температуре в равновесии с окружающей средой более часа и повторяемости для 5 последовательных циклов в течение 3 ч демонстрировались (Рис. 3б, в). Также, для квантификации эффективности гипертермии НП per se в дозировании раковых клеток путем исключения влияния окружающей температуры (номинально 25 °C), была реализована калибровка экспериментального аппарата путем установки нагревательной пластины на 37 °C, на которой проводились все клеточные анализы, и временные фототermalные характеристики чистой среды культивирования и НП-включенной среды оставались на 37,1 °C (Рис. 3г). Послеward, зависимость цитотоксичности от длительности облучения и концентрации НП изучалась отдельно и представлена на Рис. 4, указывающая менее 5% убийства клеток за более 2 ч NIR облучения и 1,5 мг/мл как переломную точку к летальной концентрации. Фиксируя концентрацию НП на 1,5 мг/мл, использовавшуюся на протяжении остального фототermalного анализа, термическая доза для медицинской гипертермии определялась как функции переменных дозирования длительности и плотности оптической мощности. Рис. 5 иллюстрирует действие убийства клеток с низким (а–в) и высоким (д–ж) увеличением при реализации NIR облучения 0 ч, 1 ч и 2 ч, видимое снижение числа клеток хорошо отражает количественный анализ коэффициента выживаемости (г), и линейная трендовая линия предсказывает 80% смерти клеток при 2 ч облучения. Аналогично, снижение коэффициента выживаемости при инкрементальной плотности оптической мощности демонстрируется в (з). Наконец, как четко изображено BF, флуоресцентными и наложенными композитными изображениями на Рис. 6, где представлен гистограммный анализ флуоресценции, эндоцитоз fНП был верифицирован.

Заключение

В резюме, это исследование представляет синтез и характеристику НП Cs_0.33WO₃, исследует in vitro анализы цитотоксичности прямого взаимодействия НП и отдельно с NIR облучением, и доказывает эндоцитоз НП, а также эффективность NIR-облученных НП на разрушении клеток рака печени HepG2. Более того, это исследование предлагает комбинативную дозу раствора NIR-облученных НП Cs_0.33WO₃ для клеток рака HepG2: 1,5 мг/мл концентрации НП, длительность облучения между 30 мин до 1 ч, и плотности оптической мощности NIR облучения под 50 мВт/см², что значительно ниже предела безопасности NIR экспозиции для кожных тканей, позволяя коэффициенту смертности раковых клеток близко к 40% и потенциально применимо к развитию пациентоориентированной и персонализированной медицины. Такие исследования в клинической настройке потребуют дополнительных мер, таких как поверхностная модификация молекулами, распознающими поверхностные рецепторы специфических типов раковых клеток.