Нацеливание на эндотелиальные клетки с помощью многофункциональных наночастиц GaN / Fe

Фон

В последние годы было предпринято много усилий по борьбе с раком и родственными заболеваниями с использованием нанотехнологий. Один из наиболее распространенных подходов основан на использовании наночастиц в качестве носителей лекарств [1, 2]. Этот подход, однако, имеет ограничения, связанные с необходимостью покрытия наночастиц распознающими лигандами для адсорбции лекарств и ковалентного связывания, или вызванные необходимостью инкапсулировать лекарственные средства внутри наночастиц. Альтернативный терапевтический подход заключается в использовании наночастиц для прямой клеточной терапии, то есть для нацеливания на участки с целью биологического лечения заболевания [3]. Например, эндотелиальные клетки, нагруженные магнитными наночастицами, можно направить к участкам повреждения артерии с помощью приложенного магнитного поля. Помимо терапевтических применений, управление клетками с помощью наночастиц также может быть полезно для разделения клеток in vitro и клеточного покрытия трехмерных конструкций [4]. В этой статье мы демонстрируем, что эндотелиальные клетки поглощают наночастицы на основе GaN / Fe и что это явление можно использовать для контроля пространственного распределения клеток in vitro.

Методы

Синтез наночастиц

Тонкие слои GaN были выращены на наночастицах ZnO, легированных Fe ₂ . О ₃ компанией HVPE в два этапа. Первоначально зародышевый слой наносился при 600 ° C в течение 5 мин. Затем температуру повысили до 800 ° C и выдерживали при этой температуре 10 мин. Второй температурный режим необходим для разложения ядра ZnO и улучшения кристаллического качества GaN. Рост GaN подробно описан нашей группой ранее [5, 6]. Вкратце, мы использовали металлический галлий, аммиак (NH ₃ ) газ, хлористый водород (HCl) и водород (H ₂ ) в качестве газов-носителей. В процессе роста GaN HCl, NH ₃ , и H ₂ расход составлял 20, 600 и 3500 куб. см соответственно.

Культура клеток

Эндотелиальные клетки аорты свиньи выделяли из аорты осторожным соскабливанием слоя эндотелиальных клеток с помощью скальпеля. Клетки культивировали в стандартном инкубаторе при 37 ° C с 5% CO ₂ . в EGM ™ -2 (среда 2 для фактора роста эндотелия, Lonza). Расщепление клеток выполняли с помощью TrypLE ™ Select (1X) (Gibco®). Для всех экспериментов использовали клетки между 3 и 8 пассажами. Клетки метили зеленым флуоресцентным белком (GFP) с помощью лентивирусной трансдукции, как описано в другом месте [7].

Анализ XTT

Анализ XTT начинали через 24 часа после смены среды, когда добавляли новую среду с наночастицами. Затем культуральную среду заменяли свежей средой EGM2 с реагентом XTT в соотношении 2:1. Реагент XTT состоит из 0,1 мл реагента электронного связывания в 5 мл XTT. После 4 ч инкубации при 37 ° C с 5% CO ₂ , оптическую плотность измеряли на многорежимном планшет-ридере Paradigm.

Подсчет ячеек

Через 2 дня инкубации клеток с различными концентрациями наночастиц клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 10 мин, промывали PBS и окрашивали DAPI (1:7500, разведенный в PBS) в течение 10 мин. Случайное поле зрения фотографировали из шести независимых лунок камерой высокого разрешения, установленной на флуоресцентном микроскопе (Zeiss). Компьютерное программное обеспечение DotCount v1.2 [8] использовалось для количественной оценки относительного количества клеток в каждой лунке и сравнения с контролем.

Просвечивающая электронная микроскопия

Просвечивающую электронную микроскопию проводили после инкубации клеток с наночастицами в течение 1 дня. После того, как клетки достигли 50% слияния, культуральную среду заменяли средой с добавлением 50 мкг / мл наночастиц GaN / Fe, и клетки инкубировали в течение других 24 часов. Затем клетки промывали PBS, фиксировали 2% глутаровым альдегидом и 2% формальдегидом при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем инкубировали в течение ночи при 4 ° C. Образцы промывали 0,1 М какодилатом натрия и затем фиксировали в 1% OsO ₄ . в 0,1 М какодилате натрия в течение 1 ч. После фиксации образцы дегидратировали в серии градуированного ацетона и заливали в EPON. Полимеризацию проводили в течение 2 суток при 60 ° C. Тонкие срезы толщиной ~ 50 нм собирали на покрытые формваром медные щелевые сетки и окрашивали 4% уранилацетатом и цитратом свинца. Ячеистые срезы подробно исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа FEI Tecnai 20 при ускоряющем напряжении 200 кВ.

Результаты и обсуждение

Многофункциональные магнитные наночастицы были изготовлены путем выращивания слоя GaN на жертвенных наночастицах ZnO, легированных Fe ₂ О ₃ . После роста слоя GaN с использованием гидридной парофазной эпитаксии (HVPE) ядро ​​ZnO ​​разлагается. Полученные химически стабильные наночастицы состоят в основном из оболочки GaN с магнитными свойствами, связанными с диффузией атомов железа в осажденном GaN, а также с присутствием атомов Fe в тонкой пленке ZnO, легированной Fe ₂ О ₃ на внутренней поверхности оболочки GaN. Эти наночастицы были исследованы с помощью электронной микроскопии. После процесса роста GaN методом HVPE монокристаллические наночастицы с поперечными размерами от 20 до 100 нм остаются пространственно разделенными (рис. 1). Результаты исследования дифракции рентгеновских лучей и спектроскопии комбинационного рассеяния света (рис. 1c, d) наночастиц до и после роста GaN демонстрируют разложение ядра ZnO и образование наночастиц GaN. Химический анализ наночастиц, выполненный с помощью энергодисперсионного рентгеновского анализа (EDX), подтверждает рост слоя GaN и разложение ядра ZnO (рис. 1e, f). Обратите внимание, что полученный материал показывает относительно высокую (примерно 50%) концентрацию Fe по сравнению с исходными наночастицами.

Анализ наночастиц. а СЭМ-изображение наночастиц GaN, выращенных на жертвенных наночастицах ZnO, легированных Fe ₂ О ₃ . б ПЭМ-изображение полученных наночастиц GaN / Fe. c Рентгенограмма исходного ZnFe ₂ О ₄ наночастицы и образующийся GaN / ZnFe ₂ О ₄ наночастицы. г Рамановские спектры исходных и полученных наночастиц после роста GaN. е EDX-анализ ZnO, легированного Fe ₂ О ₃ наночастицы. е EDX-анализ полученных наночастиц после роста слоя GaN

Наночастицы на основе GaN / Fe инкубировали с первичными эндотелиальными клетками аорты свиньи. Как было показано ранее, наночастицы GaN переносятся эндотелиальными клетками в концентрациях менее 100 мкг / мл [5]. В процессе инкубации эндотелиальные клетки поглощают большую часть наночастиц в окружающей культуральной среде, поддерживая миграцию и пролиферацию клеток. Тем не менее мы заметили некоторое уменьшение количества жизнеспособных клеток с увеличением концентрации наночастиц в культуральной среде. Эта тенденция подтверждается результатами анализа XTT, представленными на рис. 2.

Влияние наночастиц на жизнеспособность клеток. Зависимое от концентрации снижение ХТТ, измеренное через 1 день инкубации клеток с различными концентрациями наночастиц. Количество клеток, подсчитанных в конце анализа XTT, выражается относительно необработанных клеток. Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение двух независимых экспериментов с шестью повторами

Чтобы понять, как наночастицы GaN / Fe взаимодействуют с клетками и определить их локализацию внутри клеток, мы провели тщательный морфологический анализ с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). После инкубации эндотелиальных клеток аорты свиньи с наночастицами 50 мкг / мл в течение 1 дня оказалось, что наночастицы локализуются в пузырьках внутри клеток (рис. 3а). Ни в цитоплазме, ни в ядре клетки наночастиц не обнаружено. Процесс поглощения наночастиц представлен на рис. 3b – d. Большинство наночастиц захватывается клетками одним из классических путей поглощения, а именно посредством микропиноцитоза, клатрин-опосредованного эндоцитоза или опосредованного кавеолином эндоцитоза [9]. Процесс интернализации зависит от типа клетки и местной клеточной среды, а также от физико-химических свойств самой частицы (например, размера, формы, заряда поверхности). В случае эндотелиальных клеток сообщалось, что кавеолин-опосредованный эндоцитоз оказывает большее влияние на поглощение наночастиц, чем другие механизмы, из-за большого количества кавеолина в этом типе клеток [10, 11].

ПЭМ-изображения, полученные от одной эндотелиальной клетки, инкубированной с наночастицами GaN / Fe. а Распределение наночастиц в клеточных пузырьках. б - г Процесс поглощения наночастиц везикулами. Красные стрелки указывают на наночастицы, которые кажутся темнее в ПЭМ из-за высокой атомной плотности по сравнению с биологической средой

Из-за вышеупомянутого включения большого количества Fe полученные наночастицы проявляют ферромагнетизм наряду с пьезоэлектричеством, присущим полупроводниковому материалу GaN [12, 13]. Эти два фундаментальных свойства можно использовать для удаленной активации некоторых процессов в наночастицах и / или их контролируемого направления и пространственного распределения в соответствующих средах. Пьезоэлектрические свойства могут быть использованы для индукции электрической поляризации в наночастицах GaN, например, с помощью приложенного ультразвукового поля. Таким образом, можно передавать электрические сигналы клеткам для активации или подавления определенных клеточных процессов. Что касается магнитных свойств, связанных с содержанием Fe, они позволяют достичь динамической визуализации и контроля пространственного положения клеток. Чтобы экспериментально продемонстрировать последнюю возможность, эндотелиальные клетки инкубировали в среде EGM ™ -2 с добавлением 50 мкг / мл наночастиц GaN / Fe в течение 3 дней (до 70–80% слияния клеток). Впоследствии клетки отделяли от поверхности и повторно суспендировали в EGM ™ -2. Обратите внимание, что отделение клеток с помощью TrypLE ™ Select и центрифугирование не повлияли на жизнеспособность клеток и не привели к высвобождению наночастиц из клеток (данные не показаны). Сразу после посева клетки инкубировали в стандартном инкубаторе при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ . , где культуральная пластина размещалась на постоянных магнитах. На рис. 4 показано распределение эндотелиальных клеток, нагруженных наночастицами, в присутствии и в отсутствие магнитного поля. На рис. 4а изображены клетки с наночастицами, инкубированные в отсутствие магнитного поля, а на рис. 4b эндотелиальные клетки без наночастиц инкубируются в магнитном поле. Эти изображения показывают случайное распределение клеток в обоих случаях. Инкубация клеток, нагруженных наночастицами, в градиенте магнитного поля приводит к заранее заданному распределению клеток в определенных областях в соответствии с картой магнитного поля. На рисунке 4c показаны клетки в культуральной пластине после 1 дня инкубации в магнитном поле, создаваемом семью круглыми магнитами из редкоземельного неодима диаметром 5 мм и толщиной 1 мм. На рисунке 4d показано распределение клеток после инкубации в магнитном поле, создаваемом одним кольцевым магнитом диаметром 7 мм и толщиной 1 мм. В обоих случаях магниты помещали под культуральную чашку.

Управление эндотелиальными клетками, нагруженными наночастицами, с помощью магнитного поля. Контрольная группа показывает пространственное распределение a эндотелиальные клетки, нацеленные на наночастицы и инкубированные в отсутствие магнитного поля и b Эндотелиальные клетки без наночастиц, инкубированные в магнитном поле. c , d Распределение эндотелиальных клеток, на которые нацелены наночастицы после 1 дня инкубации в магнитном поле

Выводы

Мы впервые продемонстрировали, что наночастицы на основе GaN / Fe, проявляющие магнитные свойства, захватываются эндотелиальными клетками и сохраняются внутри везикул. Эндотелиальные клетки, нагруженные наночастицами GaN / Fe, можно контролировать с помощью приложенных магнитных полей. Эти результаты открывают новые возможности для создания трехмерных тканей in vitro или для нацеливания клеток in vivo на участки повреждения тканей. Наряду с этим наличие в клетках наночастиц GaN с присущими им пьезоэлектрическими свойствами открывает путь к дистанционной электростимуляции клеточных биологических процессов. Этот многообещающий подход исследуется в наших лабораториях.

Сокращения

EDX:

Энергодисперсионный рентгеновский анализ

EGM ™ -2:

Среда с фактором роста эндотелия

Fe:

Утюг

Fe ₂ О ₃ :

Оксид железа (III)

GaN:

Нитрид галлия

GFP:

Белок зеленой флуоресценции

H ₂ :

Водород

HCl:

Хлороводород

NH ₃ :

Аммиак

OsO ₄ :

Четырехокись осмия

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером

SEM:

Сканирующая электронная микроскопия

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

XRD:

Рентгеновская дифракция

ZnO:

Оксид цинка