Магнитное управление эндотелиальными клетками in vitro с использованием наночастиц GaN/Fe

Аннотация

Мы сообщаем о синтезе и клеточном поглощении многофункциональных наночастиц GaN/Fe и демонстрируем их пригодность в качестве магнитных направляющих для эндотелиальных клеток. Частицы получают путем выращивания оболочки из GaN на ядрах ZnO/Fe₂O₃ методом газидинной фазовой эпитаксии (HVPE) с последующим разложением ядра при высокой температуре. Передаточная электронная микроскопия подтверждает, что эндотелиальные клетки свиной аорты внутренне поглощают наночастицы GaN/Fe в везикулы, не нарушая жизнеспособности клеток. Эти инертные, магнитореактивные частицы могут использоваться для управления клетками во внешних магнитных полях, открывая новую стратегию для адресной доставки клеток и тканевой инженерии.

Введение

Нанотехнологии стали мощным инструментом в онкологии, преимущественно через наночастицы-носители лекарств. Однако лигандное покрытие, инкапсуляция препаратов и ковалентное присоединение могут ограничивать эффективность доставки и вызывать опасения по безопасности. Альтернативная стратегия предполагает использование наночастиц как прямых биологических модуляторов — для таргетирования и направления самих клеток. Например, магнитные наночастицы могут направлять эндотелиальные клетки к участкам артериальной травмы под действием внешнего магнитного поля. Помимо терапевтических применений, такие управляемые клетки могут помочь при in vitro сортировке клеток и функционализации каркасов. Здесь мы представляем первые доказательства того, что эндотелиальные клетки могут внутренне поглощать наночастицы GaN/Fe, и что это поглощение обеспечивает контролируемое пространственное позиционирование клеток.

Методы

Синтез наночастиц

Тонкие слои GaN выращивали на наночастицах ZnO, легированных Fe₂O₃, двухступенчатым процессом HVPE. Начальный нуклеационный слой осаждали при 600 °C в течение 5 мин, затем проводили фазу роста при 800 °C в течение 10 мин для разложения ядра ZnO и улучшения кристаллического качества GaN. Процесс использовал металлический галлий, NH₃, HCl и H₂ в качестве переносных газов с расходами 20, 600 и 3500 сccm соответственно.

Клеточная культура

Первичные эндотелиальные клетки свиной аорты изолировали механическим скребком аорты, затем культивировали в среде EGM™-2 (Lonza) при 37 °C, 5% CO₂. Использовали проходы 3–8, клетки трансдуцировали GFP через лентивирус. Отachment клеток для экспериментов выполняли с помощью TrypLE™Select (1X) (Gibco®).

XTT-тест

Жизнеспособность клеток оценивали через 24 ч после добавления наночастиц. Реагент XTT (0,1 мл в 5 мл XTT) смешивали со свежей средой EGM2 (2:1) и инкубировали 4 ч при 37 °C, 5% CO₂. Абсорбцию измеряли на мультимодном считывателе Paradigm.

Подсчет клеток

Через 48 ч воздействия наночастиц клетки фиксировали в 4% параформальдегиде, промывали ФСБ и окрашивали DAPI (1:7500). Изображения захватывали из шести колодек на условие с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss и квантифицировали программой DotCount v1.2.

Передаточная электронная микроскопия

Клетки, инкубированные 24 ч с наночастицами GaN/Fe (50 мкг/мл), фиксировали в 2% глутаральдегиде/2% формальдегиде, постфиксировали в 1% OsO₄, дегидратировали и инкрустировали в EPON. Ультратонкие срезы (~50 нм) окрашивали 4% уранилацетатом и цитратом свинца, затем изучали на FEI Tecnai 20 (200 кВ).

Результаты и обсуждение

Наночастицы GaN/Fe были спроектированы путем покрытия ядер ZnO/Fe₂O₃ оболочкой GaN с последующим удалением ядра. Полученные частицы имеют оболочку GaN (~20–100 нм) со встроенным Fe, что придает магнитную чувствительность, сохраняя пьезоэлектрические свойства GaN. Анализы SEM, TEM, XRD, Raman и EDX подтверждают разложение ядра, рост GaN и содержание Fe ~50%.

При инкубации с эндотелиальными клетками свиной аорты наночастицы преимущественно внутренне поглощались в везикулы, без цитоплазматической или ядерной локализации. Поглощение происходило через классические пути — микропиноцитоз, клатрин- и кавеолин-медированный эндоцитоз, вероятно, с доминированием кавеол в эндотелиальных клетках. Тесты жизнеспособности выявили незначительное, концентрационно-зависимое снижение метаболической активности при 50 мкг/мл, в то время как более низкие дозы (<10 мкг/мл) сохраняли >90% жизнеспособности.

Благодаря высокой загрузке Fe частицы проявляют сильный ферромагнетизм, а оболочка GaN сохраняет пьезоэлектричность. Эти двойные свойства позволяют дистанционное воздействие через ультразвуковую поляризацию и магнитное манипулирование. Для подтверждения магнитного управления эндотелиальные клетки, загруженные 50 мкг/мл GaN/Fe, отachementировали, перевзвесили и посеяли на EGM™-2. Когда культурную пластину поместили под постоянные магниты, клетки продемонстрировали сильно неслучайное распределение, соответствующее карте магнитного поля, в то время как контрольные клетки распределялись случайно. Это демонстрирует, что наночастицы GaN/Fe могут использоваться для предсказуемого направления клеток.

Заключение

Мы установили, что наночастицы GaN/Fe безопасно внутренне поглощаются эндотелиальными клетками и накапливаются в везикулах. Их магнитная отзывчивость позволяет точное, поле-ориентированное позиционирование клеток, открывая пути для адресной доставки клеток и создания инженерных тканей. Кроме того, внутренняя пьезоэлектричность GaN предлагает платформу для дистанционной электрической стимуляции клеточных функций. Дальнейшая работа будет направлена на in vivo применения и интеграцию пьезоэлектрической активации для терапевтической модуляции.

Аббревиатуры

EDX:

Энергодисперсионный рентгеновский анализ

EGM™-2:

Среда для роста эндотелия 2

Fe:

Железо

Fe₂O₃:

Оксид железа (III)

GaN:

Нитрид галлия

GFP:

Зеленый флуоресцентный белок

H₂:

Водород

HCl:

Хлороводород

NH₃:

Аммиак

OsO₄:

Тетраоксид осмия

PBS:

Фосфатно-буферизованный раствор

SEM:

Раскладная электронная микроскопия

TEM:

Передаточная электронная микроскопия

XRD:

Рентгеновская дифракция

ZnO:

Оксид цинка