Золотые наночастицы, модифицированные 6-меркаптопурином и пептидом от бешенства, усиливают пролиферацию и вырост нейритов нейронных клеток SH-SY5Y

Аннотация

Нейрорегенерация требует биоматериалов, способных стимулировать нейронную пролиферацию и аксональный рост. Здесь мы представляем новую нейрофическую платформу: золотые наночастицы (AuNPs), функционализированные 6-меркаптопурином (6MP) и нейронно-проникающим пептидом (RDP). Когда нейробластомные клетки SH-SY5Y экспонировали 6MP-AuNPs-RDP конъюгатам, метаболическая активность и длина нейритов значительно увеличились по сравнению с контролями. Важно, клетки, восстановленные после криоконсервации, сохраняли эти преимущества роста, указывая на надежную толерантность к наноматериалу. Эти находки поддерживают развитие 6MP-AuNPs-RDP как безопасного и эффективного нейрофического наноматериала.

Введение

Эффективное стимулирование нейронной пролиферации и выроста нейритов — краеугольный камень регенеративных стратегий для нейродегенеративных расстройств таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и инсульт (1–4). Поверхностная химия биоматериалов может модулировать морфологию клеток, пролиферацию и дифференциацию, предлагая перспективный путь к нейрофическим агентам (5,6). Золотые наночастицы (AuNPs) стали привлекательными в биомедицинских приложениях благодаря легкому синтезу, поверхностной универсальности, низкой токсичности и биосовместимости (7,8). Предыдущая работа демонстрировала, что золотые наностержни в комбинации с низкоэнергетическим лазером могли удлинить нейриты NG108-15 клеток до 25 мкм (9).

6-Меркаптопурин (6MP) — противовоспалительное лекарство, связывающееся с AuNPs через Au–S связи, позволяя функционализацию (10). Хотя 6MP-AuNPs использовали для количественного сенсирования лекарств (11), их клеточные эффекты оставались неизведанными. Мы поэтому исследовали 6MP-AuNPs и нейрон-таргетный пептид (RDP) в модели человеческой нейробластомы SH-SY5Y, выбранной за ее высокую экологическую чувствительность и актуальность для исследований нейронных биоматериалов.

Методы / Эксперимент

Синтез 6MP-AuNPs-RDP конъюгата

20-нм цитрат-покрытые AuNPs готовили классическим Turkevich восстановлением HAuCl₄·3H₂O (0,01%) с натрий цитратом (38,8 мМ). 6MP (0,046 нМ) и AuNPs (0,33 мМ) инкубировали 5 ч при комнатной температуре, затем центрифугировали 17 000 g 30 мин. Осадок вымывали трижды деионизированной водой. Для RDP модификации пептид (0,023 нМ) ко-инкубировали с AuNP/6MP смесью при идентичных условиях. Скрамбл FAP-маркированный пептид (FAM-SP) служил контролем. Частицы ресуспендировали в 0,1 М NaOH (pH 9,0), фильтровали (0,22 мкм) и хранили при 4 °C.

Характеризация частиц

УФ/ВИС спектры записывали на Shimadzu UV-2450. Распределение размера и дзета-потенциал измеряли Malvern Zetasizer Nano ZS после разбавления. Трансмиссионная электронная микроскопия (TEM, Shimadzu) подтвердила сферическую морфологию.

Клеточная культура

SH-SY5Y клетки поддерживали в DMEM/F-12 (1:1) с 10% FCS, 100 Е/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 °C, 5% CO₂.

Анализ клеточного захвата

Клетки (5 × 10⁴ клеток/колонка) инкубировали с 0,25 мкг/мл FAM-маркированными 6MP-AuNPs-RDP или 6MP-AuNPs-SP 2 ч. Флуоресцентная микроскопия (Olympus) и спектрофлуориметрия (Hitachi) kvantифицировали внутренние.

Влияние на нейронный рост

Для пролиферации клетки посеяли 5 × 10⁵ клеток/колонка и лечили 0–1,0 мкг/мл 6MP-AuNPs-RDP 24 ч. Количество клеток (Bio-Rad автоматический счетчик) и MTT метаболическая активность (490 нм) оценивали. Длину нейритов измеряли после 3 дней ежедневного лечения 0,25 мкг/мл с ImageJ. Покрытые поверхностью чашки (3,5 см) также готовили для оценки выроста нейритов на наночастичном слое.

Статистический анализ

Данные (n = 4) выражаются как среднее ± SEM и анализируются односторонним ANOVA с тестом Даннета (SPSS 13.0). p < 0,05 обозначает значимость.

Результаты

Внешний вид наночастиц и физико-химические свойства

AuNPs демонстрировали красный цвет; при добавлении 6MP раствор темнел, образуя сине-черный осадок через 5 ч. Растворение при pH 9,0 давало розовый раствор, который снова выпадал при pH 7,4. DLS раскрыл средний диаметр 20,5 нм для 6MP-AuNPs и 24,6 нм для 6MP-AuNPs-RDP; дзета-потенциалы −37,2 мВ и −25,8 мВ соответственно (Рисунок 2c,d). TEM подтвердил сферическую морфологию.

Усиленный клеточный захват через RDP

При pH 7,4 6MP-AuNPs-RDP агрегировались меньше и демонстрировали выраженную периклеточную плаку, тогда как 6MP-AuNPs формировали обширные агрегаты (Рисунок 3а). Флуоресцентное изображение показало сильный внутриклеточный сигнал для 6MP-AuNPs-RDP по сравнению с слабым для 6MP-AuNPs-SP (Рисунок 3б-г), указывая, что RDP значительно увеличивает внутренние наночастицы.

Стимуляция пролиферации и метаболической активности

И 6MP-AuNPs, и 6MP-AuNPs-RDP увеличивали число клеток и MTT абсорбцию доза-зависимо; эффекты были сильнее для RDP-конъюгированных частиц (Рисунок 4а,б). Только RDP не изменял рост.

Улучшение выроста нейритов

После 24-часовой экспозиции 1,0 мкг/мл частиц клетки, обработанные 6MP-AuNPs-RDP, демонстрировали значительно более длинные нейриты, чем контролы и 6MP-AuNPs (Рисунок 5а,б). Только RDP не имел эффекта. При применении как поверхностное покрытие, 6MP-AuNPs-RDP ускорял вырост нейритов и облегчал внутренние по всему цитоплазме и ядру (Рисунок 6д,е).

Эффект криоконсервации

Клетки, предобработанные 1,0 мкг/мл 6MP-AuNPs-RDP, сохраняли усиленную пролиферацию и длину нейритов после разморозки, демонстрируя надежную толерантность к криогеническому хранению (Рисунок 7а-в).

Обсуждение

Данные подтверждают, что 6MP-AuNPs-RDP сочетает биосовместимость золотых наноструктур с нейронной способностью к захвату RDP и свойствами стимулирования роста экспонированного пуринового моети 6MP. Кислотно-основное поведение конъюгата (pI ≈ 7,8) согласуется с физиологическим pH, снижая агрегацию в клеточной среде. RDP вероятно медиации эндоцитозу через GABA или никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, согласуясь с предыдущими исследованиями пептид-функционализированных наночастиц (15–19). Пуриновые группы на поверхности наночастиц могут активировать MAPK/ERK и PI3K/Akt пути, ключевые регуляторы нейронной дифференциации и выроста нейритов (21–23). Важно, SH-SY5Y клетки толерируют повторную экспозицию и криоконсервацию, подчеркивая профиль безопасности платформы.

Заключение

Золотые наночастицы, функционализированные 6-меркаптопурином и пептидом от вируса бешенства RDP, составляют мощный нейрофический наноматериал, способствующий нейронной пролиферации и выросту нейритов при сохранении биосовместимости. Эти находки поддерживают дальнейшее развитие 6MP-AuNPs-RDP для терапевтических стратегий в нейрорегенерации.

Аббревиатуры

6MP

6-Меркаптопурин

AD

Болезнь Альцгеймера

AuNPs

Золотые наночастицы

DLS

Динамическое рассеяние света

DMEM

Модифицированная среда Эйгла Дюльбекко

DMSO

Диметилсульфоксид

FCS

Фетальная телячья сыворотка

MTT

3-(4,5-Диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид

PD

Болезнь Паркинсона

RDP

Пептид, производный от вируса бешенства

TEM

Трансмиссионная электронная микроскопия