Снижение цитотоксичности покрытий из наночастиц серебра с оксидом графена: улучшенная антибактериальная активность и биосовместимость нанокомпозита Ag–GO

Аннотация

Покрытия наночастицами серебра (AgNP) широко рассматриваются как перспективная альтернатива традиционным антибиотикам. Однако их высокая поверхностная реактивность вызывает опасения по безопасности в биомедицинских контекстах. Здесь сообщается, что интеграция оксида графена (GO) в покрытия AgNP существенно снижает цитотоксичность по отношению к человеческим фибробластам, эндотелиальным клеткам и хориоаллантоической мембране куриного эмбриона, одновременно усиливая антибактериальную активность против Salmonella enteritidis. Нанокомпозит Ag–GO продемонстрировал превосходное бактериальное подавление и заметно сниженное выделение воспалительных цитокинов, указывая на более безопасную наноплатформу для медицинских применений.

Введение

Антимикробные поверхности с наноматериалами — особенно наночастицами серебра — появляются как эффективные альтернативы традиционным антибиотикам и химическим дезинфектантам. Однако те свойства, что дают антибактериальную силу, также способствуют потенциальной цитотоксичности и иммуногенности, ограничивая клиническое применение. Ключевая стратегия снижения токсичности — надежная иммобилизация наночастиц на субстрате, ограничивающая их выделение при сохранении антимикробной функции. Ультразвуковые техники осаждения доказали эффективность для покрытий и формирования стабильных нанокомпозитов, таких как AgNP на оксиде графена (GO). Обильные кислородсодержащие функциональные группы GO способствуют сильным электростатическим или ковалентным связям с металлическими ионами, улучшая адгезию и уменьшая выщелачивание частиц. В исследовании гипотеза: полиуретановые фольги, покрытые композитом Ag–GO, покажут меньшую токсичность по сравнению с покрытиями только AgNP, без ущерба антибактериальной эффективности.

Результаты

AgNP и GO формируют стабильный нанокомпозит

TEM показал сферические AgNP (~55 нм), плотно прилегающие к листам GO (рис. 1а-е). Зета-потенциал показал, что гидроколлоид Ag–GO стабилизировался через 24 ч (−15,68 мВ до −27,7 мВ), тогда как AgNP в одиночестве оставались нестабильными (−31,11 мВ). Динамическое рассеяние света (DLS) указало Z-средний размер 1157 нм для композита, промежуточный между AgNP (93 нм) и GO (1485 нм), подтверждая успешную гибридизацию (рис. 1б,д,ф). Рамановская спектроскопия подтвердила характерные D (1347 см⁻¹) и G (1578 см⁻¹) полосы GO, с отношением I_D/I_G 1,34, указывая на сильно дефектированную, но функционализованную структуру (рис. 2а). FT-IR спектры дополнительно верифицировали наличие гидроксильных, карбоксильных и эпоксидных групп (рис. 2б).

Антибактериальная эффективность против Salmonella enteritidis

После 24-часовой инкубации при 37 °C все наноплатформы — AgNP, GO, Ag–GO — снизили бактериальный рост относительно непокрытых фолий. Композит Ag–GO достиг наиболее выраженного подавления, с >90% редукцией количества колонообразующих единиц по анализу PrestoBlue (рис. 3в). SEM выявил редкие бактериальные колонии и нарушения мембран на поверхностях Ag–GO, подтверждая контактно-опосредованное убийство (рис. 3б).

Сниженная цитотоксичность в человеческих клетках

Человеческие фибробласты и HUVECs культивировали непосредственно на каждой наноплатформе 24 ч. Тесты живучести показали 40–50% снижение на фолиях только с AgNP, в то время как GO и Ag–GO поверхности сохраняли живучесть, сопоставимую с непокрытыми контролями (рис. 4е,ф). Морфологическая оценка выявила, что покрытия AgNP вызывали выраженную агрегацию клеток, тогда как GO и Ag–GO способствовали нормальному расширению и морфологии (рис. 4а-д). Эти находки подчеркивают защитный эффект GO в композите.

Совместимость с хориоаллантоической мембраной

Прямой контакт наноплатформ с хориоаллантоической мембраной куриного эмбриона 48 ч выявил, что покрытия только AgNP вызывали потерю капилляров и шероховатость поверхности, тогда как GO и Ag–GO сохраняли гладкую, сосудистую морфологию, похожую на контроль (рис. 5б). Эта in-vivo-подобная модель подтверждает сниженную эндотелиальную токсичность, наблюдаемую in-vitro.

Модуляция выделения воспалительных цитокинов

Антителовый массив профилирования супернатантов фибробластов показал, что оба покрытия AgNP и Ag–GO заметно подавляли секрецию IL-8, тогда как GO в одиночестве не влиял (рис. 6а). Все наноплатформы снижали выделение IL-6, а GO/Ag–GO увеличивали продукцию TNF-β, предполагая сбалансированный воспалительный отклик. Остальные цитокины оставались неизменными, указывая на низкую иммуногенность композита.

Обсуждение

Наши данные подтверждают, что интеграция GO в покрытия AgNP не только усиливает бактерицидное действие, но также смягчает цитотоксичные и воспалительные ответы в человеческих клетках и позвоночной модели. Улучшенная стабильность AgNP в матрице GO вероятно ограничивает выделение ионов и отachement частиц, тем самым снижая клеточный захват и оксидативный стресс. Более того, больший размер композита (~1150 нм) снижает скорость эндоцитоза, как наблюдалось для других наноструктур, дополнительно понижая токсичность. Важно, что композит не провоцирует значительные цитокиновые бури, поддерживая нейтральный иммунологический профиль, необходимый для клинического перевода.

Эти находки согласуются с предыдущими отчетами о способности GO стабилизировать металлические наночастицы и уменьшать их выщелачивание, сохраняя — или даже усиливая — антимикробную мощность. Настоящая работа расширяет эту концепцию на реалистичный полимерный субстрат (полиуретановые фольги) и валидирует биосовместимость через множество типов клеток и in-vivo-подобную модель.

Заключение

Нанокомпозит Ag–GO превзошел как покрытия только AgNP, так и только GO по антибактериальной эффективности против Salmonella enteritidis и по снижению цитотоксичности к фибробластам, HUVECs и хориоаллантоической мембране. Сбалансированный цитокиновый профиль композита дополнительно подтверждает его пригодность для биомедицинских устройств, таких как раневые перевязки и покрытия имплантов. Будущая работа изучит долгосрочную стабильность, кинетику выделения и in-vivo модели инфекций для продвижения клинического внедрения.

Материалы и методы

Приготовление и характеризация наноплатформ

Полиуретановые фольги (15×15 мм, 0,05 мм) осаждали методом дип-коутинга в водных суспензиях AgNP (100 мг·л⁻¹), GO (200 мг·л⁻¹) или Ag–GO (200 мг·л⁻¹), приготовленных ультразвуком (20 кГц, 60% эффективность, 30 °C). Осажденные образцы промывали дионизированной водой и сушили в стерильных условиях. TEM, Раман, FT-IR, зета-потенциал и DLS подтвердили морфологию и стабильность каждой формуляции (детали в доп. материале).

Бактериальное культивирование и тест живучести

Salmonella enteritidis (ATCC 13076) выращивали на триптичной соевой агаре, собирали, количественно определяли OD₆₀₀ для достижения 5×10³ КОЕ·мл⁻¹ в бульоне MH. Фольги инкубировали с бактериями 24 ч при 37 °C. После инкубации бактериальная живучесть измеряли PrestoBlue, КОЕ подсчитывали серийным разведением и посевом.

Расканирующая электронная микроскопия

Бактериальные и клеточные образцы фиксировали 2,5% глютаральдегидом, контрастировали оксидом осмия, дегидратировали, критически-точечно сушили, спеттерировали золотом перед SEM при 15 кВ.

Культура человеческих клеток

HUVECs и фибробласты культивировали в низкосывороточных средах с добавками. Клетки посевали прямо на фольги (1×10⁴ клеток·мл⁻¹) и инкубировали 24 ч. Живучесть оценивали флуоресценцией PrestoBlue (λ_ex=560 нм, λ_em=590 нм). Морфологию изучали фазово-контрастной микроскопией.

Тест хориоаллантоической мембраны

Эмбрионы (день 8) экспонировали фольгам, помещенным на хориоаллантоическую мембрану 48 ч. Мембраны собирали, изображали стереоскопически, оценивали сосудистую целостность.

Антителовый массивный анализ

Супернатанты фибробластов (80 мкл на образец) пулировали, разбавляли, инкубировали на антителом массиве (Abcam, каталог ab134003) для количественного определения 40 воспалительных цитокинов. Сигналы детектировали HRP-конъюгированным стравидини и обрабатывали на ChemiDoc системе.

Статистический анализ

Данные анализировали однофакторным ANOVA и пост-хок тестом Тьюки (GraphPad Prism 8). Значимость устанавливали при p<0,05.