Зеленый синтез наночастиц металл-оксидов с гуммой карая и их экотоксикологическое воздействие на Chlamydomonas reinhardtii

Аннотация

Мы сообщаем об устойчивом пути производства наночастиц золота (Au), платины (Pt), палладия (Pd), серебра (Ag) и оксида меди (CuO) в воде с использованием натурального полимера гумма карая (GK) как восстановителя и стабилизатора. Коллоиды характеризовали UV-Vis, TEM, дзета-потенциал и DCS, подтвердив средние диаметры 42 нм (Au), 12 нм (Pt), 1,5 нм (Pd), 5 нм (Ag) и 180 нм (CuO) и отрицательные поверхностные заряды, сохранявшиеся 6 месяцев при 4 °C. Экспозиция зеленой водоросли *C. reinhardtii* концентрациям 1–20 мг/л этих НЧ показала, что Au и Pt оказывают минимальное подавление роста, тогда как Pd, Ag и CuO почти полностью подавляли пролиферацию водорослей и вызывали повреждение мембран, окислительный стресс, кенчинг хлорофилла и нарушение фотосистемы II. Выводы показывают, что GK-опосредованный зеленый синтез дает стабильные, экологически безвредные наноматериалы, которые можно адаптировать для селективных антимикробных или альгицидных применений.

Введение

Металл и металл-оксидные НЧ обладают уникальными электрическими, оптическими, магнитными и каталитическими свойствами, определяющими их широкое применение в промышленности, медицине, сельском хозяйстве и экологической ремедиации [1–4]. Конвенциональный синтез опирается на токсичные восстановители и поверхностно-активные вещества, вызывая опасения для здоровья людей и экологической целостности [5–11]. Подходы зеленой химии — с использованием возобновляемых, биоразлагаемых агентов и безвредных растворителей — предлагают безопасную альтернативу [12–18].

Гумма карая, гидроколлоид из деревьев *Sterculia*, содержит галاكتозу, рамнозу, галактонуровую кислоту и уроновые остатки [63]. Токсикологические исследования подтверждают ее нетоксичность, даже как пищевой добавки [62–65]. В этом исследовании мы используем функциональные группы GK (–OH, –COO⁻) для восстановления металлических солей и одновременной стабилизации образующихся НЧ, достигая одностаканового водного синтеза.

Несмотря на технологический потенциал, металл НЧ могут генерировать реактивные формы кислорода (РФК), повреждение ДНК и перекисное окисление липидов, потенциально нарушая микробные сообщества и высшие организмы [32–35]. Ранние работы показывали, что Ag, CuO и другие НЧ ингибируют рост водорослей, фотосинтез и целостность мембран [36–49]. Однако токсичность GK-полученных Au, Pt, Pd и CuO НЧ по отношению к моделирующей зеленой водоросли *C. reinhardtii* не изучалась системно.

Методы

Материалы

Коммерческая GK, AgNO₃, HAuCl₄·3H₂O, CuCl₂·2H₂O, H₂PtCl₆, K₂PdCl₄, HCl, NaOH, NH₄OH (Sigma‑Aldrich, США). Все реактивы аналитического класса, деионизированная вода (DI) для всех приготовлений.

Обработка гуммы карая

1 г GK диспергировали в 1 л DI воды, перемешивали всю ночь, затем выдерживали при 20 °C 18 ч для удаления нерастворимых примесей. Раствор фильтровали (10–16 мкм) и лиофилизировали.

Синтез НЧ

Для Au, Pt, Pd и Ag: 100 мкл 10 мМ металлической соли добавляли к 10 мл раствора GK в 50-мл колбах. pH корректировали для оптимизации выхода НЧ, затем смесь взбалтывали при 250 об/мин, 45–95 °C в течение 1 ч. Изменения цвета (желтое, вино-красное, черное) указывали на образование НЧ. CuO НЧ получали коллоидным термическим путем: 100 мкл 10 мМ CuCl₂·2H₂O смешивали с GK, молярное соотношение CuCl₂:NaOH = 2:5, нагревали при 75 °C, 250 об/мин 1 ч, затем осадок выделяли центрифугированием и промывали этанолом и DI водой.

Характеризация

ICP-MS (Perkin Elmer OPTIMA 2100 DV) количественно определял металл. UV-Vis спектры (Cintra 202) следили за плазмонными пиками и долгосрочной стабильностью. TEM (Tecnai F 12, 15 кВ) раскрывала морфологию и распределение размеров. В водорослевой среде дифференциальная центрифугационная седиментация (DC24000UHR) определяла массовое распределение размеров; дзета-потенциал измеряли Malvern Zetasizer ZS. Выделение ионов в водорослевой среде оценивали ультрафильтрацией (3 кДа отсев) с последующим ICP-MS.

Культура *C. reinhardtii*

Штамм CPCC11 выращивали в среде TAPx4 при 20 °C, 100 об/мин, освещенность 114,2 мкмоль м⁻² с⁻¹, поддерживая экспоненциальную фазу ≈10⁶ клеток/мл.

Эксперименты с экспозицией водорослей

НЧ (1, 5, 10, 20 мг/л) добавляли к 5 мл водорослевой суспензии в 50-мл флаконах. Рост, целостность мембран (пропидиев йодид), окислительный стресс (CellROX Green), хлорофилл-флуоресценция и квантовый выход фотосистемы II (AquaPen‑C AP‑C 100) мониторили в 1, 3, 5 и 24 ч. Контроли включали необработанные водоросли, термически убитые клетки и окислительный стресс, индуцированный кумином. Данные собирали в дубликате и анализировали ANOVA с тестом Даннета (GraphPad PRISM).

Результаты

Формирование НЧ и первичная характеризация

TEM-изображения (Рис. 1a–e) показали монодисперсные сферические НЧ. UV-Vis спектры (Рис. 1f) демонстрировали плазмонные пики на 412 нм (Au) и 525 нм (Ag); Pt, Pd и CuO не имели выраженных пиков. Через 6 месяцев спектры не менялись, подтверждая стабильность.

Характеризация в водорослевой среде

Массовые размеры варьировали от 180 до 5 нм (CuO > Au > Pt > Ag > Pd). Все НЧ имели отрицательный дзета-потенциал при pH 7 (Таблица 1). Ионные концентрации металлов были максимальны для Pt, Ag и CuO (33–36 мкг/л) и минимальны для Au и Pt (6–7 мкг/л).

Влияние на рост водорослей

Контрольный рост: 1 × 10⁶ клеток/ч. Экспозиция 1 мг/л Ag, Pd и CuO снизила рост до 2,2 × 10⁴, 1,7 × 10⁴ и 0,2 × 10⁴ клеток/ч соответственно (P < 0,001). При более высоких концентрациях рост прекращался полностью (Рис. 2). Au и Pt тоже замедляли рост, но эффекты платонировали независимо от дозы.

Индукция окислительного стресса

Ag и CuO НЧ индуцировали почти полную генерацию РОС (~100 %) при 5–20 мг/л (Рис. 3d, e). Au вызывал <10 % РОС, снижаясь до 15 % при 20 мг/л (P < 0,001). Pt давал <8 % РОС в течение 5 ч; при 20 мг/л 19 % стрессовых клеток через 24 ч. Ag НЧ давали 100 % стресс через 24 ч при 10–20 мг/л. CuO давал значительный стресс за 3 ч при 10–20 мг/л; 5 мг/л вызывал стресс через 5 ч. Au давал пренебрежимый абиотический РОС (P > 0,05).

Целостность мембран

Au и Pt вызывали значительное повреждение мембран во все моменты до 5 ч (P < 0,001), но не через 24 ч. Ag НЧ повреждали 100 % клеток за 1 ч при всех концентрациях. Pd НЧ показывали минимальное повреждение при 1–5 мг/л; 20 мг/л давали значительное повреждение через 24 ч. Повреждение CuO росло с дозой и временем, пик при 24 ч (Рис. 4).

Хлорофилл-флуоресценция

Au и Pt не оказывали значительного влияния на хлорофилл-флуоресценцию за 24 ч. Ag, Pd и CuO заметно снижали флуоресценцию при более высоких дозах и длительной экспозиции; 5 мг/л Ag снизили флуоресценцию до 22 % при 24 ч (P < 0,001). CuO и Pd при 20 мг/л давали наибольшее снижение через 24 ч (Рис. 5).

Эффективность фотосистемы II

Au, Pt и CuO давали незначительные, спорадические снижения квантового выхода (QY) в отдельные моменты. Ag НЧ вызывали драматическое падение QY (>90 %) через 1 ч при всех концентрациях. Pd и CuO значительно снижали QY только при 20 мг/л (Рис. 6).

Обсуждение

Наш GK-базированный синтез дал стабильные, монодисперсные Au, Pt, Pd, Ag и CuO НЧ, сохранявшие целостность 6 месяцев при 4 °C. Размер и поверхностная химия этих частиц сильно влияли на их биологическую активность. Au и Pt, с большими диаметрами (42 и 12 нм) и низким ионным выделением, демонстрировали минимальную токсичность, указывая на их пригодность для биомедицинских или каталитических применений, где критична биосовместимость. В противовес, Pd (1,5 нм), Ag (5 нм) и CuO (180 нм) были высокотоксичны для *C. reinhardtii*, что согласуется с их известной склонностью генерировать РОС, выделять ионы и разрушать мембраны. Сильный эффект Pd заметен; его ультрамалый размер вероятно облегчает клеточное поглощение и ионное выделение, объясняя наблюдаемый окислительный стресс и истощение хлорофилла.

Токсичность Ag НЧ согласуется с литературой, указывающей, что растворенные Ag⁺, а не сама наночастица, движет альгицидной активностью [80–89]. Наши GK-покрытые Ag НЧ показали мощное биоцидное действие, предполагая потенциал использования как альгицид в бассейнах или системах водоподготовки. CuO НЧ, вероятно, проявляли токсичность как через частицу-индуцированное нарушение мембран, так и через ионное выделение Cu²⁺, подтверждая предыдущие исследования на *C. reinhardtii* и других водорослях [36, 47, 48].

Au НЧ индуцировали лишь умеренный, транзиторный окислительный стресс и пренебрежимое физиологическое нарушение, поддерживая их классификацию как нетоксичных в этой водорослевой системе. Pt НЧ вызывали мягкое подавление роста и снижение хлорофилла, возможно, из-за комбинации ионного Pt и эффекта затенения частицами, но общая токсичность оставалась низкой.

Заключение

Мы успешно синтезировали зеленые Au, Pt, Pd, Ag и CuO НЧ с использованием гуммы карая, достигнув размеров 42, 12, 1,5, 5 и 180 нм соответственно, все с отрицательным поверхностным зарядом и стабильными 6 месяцев. Экспозиция *C. reinhardtii* этим НЧ показала, что Au и Pt были в основном безвредны, тогда как Pd, Ag и CuO оказывали сильные токсические эффекты на рост, целостность мембран, выработку РОС, хлорофилл-флуоресценцию и эффективность фотосистемы II. Эти результаты подчеркивают важность физико-химических свойств НЧ в диктовании экологического риска и подсвечивают перспективы GK-полученных Ag и CuO НЧ как целевых альгицидов, а Pd, Ag, CuO НЧ — для антимикробных покрытий, тогда как Au и Pt НЧ можно считать безопасными для экспозиции зеленых водорослей.