Синтез наночастиц SPIO и последующее применение в маркировке стволовых клеток при болезни Паркинсона

Введение

Болезнь Паркинсона - нейродегенеративное заболевание, которое характеризуется прогрессирующей потерей дофаминергических нейронов в среднем мозге. Относительно очаговое поражение делает его хорошим кандидатом для клеточной терапии. Несколько типов клеток, от ткани среднего мозга плода [1] до индуцированных нейронов, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ESC) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) [2], участвуют в лечении PD; однако во время применения нельзя было избежать этических проблем и потенциального риска онкогенности [3]. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой популяцию мультипотентных стволовых клеток, о которых в последнее десятилетие сообщалось как о многообещающем терапевтическом инструменте для лечения нейродегенеративного заболевания, включая БП [4, 5]. По сравнению с другими типами клеток, МСК демонстрируют хорошую пролиферацию, широкую доступность по всему человеческому организму и иммунорепрессивную способность. Некоторые исследования показали, что внутричерепная трансплантация МСК способствует нейропротекции, дифференцировке нейронов и иммуномодуляции [6,7,8]. В этих исследованиях отслеживание жизнеспособности, миграции и интеграции трансплантированных клеток in vivo имеет важное значение для базового понимания функции стволовых клеток и оценки клинической эффективности.

Чтобы лучше анализировать терапевтические эффекты пересаженных клеток, были разработаны различные индикаторы. Безопасность и эффективность индикаторов являются наиболее важными факторами, влияющими на их применение. По сравнению с маркировкой флуоресцентными белками [9], отслеживание с использованием суперпарамагнитных частиц оксида железа (SPIO) не привело бы к генетической модификации трансплантированных клеток [10,11,12]. В нескольких исследованиях SPIO использовался в качестве эффективного контрастного вещества для визуализации и отслеживания трансплантированных клеток [6, 13, 14]. Однако сообщалось, что некоторые из коммерчески доступных SPIO влияют на нормальные функции MSC [15,16,17]; поэтому были предприняты активные усилия по разработке новых SPIO. В настоящем исследовании мы синтезировали покрытие из сверхмалых наночастиц SPIO (USPIO) с полиакриловой кислотой (PAA) и последующим слоем метоксиполиэтиленгликоля (PEG). Новый USPIO-PAA / PEG демонстрирует хорошую интернализацию клеток и долгосрочную способность отслеживания МРТ in vitro и in vivo. Более того, меченные USPIO-PAA / PEG МСК, полученные из жировой ткани человека (HADSC), сохраняли биологические свойства, улучшая поведенческие нарушения и повышая иммунореактивность ТГ в черной субстанции моделей БП на животных.

Материалы и методы

Материалы

Ацетилацетонат железа, TREG (триэтиленгликоль), диэтиленгликоль и PEG были приобретены у Aladdin Industrial Corporation (Шанхай, Китай). Бромид метилтиазолилдифенилтетразолия (МТТ) был приобретен у Sigma-Aldrich Corporation (Шанхай, Китай). Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), трипсин – ЭДТА (0,25%) и фетальная бычья сыворотка (FBS) были приобретены в Thermo Fisher Scientific. Гидрохлорид 1- (3-диметиламинопропил) -3-этилкарбодиимида и N-гидроксисукцинимид были приобретены у Sigma-Aldrich (Китай). N, N-диметилформамид, абсолютный этиловый спирт и этилацетат были приобретены у Sinopharm Chemical Reagent Corporation. Сверхчистая вода производилась системами очистки чистой и сверхчистой воды Millipore. Античеловеческий CD90-FITC, античеловеческий CD45-PE, античеловеческий CD34-FITC и античеловеческий CD105-PE были приобретены у Biolegend.

Синтез USPIO

USPIO был синтезирован полиольным методом, как и в предыдущих исследованиях [18,19,20,21]. Этапы эксперимента заключаются в следующем:1 ммоль ацетилацетоната железа и 25 мл TREG смешивают в трехгорлой колбе, соединенной с аргоном, сферической конденсационной трубкой и термометром. После инкубирования в токе аргона в течение 15 минут смесь нагревали до 120 ℃ (скорость нагрева 3 ° C / мин) и выдерживали в течение 1 часа, а затем смесь нагревали до 250 ° C при той же скорости нагрева и выдерживали. на 30 мин. Реакционную смесь естественным образом охлаждали до комнатной температуры, разбавляли 2 мл абсолютного этилового спирта с последующим осаждением этилацетатом. Осадок собирали центрифугированием при 8000 об / мин в течение 20 мин, а затем ресуспендировали в абсолютном этиловом спирте. USPIO хранили в абсолютном этиловом спирте при 4 ° C для дальнейшего использования.

Приготовление USPIO с покрытием PAA / PEG

USPIO-PAA был приобретен в соответствии с предыдущим отчетом [22]. Более подробно, 1,5 г полиакриловой кислоты (PAA) растворяли в 24 мл диэтиленгликоля. После 5-минутного потока аргона смесь нагревали до 110 ° C и выдерживали до тех пор, пока раствор не стал прозрачным. Раствор для диспергирования в этаноле, содержащий 28 мг USPIO, полученный на предыдущем этапе, добавляли к вышеуказанному осветленному раствору после ультразвукового диспергирования. Наконец, раствор нагревали до 210 ° C со скоростью 3 ° C / мин. Реакцию останавливали после 2 ч кипячения с обратным холодильником и охлаждали естественным образом до комнатной температуры. После охлаждения к реакционному раствору добавляли этилацетат для осаждения НЧ USPIO, а затем центрифугировали при 8000 об / мин в течение 20 минут для удаления супернатанта. Затем осадок диспергировали в этаноле с последующим осаждением этилацетатом. После трехкратной промывки USPIO-PAA диспергировали в сверхчистой воде для дальнейшего использования. Чтобы улучшить биосовместимость, мы дополнительно связали ПЭГ с поверхностью наночастиц с помощью EDC и NHS-опосредованного амидирования [23]. 0,45 г ПЭГ растворяли в 5 мл сверхчистой воды и добавляли к 15 мл дисперсии USPIO-PAA (содержит 35 мг Fe) с добавлением 20 мг EDC и 12 мг NHS. Смесь механически перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем добавляли 10 мл растворителя ДМФ, удаляя воду при 40 ° С в роторном испарителе. Наконец, к смеси добавляли 40 мг DEC и 24 мг NHS, перемешивая при комнатной температуре в течение 48 часов. Реакционный раствор переносили в диализный мешок в сверхчистой воде на 72 часа, в течение которых сверхчистую воду заменяли каждые 12 часов. Затем смесь переносили в пробирку для ультрафильтрации для сбора молекул с Mr> 30 кДа центрифугированием при 4000 об / мин в течение 10 мин. Конечный продукт растворяли в сверхчистой воде и хранили при 4 ° C. В некоторых случаях растворенный в воде SPIO-PAA / PEG собирали центрифугированием с помощью центрифужной пробирки для ультрафильтрации (размер пор> 30 кД, Millipore), а гранулы сушили в вакуумной печи для дальнейшего эксперимента.

Характеристика НП

Размер частиц, гранулометрический состав и морфология образцов были проанализированы с помощью ПЭМ. Слой покрытия измеряли по отрицательному окрашиванию. После ультразвукового диспергирования USPIO-PAA и USPIO-PAA / PEG в водном растворе были добавлены к медной сетке углеродной поддерживающей мембраны 300 меш, высушены естественным путем и затем помещены в проекционный электронный микроскоп (Tecnai G2F20 s-twin, FEI) для наблюдения.

Инфракрасный спектроскопический анализ выполняется на FTIR-спектрометре Agilent Technologies Cary 600 Series, где высушенный порошок образца добавляется непосредственно в резервуар для образца для обнаружения.

Содержание Fe в дисперсии USPIO-PAA / PEG определяли с помощью пламенной атомно-абсорбционной спектрометрии (FAAS), моделью которой является PerkinElmer Analyst 700. Во-первых, стандартный раствор железа 1, 2, 3, 4 и 5 мкг / мл был настроен для получения стандартную кривую, а затем 100 мкл раствора дисперсии USPIO-PAA или USPIO-PAA / PEG растворяли в азотной кислоте и определяли содержание железа в мерной колбе на 50 мл.

Магнитно-резонансная томография наночастиц была проведена на клинических сканерах с магнитным полем 3 Тл в отделении визуализации первой дочерней больницы Университета Сучжоу. Наночастицы диспергировали в 1% растворе агарозного геля в соответствии с соответствующей концентрацией. После затвердевания раствора время поперечной релаксации образцов измеряли с помощью последовательности мультиэхо-сигналов. После экспорта данных МРТ в формат DICOM и последующего использования RadiAnt DICOM Viewer для открытия и считывания значения серого путем импорта значений серого для разных времен эхо-сигнала в исходную точку для подгонки были получены значения времени поперечной релаксации дисперсий USPIO с различными концентрациями.; наконец, скорость поперечной релаксации r2 образцов USPIO-PAA и USPIO-PAA / PEG была получена путем линейной аппроксимации со скоростью поперечной релаксации 1 / T2 и концентрацией Fe в образцах. Петли магнитного гистерезиса USPIO-PAA и USPIO-PAA / PEG были получены с использованием устройства Quantum Design DynaCool-9 в Университете науки и технологий Сучжоу в соответствии с методами, описанными ранее [24].

Изоляция и идентификация HADSC

Все исследования были выполнены в соответствии с «Руководящими этическими принципами исследования стволовых клеток человека» (Министерства науки и технологий и Министерства здравоохранения Китайской Народной Республики, 2003 г.) и Хельсинкской декларации. Образцы жира были получены с информированного согласия и этического одобрения в первой дочерней больнице Университета Сучжоу. Жировую ткань промывали и разрезали на мелкие кусочки после удаления кровеносных сосудов и соединительной ткани под анатомическим микроскопом. Блоки расщепляли коллагеназой типа I (0,3 pzu / мл) при 37 ° C в течение 30 минут с последующим центрифугированием при 500 g на 10 мин. Осадок клеток суспендировали в DMEM + 10% FBS и засевали плотностью 8 × 10 ⁴ . / см ² . Через 48 часов старую среду, содержащую плавающие клетки, выбросили и заменили свежей средой.

HADSC были охарактеризованы проточной цитометрией для определения поверхностных маркеров, специфически маркирующих мезенхимальные (CD90 и CD105) и гематопоэтические (CD34 и CD45) стволовые клетки. Всего было собрано 1 × 105 клеток и инкубировано с PE, FITC, APC / cy7 или PerCP-конъюгированными антителами против CD34, CD45, CD90 и CD105 мышиных моноклональных антител против человека и соответствующими контролями изотипа. Окрашенные клетки анализировали с использованием проточного цитометра (LSRFortessa, BD, США), а данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo. Четыре фенотипа CD90 +, CD105 +, CD34- и CD45- были отобраны для поверхностных маркеров HADSC. Уровни экспрессии маркеров клеточной поверхности определяли методом проточной цитометрии (BD LSRFortessa).

Адипогенную и остеогенную дифференцировку HADSC оценивали с помощью окрашивания Oil Red O и Alizarin Red Staining соответственно. HADSC культивировали либо со средой MesenCultTM Adipogenic Differentiation (Stem Cell Tech., 05412), либо с набором OriCellTM Osteogenic Differentiation Kit (Cyagen, HUXMA-90021). На предмет адипогенной дифференцировки HADSC клетки оценивали на 14 день качественным окрашиванием Oil Red O на липидно-заполненные зрелые адипоциты (VivaCell Biosciences, C37A00150). Для остеогенной дифференцировки HADSC клетки оценивали на 21 день с помощью окрашивания ализарином красным на предмет кальциевых узелков в зрелых остеоцитах (VivaCell Biosciences, C37C00150). Изображения были получены с помощью инвертированного микроскопа Nexcope.

Поглощение клетками USPIO-PAA / PEG in vitro и оценка биосовместимости

HADSC помещали в 6-луночный планшет плотностью 1 × 10 ⁶ . за колодец. Клетки инкубировали со средой, содержащей USPIO-PAA / PEG (Fe 10 мкг / мл и 0,1 мкг / мл), в течение 2 часов и окрашивали берлинской лазурью (PB) для идентификации внутриклеточного Fe.

Биосовместимость USPIO-PAA / PEG определяли с помощью колориметрии MTT и анализа включения 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) (набор для пролиферации EdU, Thermo). Для МТТ HADSC помещали в 96-луночный планшет с плотностью 5 × 10 ³ . на лунку и инкубировали с различными концентрациями (0, 10, 20, 40, 80, 160 Fe мкг / мл) USPIO-PAA / PEG 24 часа, 48 часов или 72 часа. В каждую лунку на 4 часа добавляли 20 мкл раствора МТТ (5 мг / мл), а затем 150 мкл диметилсульфоксида для растворения кристаллов. Величину поглощения каждой лунки измеряли при OD 570 нм, используя меченый ферментом прибор (BioTek Synergy HT). Для анализа EdU HADSC инкубировали с SPIO-PAA / PEG при 160 мкг / мл Fe в течение 72 часов с последующей инкубацией с 10 мкМ EdU в течение 24 часов. Клетки собирали, фиксировали 4% параформальдегидом и нейтрализовали глицином 2 мг / мл. После инкубации проницаемых клеток с раствором красителя (комплекс Azide 647) скорость включения EdU оценивали с помощью проточной цитометрии.

Модель частичного разряда, индуцированного 6-OHDA

Пятнадцать-двадцать самцов крыс Wistar (степень SPF, масса 220 ± 20 г) использовали для отслеживания in vivo HADSC, меченных USPIO-PAA / PEG, на животных с PD. Все процедуры были выполнены в соответствии с Положениями в Китае (Правила ведения дел, касающихся экспериментальных животных, 2017 г.) и одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Китайской академии наук. На протяжении всего времени животных содержали при контролируемом освещении (12/12 ч цикл свет / темнота, «включено» в 7 часов утра) с неограниченным доступом к пище и воде. Модель PD была приготовлена ​​путем 2-точечной инъекции 6-гидроксидофамина (6-OHDA, Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) в одностороннее полосатое тело крыс. Как описано ранее [25, 26], крысам стереотаксически вводили 3 мкл раствора 6-OHDA (5 мкг / мкл) в 2 координатах (AP:1,2 мм, ML:2,2 мм, DV:от 4,0 до 6,0 мм; и AP:- 1,0 мм, ML:4,4 мм, DV:- от 4,5 до 6,5 мм) соответственно. Тесты на вращение, индуцированное апоморфином (0,5 мг / кг, подкожно), использовали для проверки достоверности моделей PD. Крысам вводили апоморфин (0,5 мг / кг) подкожно через 1, 2 и 3 недели после обработки 6-OHDA, и показатели вращения оценивали в течение 30 минут в открытом поле. Модель БП имеет более 7 оборотов в минуту, индуцированных апоморфином, и была признана успешной.

Трансплантация клеток и МРТ in vivo

HADC инкубировали с USPIO-PAA / PEG (концентрация железа составляла 10 мкг / мл) в течение 2 ч, когда они достигли 80% слияния. Через 3 недели после изготовления модели PD, 3 × 10 ⁶ HADC, меченных USPIO-PAA / PEG, или физиологический раствор вводили в левое полосатое тело моделей крыс PD при следующих координатах (AP:1,2 мм, ML:2,2 мм, DV:от 4,0 до 6,0 мм). Животным, получившим трансплантацию, вводили бупренорфин (0,5 мг / кг) сразу после операции и в течение 2 дней после нее. Эти животные были подвергнуты тестам на вращение, вызванное апоморфином, через 1, 2 или 3 недели после операции по трансплантации.

Для МРТ in vivo животных визуализировали с помощью системы визуализации in vivo (IVIS) для мелких животных (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) на 3, 9, 15 и 21 день после инъекции физиологического раствора или HADSC.>

Гистологический анализ

Мозг оставшихся моделей крыс собирали и делали срезы толщиной 30 мм для анализа через 3 недели после трансплантации стволовых клеток ( n =5 на группу). Срезы инкубировали с антителом против тирозингидроксилазы (TH, abcam, England) и визуализировали с конъюгированными с Alexa-594 ослиными антителами против кроликов (Abcam). DAPI использовался для контрастирования с ядрами. Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SP5.

Статистический анализ

Числовые данные выражены как среднее ± стандартное отклонение. Данные были подвергнуты двустороннему t-критерию Стьюдента или однофакторному дисперсионному анализу с использованием GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США), чтобы оценить разницу. * обозначает p <0,05 и NS означает отсутствие существенной разницы.

Результаты

Синтез и характеристика наночастиц

Схема эксперимента показана на рис. 1. Гидрофобные НЧ USPIO были приготовлены с использованием метода термического разложения. Как показано на рис. 2a – c, диаметр исходных наночастиц USPIO составлял 4,07 ± 0,57 нм; при покрытии ПАК диаметр НЧ USPIO-PAA увеличивался до 6,34 ± 0,54 нм; дальнейшая модификация НЧ с помощью ПЭГ приводит к тому, что диаметр НЧ USPIO-PAA / PEG достигает 10,07 ± 0,55 нм. Все три наночастицы имели сферическую форму и равномерно распределены. Статистический анализ показал, что была значительная разница ( F =10, ** p <0,01, ## p <0,01) среди диаметров НЧ USPIO, USPIO-PAA и USPIO-PAA / PEG, что указывает на успешную модификацию с помощью PAA и PEG (рис. 2d).

Схематическое изображение экспериментального дизайна

Характеристика наночастиц. а – в Репрезентативные ПЭМ-изображения НП USPIO ( a ), НЧ USPIO-PAA ( b ) и НЧ USPIO-PAA / PEG ( c ). г Статистический анализ показал значительную разницу между размером частиц USPIO, USPIO-PAA и USPIO-PAA / PEG ( n =20 на группу). е Инфракрасное излучение с преобразованием Фурье наночастиц НЧ USPIO, USPIO-PAA и USPIO-PAA / PEG. Стрелки указывают на удельный пик поглощения при 1728 см ^-1 . за счет модификации PAA 1595 см ⁻¹ и 3440 см ⁻¹ за счет модификации ПЭГ. Числовые данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, ** p <0,01 по сравнению с НП USPIO, ## p <0,01 по сравнению с НЧ USPIO-PAA / PEG. Полоса соответствует 20 нм

Используя метод поглощения инфракрасного излучения, мы обнаружили, что USPIO-PAA имеет очевидный пик поглощения карбонила при 1728 см ^-1 . за счет пика валентного карбонильного колебания в молекуле ПАК; USPIO-PAA / PEG имеет пик изгибных колебаний связи углерод-азот в плоскости при 1595 см ^-1 . и пик валентного колебания гидроксильной группы при 3440 см ^-1 (Рис. 2д). Все эти данные дополнительно подтвердили, что молекулы ПАК или ПЭГ были успешно преобразованы на поверхность НЧ.

USPIO-PAA / PEG показал хороший магнитный ответ in vitro и биосовместимость с HADSC

Способность USPIO-PAA и USPIO-PAA / PEG к визуализации in vitro оценивалась по значениям шкалы серого на МРТ-изображениях при различных концентрациях (эквивалентных концентрациям Fe). После подгонки были получены значения времени поперечной релаксации дисперсий при различных концентрациях. Установив скорость поперечной релаксации 1 / T2 в качестве вертикальной координаты и концентрацию Fe в качестве горизонтальной координаты, скорость поперечной релаксации USPIO-PAA была рассчитана как 107,94 с ⁻¹ мм ⁻¹ (Рис. 3a) и 84,65 с ⁻¹ мм ⁻¹ для USPIO-PAA / PEG (рис. 3b). Обе частицы показали хорошие свойства МРТ. Петли магнитного гистерезиса SPIO-PAA и SPIO-PAA / PEG показали, что значение намагниченности насыщения SPIO-PAA составляет 57 emu / g выше 10000 Э (рис. 3c), а SPIO-PAA / PEG - 40 emu / g выше 10 000 Oe (рис. 3d). Коэрцитивная сила и остаточная намагниченность были близки к нулю (рис. 3c, d), что дополнительно указывает на то, что как SPIO-PAA, так и SPIO-PAA / PEG были суперпарамагнетизмом.

Магнитный отклик in vitro синтезированных НЧ USPIO-PAA и USPIO-PAA / PEG. а , b МРТ и скорость поперечной релаксации НЧ USPIO-PAA ( a ) и НЧ USPIO-PAA / PEG ( b ). г ₂ представляет скорость релаксации. Скорости релаксации НЧ USPIO-PAA и USPIO-PAA / PEG составляли 107,94 с ^-1 мМ ⁻¹ и 84,65 с ⁻¹ мМ ⁻¹ . c , d петли магнитного гистерезиса НЧ USPIO-PAA ( c ) и НЧ USPIO-PAA / PEG ( d ). Магнитный гистерезис измеряли при 295 К (21,85 ° C) с максимальной напряженностью магнитного поля 50 000 Э (5 Тлса). Значения намагниченности насыщения были близки к 57 ЭМЕ / г для SPIO-PAA и 40 ЭМЕ / г для SPIO-PAA / PEG. Гистерезис намагничивания на обеих кривых был близок к нулю

Инкубируя НЧ USPIO-PAA / PEG с HADSC в течение разного времени, мы обнаружили, что НЧ USPIO-PAA / PEG не оказывает значительного влияния на выживаемость клеток ( p > 0,05). Жизнеспособность клеток HADSC остается выше 96%, когда эквивалентная концентрация Fe находится в диапазоне от 0 до 160 мкг / мл. Более того, увеличение времени инкубации (с 24 до 72 часов) не вызывает значительной потери клеток при каждой концентрации Fe (рис. 4a). Аналогичное наблюдение было получено, когда НЧ USPIO-PAA / PEG инкубировали с ИПСК в различных концентрациях (рис. 4b). Несмотря на то, что HADSC обрабатывали 160 мкг Fe / мл USPIO-PAA / PEG в течение 72 часов, способность к пролиферации, на что указывают скорости включения EdU, не ухудшалась присутствием USPIO-PAA / PEG (фиг. 4c). Все эти данные указывают на биобезопасность синтезированных НЧ USPIO-PAA / PEG.

Синтезированные НЧ USPIO-PAA / PEG демонстрируют хорошую биосовместимость и способность мечения. а , b HADSC или ИПСК инкубировали с НЧ USPIO-PAA / PEG при различных концентрациях (эквивалентных концентрациям Fe при 0, 10, 20, 40, 80 и 160 мкг Fe / мл) в течение 24, 48 и 72 часов, а также жизнеспособности клеток. был определен методом MTT и показан на a , b , соответственно. Нет существенной разницы в жизнеспособности при разной концентрации НЧ ( n =5) или время инкубации ( n =5). c Анализ проточной цитометрии показал, что скорости включения EdU были аналогичными в HADSC, инкубированных в присутствии или в отсутствие USPIO-PAA / PEG (160 мкг Fe / мл в течение 72 часов). HADSC, не обработанные EdU, служили отрицательным контролем. г USPIO-PAA / PEG при 10 мкг Fe / мл и время инкубации в течение 2 ч привели к почти 100% эффективности мечения HADSC, как было оценено с помощью окрашивания берлинской синей. Обратите внимание, что USPIO-PAA / PEG в концентрации 0,1 мкг Fe / мл (время инкубации 2 ч) производил легкое, но однородное окрашивание PB в HADSC. Числовые данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Полоса соответствует 20 мкм

Чтобы определить, могут ли клетки быть эффективно помечены НЧ USPIO-PAA / PEG, мы инкубировали HADSC с НЧ USPIO-PAA / PEG при эквивалентном Fe 10 мкг / мл или 0,1 мкг / мл в течение 2 часов. Как показано на фиг. 4d, большое количество НЧ, окрашенных в синий цвет, наблюдали почти в 100% HADSC в присутствии USPIO-PAA / PEG (Fe 10 мкг / мл). Несмотря на то, что доза USPIO-PAA / PEG снизилась до 0,1 мкг Fe / мл, мы все же наблюдали довольно однородное и диспергированное окрашивание PB почти во всех HADSC. По сравнению с некоторыми другими описанными SPIO [14, 27, 28], USPIO-PAA / PEG продемонстрировал высокую эффективность поглощения клеток.

Долгосрочное отслеживание HADSC, меченных USPIO-PAA / PEG NPs, в моделях PD крыс

HADSC, меченные НЧ USPIO-PAA / PEG, трансплантировали в левое полосатое тело модели крысы PD путем стереотаксической инъекции. Как показано на рис. 5, мы наблюдали четкий сигнал МРТ в левом полосатом теле через 3 дня после трансплантации HADSC, что указывает на правильное отслеживание трансплантированных клеток in vivo. Динамическое наблюдение за D3, D9, D15 и D21 после трансплантации показало, что трансплантированные клетки с меткой NP можно было четко проследить до 3 недель, а сигналы МРТ не показали очевидного снижения во время процесса. Эти результаты показывают, что синтезированные наночастицы обладают хорошим потенциалом для отслеживания трансплантированных клеток in vivo.

Репрезентативные МРТ-изображения головного мозга через 3, 9, 15 и 21 день с последующей трансплантацией HADSC с меткой USPIO-PAA / PEG или физиологического раствора. Изображения МРТ соответствующих контролей, то есть нормальных крыс или модели крыс PD, которым вводили физиологический раствор, были показаны в 1-м и 2-м рядах соответственно. Обратите внимание, что по сравнению с отрицательными сигналами в контроле, мозг крыс, пересаженных HADSC, меченных USPIO-PAA / PEG, показал постоянные и четкие сигналы МРТ до 21 дня. Полоса соответствует 5 мм

HADSC, меченные USPIO-PAA / PEG, показали терапевтический эффект в модели БП

Чтобы оценить, проявляют ли меченные НЧ HADSC терапевтические эффекты, мы сначала провели фенотипическую характеристику изолированных HADSC. Как показано на фиг. 6а, культивируемые HADSC представляли собой веретенообразные клетки. Анализ проточной цитометрии показал, что HADSC были высокоэкспрессируемыми маркерами мезенхимальных клеток, такими как CD90 (> 99%) и CD105 (> 99%), тогда как немногие из них экспрессировали гематопоэтические маркеры, такие как CD34 и CD45 (рис. 6b – g). ). HADSC могли дифференцироваться в адипогенные или остеогенные клоны при определенных условиях, и способность к дифференцировке была показана с помощью окрашивания Oil Red O или Alizarin Red Staining, соответственно (фиг. 5h). Обратите внимание на липидные капли или кальцифицированные узелки в дифференцированных HADSC, тогда как в контрольных клетках HEK293 такой структуры нет (рис. 6h). Все это указывает на то, что HADSC удовлетворяют критериям мезенхимальных клеток.

Характеристика HADSC. а Репрезентативное изображение под микроскопом с контрастным выражением, показывающее, что HADSC имеют типичный веретенообразный фенотип. б – г HADSC инкубировали с антителами, конъюгированными с различными красителями, против маркеров CD45, CD105, CD34 и CD90, и подвергали анализу проточной цитометрией. Диаграммы рассеяния показаны на b, c . , а гистограммы показаны на d – g . Обратите внимание, что большинство клеток экспрессировали CD90 и CD105, но не CD34 и CD45. ч Адипогенную дифференцировку и остеогенную дифференцировку HADSC по сравнению с клетками HEK293 оценивают с помощью окрашивания Oil Red O или ализариновым красным окрашиванием соответственно. Полоса соответствует 20 мкм

Ротации, индуцированные апоморфином, составляли 17,1 ± 1,79, 28,7 ± 1,77 и 31,86 ± 1,72 в минуту на 1-й, 2-й и 3-й неделях после инъекции 6-OHDA, что подтверждает успешное создание модели БП у крыс. Как показано на рис. 7, число оборотов моделей крыс с PD снизилось до 32,59 ± 1,12, 31,85 ± 1,98 и 31,54 ± 1,73 на 1-й, 2-й и 3-й неделях с последующей трансплантацией HADSC, меченных НЧ, в полосатое тело на стороне поражения. Статистический анализ выявил значительную разницу между группами, получавшими физиологический раствор и HADSC, начиная со 2-й недели после операции по трансплантации ( p <0,01 на 2-й неделе, p <0,01 на 3-й неделе; нет =5 в каждой группе), что указывает на то, что HADSC, меченные NP, улучшают поведенческие нарушения в моделях PD.

В модели крыс PD вводили физиологический раствор или HADSC, меченные USPIO-PAA / PEG, в ипсилатеральное полосатое тело, поврежденное 6-OHDA, и количество оборотов в минуту оценивали и сравнивали. Наблюдается значительное снижение числа оборотов на 2-й, 3-й неделе после введения крысами PD, получавших HADSC, по сравнению с соответствующими крысами PD, получавшими физиологический раствор. нс указывает на незначительное изменение, а ** указывает на p <0,01. нет =5 для каждой группы

БП характеризуется потерей нейронов, экспрессирующих тирозингидроксилазу (ТГ) в черной субстанции. Используя иммуноокрашивание против TH, мы обнаружили, что 6-OHDA снижает количество TH-экспрессирующих нейронов в черной субстанции, и трансплантация HADSC в полосатое тело моделей PD крыс может облегчить такое снижение (рис. 8). В сочетании с наблюдением, что трансплантация клеток облегчает поведенческие нарушения у крыс PD, мы пришли к выводу, что HADSC, меченные USPIO-PAA / PEG NPs, оказывают терапевтическое действие на моделях PD крыс.

Immunostaining against TH in the substantia nigra of the rats receiving saline (a , d , г ), PD rats receiving saline (b , e , ч ) or PD rats receiving USPIO-PAA/PEG NPs-labeled HADSCs (c , f , я ). The area in the dashed frame indicates the compact area of substantia nigra (SNc) and the ventral tegmental area (VTA). Images in the boxes of d , e , f are enlarged and shown in g , ч , я , соответственно. There are less TH-expressing cells in the SNc and VTA regions in the rats receiving 6-OHDA injection, as compared to the controls receiving saline. Following by HADSC transplantation, more of TH-expressing cells in the SNc of PD rats could be observed. The bar represents 100 μm

Обсуждение

Cell therapy is a promising strategy for the treatment of neurodegenerative diseases and has been in the front edge of preclinical research over the last 20 years [29, 30]. Tracing the transplanted cells is an indispensable part for the clarification of underlying mechanisms as well as the evaluation of clinical effects; however, it is challenging and to some extent, hampered the application of cell therapy [31, 32]. Computed tomography (CT), near-infrared fluorescence imaging (NIFI) and MRI are the most commonly used methods for the in vivo tracking of transplanted cells [31, 32]. Compared to the rather high radiation of CT and low sensitivity of NIFI, MRI shows good imaging of deep tissue, high contrast and low ionizing radiation, making it a good candidate for the in vivo tracing [33,34,35,36]. The development of proper tracers for MRI therefore becomes an indispensable part of promoting the application of cell therapy.

SPIO is a simple and reliable labeling strategy for MRI visualization. To achieve long-term in vivo tracing of the transplanted cells, the SPIO particles is required to have a uniform and ultrasmall size, since large particles may lead to uneven distribution of the tracers and interfere with the normal blood circulation [33]. Moreover, the internalization efficiency and biocompatibility of nanoparticles are another important index to evaluate the tracers. Nanoparticles usually enter cells through liquid phase endocytosis [37], receptor-mediated endocytosis [38] and phagocytosis [39]. To achieve a better cellular uptake, the SPIO particles are usually modified with intermediate ligands [18, 40, 41].

Besides cell tracking, SPIO has also been applied for drug delivery [42]. The tissue distribution and pharmacokinetic clearance are important index for both applications. Compared to the NPs-PAA, NPs-PAA/PEG showed longer retention time in blood and slower urinary clearance [43]. NPs densely coated with PEG provide much more uniform distribution over mucosal epithelial surfaces, including the gastrointestinal tract [44], respiratory system [45, 46] and brain tumor [42], etc. Moreover, PEG coating reduces the attachment of proteins and formation of corona, which in turn might promote uniform distribution of the NPs at the cost of reduced uptake [47]. As a potential good diagnostic and therapeutic tool, the labeling capacity of SPIO-PAA/PEG to MSCs and its further application in brain disorders such as PD have not been well studied, and the present study was designed to answer this question. In the present study, we synthesized a novel ultrasmall USPIO-PAA/PEG nanoparticles, modifying the SPIO cores with PAA and PEG ligands, respectively. The USPIO-PAA/PEG NPs have uniform ultrasmall diameter (10.07 ± 0.55 nm), good dispersion in aqueous solution, biocompatibility with various cell types as well as good magnetic response effect in vitro and in vivo. Importantly, the signals of labeled HADSCs could be clearly detected under MRI after brain transplantation for up to three weeks, indicating the good potential for clinical application.

PD is characterized by a progressively loss of dopaminergic neurons in the substania nigra, and by the deficiency of dopaminergic levels in the dopaminergic networks [1]; the most affected one is the nigrostriatal pathway including the striatum. In the present study, we transplanted USPIO-PAA/PEG-labeled HADSCs into the striatum of PD rat models, and found that such transplantation improved the behavioral impairments; moreover, it attenuated the loss of dopaminergic neurons in the substania nigra to some extent. Similarly, Ardeshir et al. reported that transplanting the MSCs derived from rat adipose tissues attenuated apomorphine-induced rotations in PD models [48]. Different from transplanting fetal midbrain tissues [49] or dopaminergic neural progenitors [50], HADSCs exert its therapeutic effects mainly through the paracrine effects [51, 52], rather than substituting for the impaired tissues. Studies have shown that MSCs act as promoters of immunomodulation, neuroprotection and neuronal differentiation, and these effects are essentially mediated by the secretome released by MSCs [6, 7, 51]. Our result is consistent with these observations; moreover, it indicates that the novel USPIO-PAA/PEG tracers did not interfere with the neuroprotection effects of HADSCs.

Conclusions

We have developed a novel USPIO-PAA/PEG tracers showing high cell uptake efficiency, excellent biocompatibility and long-term MRI tracing capacities. The HADSCs labeled with USPIO-PAA/PEG could be traced with MRI for 3 weeks after cell transplantation. Moreover, the labeled HADSCs significantly attenuated the behavioral impairments of PD models, and increase the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra. The development of USPIO-PAA/PEG tracer may provide a promising tool in stem cell research and application.

Доступность данных и материалов

Все данные, подтверждающие выводы этой статьи, включены в статью.

Сокращения

SPIO:

Small superparamagnetic iron oxide

USPIO:

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide

PAA:

Полиакриловая кислота

PEG:

Methoxypolyethylene glycol amine

HADSCs:

Human adipose-derived stem cells

USPIO-PAA/PEG:

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles coating with the polyacrylic acid and methoxypolyethylene glycol amine

6-OHDA:

6-Hydroxydopamine

CT:

Компьютерная томография

NIFI:

Near infrared fluorescence imaging

МРТ:

Магнитно-резонансная томография

TH:

Tyrosine hydroxylase

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп