Ультрамалые суперпарамагнитные оксидно-железные наночастицы для трекинга стволовых клеток в терапии Паркинсона

Аннотация

Болезнь Паркинсона (ПД) характеризуется прогрессирующей потерей дофаминергических нейронов в среднем мозге, трансплантация стволовых клеток — перспективная стратегия лечения. Отслеживание биологического поведения трансплантированных клеток in vivo необходимо для понимания функции стволовых клеток и оценки клинической эффективности. Разработаны новые ультрамалые суперпарамагнитные оксидно-железные наночастицы (USPIO), покрытые полиакриловой кислотой (PAA) и метоксиполиэтиленгликоламином (PEG) методом термического разложения и двухступенчатой модификацией. USPIO-PAA/PEG имеют равномерный диаметр 10,07 ± 0,55 нм и характерные пики абсорбции лигандов (TEM, FTIR). MTT: выживаемость клеток с USPIO-PAA/PEG >96%. Синтезированные USPIO-PAA/PEG обладают хорошей релаксационной скоростью 84,65 с⁻¹ мМ⁻¹, что обеспечивает эффективный захват и трекинг МРТ. Первичные человеческие стволовые клетки из жировой ткани (HADSCs) были охарактеризованы, отмечены USPIO-PAA/PEG и трансплантированы в стриатум крыс с моделью ПД, индуцированной 6-гидроксидопамином (6-OHDA). Маркированные клетки отслеживались МРТ до 3 недель после трансплантации; трансплантация маркерованных HADSCs значимо снизила апоморфин-индуцированные вращения в модели ПД и увеличила число дофаминергических нейронов в субстанции черной. Разработка USPIO-PAA/PEG дает перспективный инструмент для in vivo трекинга клетковой терапии и новую стратегию отслеживания стволовых клеток с терапевтическим потенциалом при ПД.

Введение

Болезнь Паркинсона — нейродегенеративное заболевание с прогрессирующей потерей дофаминергических нейронов в среднем мозге. Фокальное поражение делает ее хорошей мишенью для клетковой терапии. Различные типы клеток: ткань фетального среднего мозга, индуцированные нейроны из эмбриональных стволовых клеток (ESC) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), но этические проблемы и риск туморигенности. Месенхимальные стволовые клетки (MSC) — мультипотентная популяция, перспективна для нейродегенеративных заболеваний, включая ПД. MSC хорошо пролиферируют, широко доступны в теле, обладают иммуносупрессивной способностью. Внутрьчерепная трансплантация MSC способствует нейропротекции, нейронной дифференциации и иммуномодуляции. Отслеживание живучести, миграции и интеграции трансплантированных клеток in vivo необходимо для понимания функции и оценки эффективности.

Различные трекеры для анализа терапевтических эффектов. Безопасность и эффективность трекеров — ключевые факторы. По сравнению с флуоресцентными белками, трекинг суперпарамагнитными оксидами железа (SPIO) не вносит генетических модификаций. Несколько работ использовали SPIO как эффективный контрастный агент для визуализации и трекинга. Однако некоторые коммерческие SPIO влияют на нормальные функции MSC, поэтому разрабатывают новые SPIO. В работе синтезирован ультрамалый SPIO (USPIO) с покрытием PAA и последующим PEG-слоем. Новый USPIO-PAA/PEG показывает хорошую клеточную интернализацию и долгосрочный МРТ-трекинг in vitro и in vivo. Более того, USPIO-PAA/PEG-маркированные MSC из человеческой жировой ткани (HADSCs) сохраняют биологические свойства, улучшают поведенческие нарушения и увеличивают TH-иммунореактивность в субстанции черной моделей ПД.

Материалы и методы

Материалы

Железо-ацетилацetonат, TREG (триэтиленгликоль), диэтиленгликоль, PEG — Aladdin Industrial Corp. (Шанхай). MTT — Sigma-Aldrich (Шанхай). DMEM, трипсин-EDTA (0,25%), ФБС — Thermo Fisher Scientific. EDC·HCl и NHS — Sigma-Aldrich (Китай). DMF, абсолютный этанол, этилацетат — Sinopharm Chemical Reagent. Ультрачистая вода — Millipore. Антитела CD90-FITC, CD45-PE, CD34-FITC, CD105-PE — Biolegend.

Синтез USPIO

Метод полиолей. Железо-ацетилацetonат 1 ммоль + TREG 25 мл в трехшейном колбе с аргоном, рефлюксным конденсатором, термометром. Аргон 15 мин, нагрев до 120 °C (3 °C/мин) 1 ч, затем до 250 °C (та же скорость) 30 мин. Естественное охлаждение, разбавление 2 мл абс. этанолом, осаждение этилацетатом. Центрифуга 8000 об/мин 20 мин, ресуспензия в абс. этаноле. Хранение при 4 °C.

Подготовка USPIO с покрытием PAA/PEG

USPIO-PAA по протоколу [22]. PAA 1,5 г в 24 мл диэтиленгликоля, аргон 5 мин, нагрев до 110 °C до прозрачности. Этанольовая дисперсия 28 мг USPIO (после ультразвука) добавлена в раствор. Нагрев до 210 °C (3 °C/мин), рефлюкс 2 ч. Охлаждение, осаждение этилацетатом, центрифуга 8000 об/мин 20 мин. Осадок разобрали в этаноле, повторное осаждение этилацетатом. Три цикла промывки. USPIO-PAA в ультрачистой воде.

Для биосовместимости прикрепили PEG через EDC/NHS-амидацию [23]. PEG 0,45 г в 5 мл воды добавили к 15 мл USPIO-PAA (35 мг Fe) с 20 мг EDC и 12 мг NHS. Механическое перемешивание комнатной температуре 2 ч. Добавление 10 мл DMF, удаление воды при 40 °C в ротационном испарителе. Добавление 40 мг EDC и 24 мг NHS, перемешивание 48 ч. Диализ в ультрачистой воде 72 ч (замена воды каждые 12 ч). Ультрафильтрация (MWCO >30 кДа) центрифугой 4000 об/мин 10 мин. Продукт в ультрачистой воде, 4 °C. В некоторых случаях сбор в ультрафильтрационной трубке, сушка в вакуумной печи.

Характеризация наночастиц

Размер, распределение, морфология — TEM. Покрывающий слой — негативное контрастирование. После ультразвуковой дисперсии USPIO-PAA и USPIO-PAA/PEG в воде на мединую сетку 300 ячеек с углеродной пленкой, сушка, проекционный электронный микроскоп (Tecnai G2F20 s-twin, FEI).

ИК-спектроскопия — Agilent Cary 600 FTIR, сухой порошок в пробнике.

Содержание Fe — пламенная атомная абсорбционная спектрометрия (FAAS, PerkinElmer Analyst 700). Стандартная кривая 1–5 мкг/мл Fe, затем 100 мкл дисперсии растворено в азотной кислоте, определение в 50-мл мерительном колбе.

МРТ наночастиц — клинические сканеры 3 Т (Первая аффилированная больница Сучоу). Дисперсии в 1% агарозном геле по концентрациям. После застывания измеряли поперечное релаксационное время многоэховым методом. Экспорт DICOM, RadiAnt DICOM Viewer, чтение серых значений, аппроксимация в Origin для T2 при разных концентрациях. Поперечная релаксационная скорость r2 по линейной аппроксимации 1/T2 vs концентрация Fe. Магнитные гистерезисные петли — Quantum Design DynaCool-9 (Сучоуский ун-т науки и технологий).

Изоляция и идентификация HADSCs

Согласно этическим принципам (Миннауки и Минздрав КНР, 2003) и Декларации Хельсинки. Жировая ткань с информированным согласием и этическим одобрением (Первая аффилированная больница Сучоу). Ткань промыли, разрезали мелко после удаления сосудов и соединительной ткани под анатомическим микроскопом. Блоки переварили коллагеназой I (0,3 PЗU/мл) 37 °C 30 мин, центрифуга 500g 10 мин. Пеллет в DMEM + 10% ФБС, посадка 8×10⁴/см². Через 48 ч старая среда с плавающими клетками заменена на свежую.

Характеризация HADSCs потоковой цитометрией: маркеры мезенхимальных (CD90, CD105) и гематопоэтических (CD34, CD45) стволовых клеток. 1×10⁵ клеток инкубировали с PE, FITC, APC/Cy7, PerCP-конъюгированными антителами против CD34, CD45, CD90, CD105 и изотипными контролями. Анализ на цитометре (LSRFortessa, BD, USA), ПО FlowJo. Фенотипы CD90+, CD105+, CD34−, CD45− выбраны как маркеры HADSCs.

Адипогенное и остеогенное дифференцирование: Oil Red O и Alizarin Red окраска. Среды MesenCult Adipogenic (Stem cell Tech.) и OriCell Osteogenic Kit (Cyagen). Оценка 14-й день (Oil Red O) и 21-й день (Alizarin Red). Изображения инвертированным микроскопом Nexcope.

In vitro клеточный захват USPIO-PAA/PEG и биосовместимость

HADSCs в 6-колодках 1×10⁶/колодка. Инкубация с USPIO-PAA/PEG (Fe 10 мкг/мл и 0,1 мкг/мл) 2 ч, окраска Прússки-синим (PB) для внутриклеточного Fe.

Биосовместимость: MTT и EdU-инкорпорация (EdU proliferation kit, Thermo). MTT: HADSCs в 96-колодках 5×10³/колодка, инкубация с USPIO-PAA/PEG (Fe 0, 10, 20, 40, 80, 160 мкг/мл) 24, 48, 72 ч. 20 мкл MTT (5 мг/мл) 4 ч, 150 мкл DMSO для растворения кристаллов. Абсорбция OD 570 нм (BioTek Synergy HT). EdU: HADSCs с 160 мкг Fe/мл USPIO-PAA/PEG 72 ч, затем 10 мкМ EdU 24 ч. Фиксация 4% PFA, нейтрализация 2 мг/мл глицином, проницаемость, инкубация с красителем (Azide 647 complex), анализ потоковой цитометрией.

Модель ПД, индуцированная 6-OHDA

15–20 самцов вистара (SPF, 220±20 г) для in vivo трекинга USPIO-PAA/PEG-маркированных HADSCs на моделях ПД. Согласно Регламенту КНР (2017), одобрено IACUC Китайской академии наук. Условия: 12/12 ч свет/тьма, еда и вода ad libitum. Модель ПД: двухточечная инъекция 6-OHDA (Sigma) в уникарный стриатум. Стереотаксическая инъекция 3 мкл 6-OHDA (5 мкг/мкл) в две координаты (AP: 1,2 мм, ML: 2,2 мм, DV: −4,0 до −6,0 мм; AP: −1,0 мм, ML: 4,4 мм, DV: −4,5 до −6,5 мм). Тест апоморфин-индуцированных вращений (0,5 мг/кг, подкожно) для валидации модели. Инъекции апоморфина на 1, 2, 3 недели после 6-OHDA, оценка вращений 30 мин в открытом поле. >7 вращ/мин — успешная модель.

Трансплантация клеток и in vivo МРТ

HADSCs инкубировали с USPIO-PAA/PEG (Fe 10 мкг/мл) 2 ч при 80% конфлюенции. Через 3 недели после модели ПД: 3×10⁶ USPIO-PAA/PEG-маркированных HADSCs или физраствор в левый стриатум (AP: 1,2 мм, ML: 2,2 мм, DV: −4,0 до −6,0 мм). Бупренорфин (0,5 мг/кг) сразу после операции и 2 дня. Тесты апоморфин-вращений на 1, 2, 3 недели после трансплантации.

In vivo МРТ: система визуализации малых животных IVIS (PerkinElmer) на 3, 9, 15, 21 день после инъекции физраствора или HADSCs.

Гистологический анализ

Мозги крыс извлекали, сечения 30 мкм толщиной на 3-ю неделю после трансплантации (n=5 на группу). Инкубация с анти-TH (abcam) и визуализация Alexa-594 donkey anti-rabbit (Abcam). DAPI для контрконтраста ядер. Конфокальный микроскоп Leica TCS SP5.

Статистический анализ

Данные как mean ± SD. Двусторонний t-тьюдента или однофакторный ANOVA (GraphPad Prism 7.0). * — p<0,05, NS — незначимо.

Результаты

Синтез и характеристика наночастиц

Экспериментальный дизайн (рис. 1). Гидрофобные USPIO методом термического разложения. Рис. 2a–c: исходные USPIO — 4,07 ± 0,57 нм; после PAA — 6,34 ± 0,54 нм; после PEG — 10,07 ± 0,55 нм. Все сферические, равномерно диспергированы. Статистика: значимая разница (F=10, **p<0,01, ##p<0,01) между диаметрами USPIO, USPIO-PAA, USPIO-PAA/PEG — успешная модификация (рис. 2d).

FTIR (рис. 2e): USPIO-PAA — карбонильный пик 1728 см⁻¹ (валентные колебания C=O в PAA). USPIO-PAA/PEG — пик C-N в-plane bending 1595 см⁻¹ и валентный пик OH 3440 см⁻¹ (PEG). Подтверждает успешную модификацию PAA и PEG.

Хороший in vitro магнитный отклик и биосовместимость USPIO-PAA/PEG с HADSC

Способность к МРТ-образованию оценивали по серым значениям МРТ при разных концентрациях (эквивалент Fe). После аппроксимации получили T2. График 1/T2 vs концентрация Fe: релаксационная скорость USPIO-PAA = 107,94 с⁻¹ мМ⁻¹ (рис. 3a), USPIO-PAA/PEG = 84,65 с⁻¹ мМ⁻¹ (рис. 3b). Оба показывают хорошие МРТ-свойства. Магнитные гистерезисные петли (рис. 3c,d): насыщенная намагниченность SPIO-PAA ~57 эму/г выше 10 000 Э, SPIO-PAA/PEG ~40 эму/г. Коэрцитивная сила и остаточная намагниченность близки к нулю — суперпарамагнетизм.

Инкубация USPIO-PAA/PEG с HADSCs разное время: нет значимого влияния на выживаемость (p>0,05). Выживаемость >96% при Fe 0–160 мкг/мл. Увеличение времени инкубации (24–72 ч) не вызывает значимых потерь при каждой концентрации (рис. 4a). Аналогично для iPSC (рис. 4b). Даже при 160 мкг Fe/мл 72 ч пролиферативная способность (EdU-инкорпорация) не нарушена (рис. 4c). Все данные подтверждают биобезопасность USPIO-PAA/PEG.

Эффективность маркировки: инкубация HADSCs с USPIO-PAA/PEG (Fe 10 мкг/мл или 0,1 мкг/мл) 2 ч. Рис. 4d: при 10 мкг/мл — почти 100% клеток с синими гранулами (PB-окраска). Даже при 0,1 мкг/мл — равномерное слабое PB-окрашивание почти во всех HADSCs. По сравнению с другими SPIO [14, 27, 28], USPIO-PAA/PEG показывает высокую эффективность клеточного захвата.

Долгосрочный трекинг USPIO-PAA/PEG-маркированных HADSCs в моделях ПД

HADSCs с USPIO-PAA/PEG трансплантировали в левый стриатум ПД-модели стереотаксически. Рис. 5: четкий МРТ-сигнал в левом стриатуме на 3-й день после трансплантации — правильный in vivo трекинг. Динамическое наблюдение на 3, 9, 15, 21 день: маркированные клетки четко детектируются до 3 недель, МРТ-сигналы не снижаются. Синтезированные наночастицы имеют хороший потенциал для in vivo трекинга трансплантированных клеток.

Терапевтический эффект USPIO-PAA/PEG-маркированных HADSCs в модели ПД

Фенотипическая характеристика HADSCs (рис. 6a): спиндлевидные клетки. Потоковая цитометрия (рис. 6b–g): высокая экспрессия мезенхимальных маркеров CD90 (>99%) и CD105 (>99%), низкая — гематопоэтических CD34, CD45. Дифференциация в адипогенную и остеогенную линиины: Oil Red O и Alizarin Red (рис. 6h) — липидные капли и окальцинированные нодули в дифференцированных HADSCs, отсутствуют в контроле HEK293. HADSCs соответствуют критериям мезенхимальных стволовых клеток.

Апоморфин-вращения: 17,1±1,79; 28,7±1,77; 31,86±1,72 об/мин на 1, 2, 3 неделю после 6-OHDA — успешная модель. Рис. 7: после трансплантации USPIO-PAA/PEG-HADSCs вращения снизились до 32,59±1,12; 31,85±1,98; 31,54±1,73 на 1, 2, 3 неделю. Статистика: значимая разница между физраствором и HADSCs со 2-й недели (p<0,01 на 2-й и 3-й неделях; n=5) — HADSCs улучшают поведенческие нарушения в модели ПД.

ПД характеризуется потерей TH-экспрессирующих нейронов в субстанции черной. Иммунохимия против TH (рис. 8): 6-OHDA снижает TH-клетки в субстанции черной, трансплантация HADSCs в стриатум atenуирует это снижение. В сочетании с улучшением поведения — USPIO-PAA/PEG-маркированные HADSCs оказывают терапевтический эффект в модели ПД.

Обсуждение

Клетковая терапия — перспективная стратегия для нейродегенеративных заболеваний, на передовой преклинических исследований последние 20 лет. Трекинг трансплантированных клеток — незаменимая часть для понимания механизмов и оценки клинических эффектов, но сложна и тормозит применение. CT, ближняя ИК-флуоресценция (NIFI), МРТ — основные методы in vivo трекинга. МРТ лучше: хорошая визуализация глубоких тканей, высокий контраст, низкое ионизирующее излучение. Разработка подходящих трекеров для МРТ — ключ к продвижению клетковой терапии.

SPIO — простая надежная стратегия маркировки для МРТ. Для долгосрочного in vivo трекинга SPIO должны быть равномерными и ультрамалыми, так как крупные частицы дают неравномерное распределение и мешают кровообращению. Важны также эффективность интернализации и биосовместимость. Наночастицы входят в клетки через фагоцитоз, рецептор-медированный эндоцитоз, жидкостной фазовый эндоцитоз. Для лучшего захвата SPIO модифицируют промежуточными лигандами.

Кроме трекинга, SPIO применяют для доставки лекарств. Тканевое распределение и фармакоклинетический клиренс важны для обоих. По сравнению с NPs-PAA, NPs-PAA/PEG показывают более длительное удержание в крови и более медленный мочевой клиренс. Плотное PEG-покрытие дает более равномерное распределение по слизистым эпителиям (ЖКТ, дыхательная система, мозговые опухоли). PEG снижает адсорбцию белков и образование короны, способствуя равномерному распределению ценой снижения захвата. Как потенциальный диагностический и терапевтический инструмент, маркировочная способность SPIO-PAA/PEG к MSC и применение при мозговых заболеваниях (ПД) мало изучены — данная работа отвечает на этот вопрос. Синтезирован новый ультрамалый USPIO-PAA/PEG, модифицированный PAA и PEG лигандами. USPIO-PAA/PEG: равномерный ультрамалый диаметр (10,07±0,55 нм), хорошая дисперсность в воде, биосовместимость с различными клетками, хороший магнитный отклик in vitro и in vivo. Важно: сигналы маркированных HADSCs четко детектируются МРТ после трансплантации в мозг до 3 недель — хороший потенциал для клинического применения.

ПД: прогрессирующая потеря дофаминергических нейронов в субстанции черной, дефицит дофамина в нигростратальном пути (включая стриатум). В работе трансплантировали USPIO-PAA/PEG-HADSCs в стриатум ПД-моделей — улучшили поведенческие нарушения, atenуировали потерю дофаминергических нейронов в субстанции черной. Аналогично Ardeshir et al.: трансплантация MSC из крысьей жировой ткани снизила апоморфин-вращения. В отличие от фетальной ткани или дофаминергических прогенторов, HADSCs действуют преимущественно через паракринные эффекты, а не замещением тканей. MSC способствуют иммуномодуляции, нейропротекции, нейронной дифференциации через секретом. Наши результаты согласуются; новый трекер USPIO-PAA/PEG не мешает нейропротективным эффектам HADSCs.

Заключение

Разработан новый трекер USPIO-PAA/PEG с высокой эффективностью клеточного захвата, отличной биосовместимостью и долгосрочной МРТ-трассировкой. HADSCs, отмеченные USPIO-PAA/PEG, отслеживались МРТ 3 недели после трансплантации. Маркированные HADSCs значимо atenуировали поведенческие нарушения моделей ПД и увеличили число дофаминергических нейронов в субстанции черной. Разработка USPIO-PAA/PEG может дать перспективный инструмент в исследовании и применении стволовых клеток.