Изготовление, характеристика и цитотоксичность сферических конъюгированных наночастиц карбоната кальция, полученных из оболочки золота и ракушки, для биомедицинских приложений

Фон

Производство монодисперсных наночастиц стало важным в электронных, оптических, биомедицинских и магнитных приложениях [1,2,3,4]. Их эволюция и эволюция биоматериалов позволили улучшить фармацевтические препараты [5], биомедицинские системы [6], системы доставки лекарств [7], косметику и очистку воды [7,8,9]. В том же отношении разработка конъюгированных материалов, которые являются биосовместимыми, биогенными и нетоксичными, может внести ценный вклад в области бионауки и биомедицины [10]. Кроме того, биосовместимые био- и наноматериалы с металлическими конъюгатами могут способствовать большему количеству научных достижений в биомедицинских приложениях, таких как тканевая инженерия [5], терапия [11] и доставка лекарств [12]. Это было подробно показано в недавних работах, таких как использование инъекционного самособирающегося гибридного гидрогеля коллаген-золото [13], наноконъюгатов коллоидное золото-коллаген-ядро-оболочка [14] и совместно собранных нанопрепаратов без носителей для противоопухолевой терапии. [15]. Ряд исследований также подтвердил, что металлические наночастицы могут производить ферментные электроды в электрохимических биосенсорах с неорганическими пористыми материалами, не являющимися диоксидом кремния [16]. Кроме того, синтезированные наногибриды оксида графена и альбумина также продемонстрировали свою потенциальную пользу в отношении улучшенной фотодинамической терапии [17]. В целом это только вызвало больший интерес к другим возможным приложениям, таким как биомедицинская визуализация и биосенсорные системы [16, 18].

Карбонат кальция как необработанный природный минерал используется в широком спектре применений, включая биомедицину, промышленность и нанотехнологии [10, 19, 20, 21]. Арагонит как полиморф карбоната кальция широко присутствует в панцире ракушки ( Anadara granosa ), моллюски, широко распространенные также в Малайзии [22]. Арагонит является биогенным веществом, в отличие от других полиморфов карбоната кальция кальцита и ватерита, составляющих до 95–98% раковины моллюска. Карбонат кальция, неорганический материал полиморфной модификации арагонита, в природе и обычно существует внутри раковин раковин [23]. Полиморф арагонита все больше привлекает внимание в области исследований из-за его свойств биосовместимости и многообещающего потенциала в разработке систем доставки противораковых лекарств [24] и биомедицинской визуализации [25, 26]. В настоящее время большинство предшествующих исследований выявили в основном два метода производства карбоната кальция [26]. Они включают соосаждение или двойное разложение и карбонизацию CO ₂ газ через гидроксид кальция в контролируемых условиях, который, к сожалению, не производит биогенный карбонат кальция [26,27,28]. Поэтому продукты содержат смесь кальцита и ватерита в больших количествах, которые не подходят для биомедицинского использования из-за их небиосовместимости и высокой токсичности [26].

Однако, с ростом использования нанотехнологий в биомедицинских приложениях, настоящее исследование сосредоточено на синтезе контролируемых наночастиц карбоната кальция, полученных из панциря ракушки (CSCaCO ₃ НЧ) уникального размера и формы с использованием додецилдиметилбетаина (BS-12) [29]. Это вдохновлено предыдущими работами, в которых BS-12 используется в качестве катализатора биоминерализации при синтезе CSCaCO ₃ НЧ, которыми можно легко манипулировать для биоприложений, экономичные и относительно чистые наночастицы [30]. Морфология и размер синтезированных наночастиц имеют решающее значение для определения их физико-химических свойств, при этом особое внимание уделяется металлическим наночастицам с учетом их обширного потенциала биомедицинского применения [31]. Наночастицы золота (AuNP) используются постоянно из-за их оптических свойств, различного диапазона размеров и цвета, которые зависят от вариаций максимумов поглощения или используемого метода синтеза [32]. Размер и форма AuNP влияют на их характеристики поглощения и излучения в видимом спектре света, заставляя их варьироваться от видимой до ближней инфракрасной области. Следовательно, благодаря их синтезу [33], физико-химическим свойствам [34], биосовместимости [35] и функционализации поверхности [36] ими можно манипулировать для различных и конкретных приложений [37]. Кроме того, также было заявлено, что в медицинской диагностике они используются не полностью и их значение, возможно, неясно [37].

Так что, возможно, при соответствующей функционализации они могут быть переработаны для визуализации рака [38], лечения рака [39], доставки лекарств [40] и сенсорных устройств [41]. Покрытие необходимо для изготовления наногибридного биоматериала с функционализированными свойствами, такими как наночастицы золота (AuNP), конъюгированные с пористыми наночастицами карбоната кальция [16, 42]. Полученный в результате наноматериал или нанокомпозитный гибрид с сопряженным золотом и карбонатом кальция, который мог бы сохранить полезные родительские черты, такие как биосовместимость, хорошая растворимость и диспергируемость в растворе [16]. Конъюгированные наночастицы золота, которые демонстрируют сильное изменение цвета и локализованный поверхностный плазмонный резонанс (LSPR), могут быть отличными кандидатами для потенциальных множественных рецепторных систем, таких как аптамеры, пептиды и антитела [35, 43,44,45]. Производство водорастворимых сопряженных полимеров и их применение в биосенсорах, флюоресцентной визуализации и доставке лекарств были успешно реализованы [46,47,48]. Однако конъюгированные наночастицы или наноматериал с годами постепенно улучшали такие преимущества, как фотостабильность [48, 49] и низкая цитотоксичность [50], за исключением более удобного приготовления [51] и особенностей разделения [48].

При этом AuNP и CSCaCO ₃ НЧ синтезируются контролируемым образом и используются для изготовления и характеристики биогенных сопряженных наночастиц карбоната кальция, полученных из панциря ракушки (Au-CSCaCO ₃ НЧ) с размером диаметра от 19 до 51 нм. Первоначально создание AuNPs было основано на классическом методе Туркевича [52] и наночастицах, полученных из раковин ракушки, с использованием подхода синтеза додецилдиметилбетаина [26]. Модификации синтетических параметров, таких как концентрация, могут умело уменьшать или увеличивать их размер. Следовательно, синтезированный наноматериал был охарактеризован и исследован на цитотоксичность. Au-CSCaCO ₃ Дополнительные преимущества препарата НЧ:простой синтез и экономическая эффективность.

Методы / экспериментальные

Материалы и химический реагент

Соль золота (тетрахлорозавровая кислота, содержащая 49% раствор золота) и тринатрийцитрат были приобретены у prima nexus Sdn Bhd (Малайзия). Свежую скорлупу ракушки получали с местного рынка (Пасар боронг, Сери Кембанган, Селангор, Малайзия). Додецилдиметилбетаин (BS-12) и индоцианиновый зеленый краситель (ICG) были приобретены у Sigma-Aldrich (Steinheim, Германия). Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), фетальная бычья сыворотка (FBS), комбинация антибиотиков (глутамин 100 ммоль / л, пенициллин 100 U / мл и стрептомицин 100 мкг / мл), фосфатно-солевой буфер (PBS), диметилсульфоксид (DMSO). ) и МТТ (краситель 3-диметилтиазо-2,5-дифинилтетразолий бромид) были приобретены в Naclai tesque, Inc., Киото, Япония. Все остальные реактивы были аналитической чистоты.

Синтез наночастиц золота

Синтез был осуществлен с использованием метода, ранее описанного Verma et al. [53] с небольшими изменениями в концентрациях, 1% тетрахлорозавра, содержащая 49% раствор золота. Приблизительно 0,1% раствора золота готовили и разбавляли в сериях концентраций 15, 25 и 20 мМ в различных конических колбах соответственно. Затем растворы нагревали до 100 ° C на горячей плите, связанной с магнитной мешалкой (позиция 6, WiseStir ® Korea). Затем к кипящему раствору при непрерывном перемешивании магнитной мешалкой добавляли около 1% цитрата тринатрия до тех пор, пока не наблюдалось изменение цвета (раствор желтоватого золота становился бесцветным, затем черным, а затем, наконец, приобретал ярко-красный цвет). Через 15 мин нагрев отключали и давали остыть при комнатной температуре. Затем синтезированные наночастицы золота хранили при -4 ° C для дальнейшего использования. Реакция показана в приведенном ниже уравнении:

Получение и синтез наночастиц карбоната кальция, полученных из раковины кокля (CSCaCO ₃ НП)

Три килограмма свежеполученных раковин моллюсков тщательно очищали, скребли и промывали. Порошок скорлупы ракушек был получен в соответствии со способом, описанным Islam et al. [54]. Очищенную скорлупу ракушки сушили в сушильном шкафу (Memmert UM500, GmbH Co, Германия) при 50 ° C в течение 7 дней. Оболочки ракушек измельчали ​​в порошок с помощью блендера (Blender HCB, 550, США) и просеивали через нержавеющее лабораторное сито для испытаний (Endecott Ltd., производство Лондон, Англия) с апертурой 90 мкм для получения порошка микронного размера. Порошок сушили 7 дней при 74 ° C в печи. Далее порошок был упакован в герметичный полиэтиленовый пластиковый пакет для последующего использования. Наночастицы карбоната кальция, полученные из раковины ракушки, были синтезированы в соответствии с подходом, описанным Islam et al. [55], с небольшими изменениями в методе и параметрах синтеза. Два грамма порошка раковины ракушки помещали в коническую колбу на 250 мл, затем добавляли 50 мл дважды деионизированной воды и в коническую колбу добавляли BS-12 в концентрации 0,5 мл. Смесь в конической колбе интенсивно перемешивали при 1000 об / мин при температуре 50 ° C в течение 135 мин, используя систематическую многонагревочную плиту и магнитную мешалку с небольшим магнитным стержнем. Приготовленный образец отделяли от маточной жидкости с помощью фильтровальной бумаги с двойным кольцом размером 125 мм (Filtres Fioroni, Китай). Затем остаток тщательно промывали для удаления избытка BS-12. Конечные продукты, CSCaCO ₃ Порошок NP упаковывали в сухой чистый контейнер и сушили в течение 3 дней (Oven Memmert UM500, GmbH Co, Германия) при 74 ° C. Контейнер был должным образом обернут и запечатан пленкой Para после добавления внутрь нескольких маленьких мраморных шариков. Контейнер был помещен на программируемую роликовую мельницу (BML-6, Wisemix ® Korea) при скорости вращения 200 об / мин на 5 дней. Образец хранился в герметичном полиэтилене в печи для дальнейшего использования.

Синтез сопряженных наночастиц карбоната кальция, полученных из конъюгированной оболочки золота и коклю (Au-CSCaCO ₃ NPs) и совместное использование красителей в ближней инфракрасной области (NIR)

В этой процедуре 0,2 г CSCaCO ₃ НЧ и 5 мг ближнего инфракрасного (NIR) красителя индоцианинового зеленого (ICG) диспергировали в 20 мл раствора коллоида золота (pH 7) (AuNPs-раствор), как аналогично описано Cai et al. [16], в чистой пустой конической колбе. Были внесены дальнейшие модификации синтеза:образец обрабатывали ультразвуком в течение 20 минут и инкубировали на магнитной мешалке с небольшой магнитной полосой при 200 об / мин в течение 3 дней. Образец подвергали ультрацентрифугированию при скорости 10000 об / мин в течение 10 мин для получения светло-зелено-пурпурного Au-CSCaCO ₃ НП композит. Супернатант декантировали и осадок промывали серией деионизированной воды. Приготовленный композитный материал сушили в печи в течение 4 дней и хранили в герметичном полиэтилене в печи для дальнейшего анализа.

Характеристика сопряженных наночастиц карбоната кальция, полученных из конъюгированной оболочки золота и коклю (Au-CSCaCO ₃ НП)

Размер частиц и морфология наноматериала анализировали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ). Наноматериал диспергировали в абсолютном спирте и обрабатывали ультразвуком в течение 40 мин. Приблизительно 5 мкл суспендированного раствора образца наносили пипеткой на медную ручку крепления образца. Образец просматривали под ТЕМ (Hitachi H-7100). Автоэмиссионный сканирующий электронный микроскоп (FESEM) (модель JOEL 7600F) работал при напряжении 5 кВ и был оборудован блоком энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDX). Это было использовано для характеристики поверхностных характеристик Au-CSCaCO ₃ НП. Материал диспергировали в абсолютном спирте и обрабатывали ультразвуком в течение 1 часа. Приблизительно 50 мкл суспендированного раствора образца переносили пипеткой на держатель образца с медной ручкой, сушили в течение ночи и сканировали с использованием электронных лучей. Кроме того, инфракрасный спектрометр с преобразованием Фурье (FTIR) также использовался для функционального анализа синтезированного сопряженного наноматериала; наноматериал калибровали в 1 мас.% в Ker (FTIR Model 100, Perkin Elmer) в диапазоне 400–4000 см ^-1 . Кроме того, анализ синтезированного размера наноконъюгата и дзета-потенциала был выполнен с использованием дзетазатора (Nano ZS, Malvern Instruments). Материал суспендировали в деионизированной воде и обрабатывали ультразвуком в течение 50 мин; Гомогенную суспензию помещали в кювету для зетазатора и исследовали на размер частиц и дзета-потенциал. Присутствие различных аналитов в конъюгированном нанокомпозите контролировали с помощью УФ-видимого спектрофотометра (УФ - 2600) при различных длинах волн в диапазоне от 300 до 800 нм.

Исследования клеточных культур и цитотоксичности

Клеточная линия аденокарциномы молочной железы человека (JCRB:MCF-7) и линия клеток фибробластов мыши (JCRB:NIH3T3) культивировали в среде DMEM (с высоким содержанием глюкозы) с добавлением 10% FBS и комбинации антибиотиков (глутамин 100 ммоль / л, пенициллин 100 Ед / мл и стрептомицин 100 мкг / мл). Колбы для культивирования (культура Eppendorf T-25 и T-75) инкубировали в 5% диоксиде углерода при 37 ° C, а клетки при 80–90% конфлюэнтности использовали для процесса посева и обработки.

Посев и обработка клеток

Клетки высевали в 96-луночные стерильные планшеты с плотностью 5 × 10 ³ . клеток на лунку и инкубируют в течение 24 ч в течение ночи. Среду из каждой лунки удаляли, и клетки обрабатывали и совместно культивировали в повторностях с суспензией конъюгированного нанокомпозитного материала (Au-CSCaCO ₃ НП) сроком на 24, 48 и 72 часа. После завершения обработки среды в лунках аспирировали и промывали PBS, прежде чем они были заменены другой свежей средой перед экспериментальной обработкой.

Подготовка Au-CSCaCO ₃ НП для лечения

Стандартный раствор Au-CSCaCO ₃ Готовили НЧ в концентрации 1 мг / мл в 10% бессывороточной среде DMEM. После посева клеток MCF-7 и клеток NIH3T3 в 96-луночные планшеты планшеты обрабатывали и инкубировали с различными концентрациями в микрограммах (100–1,56) Au-CSCaCO ₃ Растворы НП.

(МТТ) 3-диметилтиазо-2,5-дифинилтетразолийбромидный реагент и протокол

Обычно 5 мг порошка реагента МТТ растворяли в 1 мл PBS с помощью вихревой ультразвуковой установки для получения однородной смеси. После посева клеток и обработки лунки очищали и в каждую лунку добавляли 20 мкл реагента МТТ. Сразу после этого планшеты инкубировали в течение 3–4 часов, чтобы обеспечить связывание МТТ с митохондриями клеток. После инкубации в каждую лунку добавляли 1 мл ДМСО, в результате чего окрашенный продукт выделялся в раствор. Планшеты выдерживали в темной комнате в течение 30 мин, и оптическую плотность (ОП) раствора измеряли с помощью считывающего устройства для микропланшетов при длине волны 570 нм [56]. Эксперименты проводили в трех экземплярах для каждой клеточной линии, и регистрировали средние значения. Процент жизнеспособности клеток определяли по формуле, приведенной ниже.

где A _{Образец} было среднее значение OD для различных инкубированных обработанных клеток обеих клеточных линий и A _{Контроль} было средним значением OD различных инкубированных клеток только в полной культуральной среде. Затем цитотоксичность клеток оценивали по средним значениям в трех повторностях и выражали как среднее ± стандартное отклонение (SD).

Статистический анализ

Статистический анализ данных проводился с использованием программного обеспечения SPSS (версия 10, Чикаго, США). Эксперименты проводили в трех экземплярах и выражали как среднее ± стандартное отклонение (M ± SD). Порог значимости был p <0,01.

Результаты и обсуждение

Физико-химические свойства конъюгированного Au-CSCaCO ₃ НП

Просвечивающий электронный микроскоп

Цель микрофотографий ПЭМ заключалась в оценке размера синтезированного конъюгированного Au-CSCaCO ₃ НЧ представляют собой хорошо диспергированные наночастицы со средним диаметром 35 ± 16 нм в диапазоне (19–51 нм). Различия в размерах, обусловленные условиями синтеза, показаны на рис. 1.

ТЕА ( а , b ) изображения Au-CSCaCO ₃ НЧ, характеризующие их разный размер наночастиц

Микрофотографии наноконъюгата с помощью ПЭМ показали диапазон диаметров от 19 до 51 нм и наличие диспергированных наночастиц. Уникально полученный наноразмер можно отнести к используемым контролируемым условиям синтеза. Другое возможное объяснение дисперсности наночастиц могло быть связано с отрицательно заряженным слоем цитрат-ионов, которые способствовали отталкиванию наночастиц друг от друга, а также из-за электростатического отталкивания и поверхностного слоя конъюгированной гидратации, предотвращающего агрегацию и повышающего стабильность конъюгата, как сообщалось аналогичным образом. Автор:Jazayeri et al. [56]. Кроме того, цитратный блокирующий реагент играет роль в синтезе, что позволяет добиться большей дисперсности и стабильности конъюгата наночастиц, как сообщалось Rawat et al. [57]. Уникальный размер частиц показал различные абсорбированные наночастицы золота внутри матрицы наносфер карбоната кальция, аналогично работе, выполненной Cai et al. [16], что способствует наблюдаемому показанному размеру частиц. Однако этот результат также подтверждает сообщения о том, что кальцит имеет плохую способность удерживать наночастицы золота [16].

Сканирующая электронная микроскопия с полевой эмиссией (FESEM) и энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (EDX)

Микрофотография FESEM оценила морфологию и форму синтезированных наночастиц, которые показывают сферическую и цепочечную форму Au-CSCaCO ₃ Наночастицы НЧ с небольшой степенью агрегации, как показано на рис. 2. Элементарные спектры (рис. 2b) проанализировали элементный состав конъюгированных наночастиц, которые отображают 64,98% углерода, 13,53% кислорода, 0,02% кальция, 17,63% меди и 3,85% золота, как показано в Таблице 1.

ФЕСЕМ а Микрофотография FESEM Au-CSCaCO ₃ НЧ, описывающие морфологию. б EDX-спектры Au-CSCaCO ₃ НП

Микрофотографии FESEM описывают уникальную морфологию в виде сферической формы, сглаженной поверхности и цепочечных структурированных сопряженных наночастиц, физические или химические свойства которых можно объяснить условиями получения и методами синтеза [58]. Точно так же сферическая структурная природа, демонстрируемая конъюгированными наночастицами, была аналогична описанной Verma et al. [53], но вопреки представленной небольшой степени агрегирования. Возможное объяснение этого результата может быть связано с гидрофобными и электростатическими взаимодействиями между наночастицами золота и наночастицами карбоната кальция, полученными из раковин раковины, что приводит к сильному связыванию [48]. Кроме того, роль BS-12, используемого в синтезе, отразилась в разрушении наночастиц до сферической формы, аналогичной работе, описанной Islam et al. [55]. Элементарный профиль (таблица 1) не выявил значительных изменений вопреки ожидаемому результату. Аналогичным образом, наблюдаемые данные о химическом составе конъюгированных наночастиц документированы, как ранее показано в предыдущих работах [26, 54].

Распределение поверхностного заряда и размера по интенсивности

Был проведен дзета-потенциал конъюгированных наночастиц, чтобы оценить их поверхностный заряд, стабильность и распределение по размерам по интенсивности, которая выявила отрицательный заряд -16,4 ± 3,81 мВ и средний размер конъюгированных наночастиц 57,97 нм, как показано на рис. 3 и Таблица 2.

а Распределение частиц по размерам по интенсивности Au-CSCaCO ₃ НП. б Дзета-потенциал Au-CSCaCO ₃ НЧ, показывающие поверхностный заряд

Дзета-потенциал является важным методом анализа при оценке электростатического заряда поверхности наночастиц, который был определен с помощью дзета-классификатора. Это дополнительно объяснило дисперсность наноматериала в растворе, что позволило нам понять общую стабильность, срок хранения наночастиц, взаимодействия частиц между заряженными частицами и их последствия [59]. Оценка дзета-потенциала конъюгированного наноматериала показала стабильность наночастиц при -16,4 мВ и индекс полидисперсности (PdI) менее 0,5. Возможное объяснение можно объяснить наличием большего электрического отталкивания между частицами в суспензии во время измерения. Кроме того, склонность к агломерации также могла влиять на распределение по размерам, приводя к большему размеру из-за синтетических методов. Предыдущее исследование Hoque et al. аналогичным образом задокументировал [60], что сильно положительный или отрицательный дзета-потенциал снижает агрегацию и увеличивает стабильность. Кроме того, физико-химические различия синтезированных наночастиц можно объяснить используемыми методами синтеза. В работах Канауджиа и его сотрудников [61] также подчеркивалось, что более высокие отрицательные или положительные значения дзета-потенциала указывают на стабильность и предотвращают агрегацию частиц из-за электрического отталкивания, которое электрически стабилизирует дисперсию наночастиц, о которой также сообщили Isa et al. [62].

Инфракрасный спектрометр с преобразованием Фурье (FTIR)

ИК-Фурье-спектр Au-CSCaCO ₃ NPs показывает, что наиболее выдающийся пик проявился при 1455,09 см ^-1 . за которыми следуют пики, наблюдаемые при 1059,12 см ⁻¹ , 854,80 см ⁻¹ , и 464,16 см ⁻¹ , соответственно. Также слабые пики наблюдались при 706,40 см ^-1 . и 1785,68 см ⁻¹ как показано на рис. 4.

Спектр инфракрасного спектрометра с преобразованием Фурье основных характеристических пиков Au-CSCaCO ₃ НП. Все отметки соответствуют частотам, обсуждаемым в тексте

ИК-Фурье-спектр Au-CSCaCO ₃ Представленные НЧ показали, что наиболее выдающийся пик проявился при 1455,09 см ^-1 . , что свидетельствует о наличии связей кислород-водород (O – H) в карбоксильных группах наночастиц золота [14] и наночастиц раковины раковины, за которыми следуют пики, которые лучше всего демонстрируют присутствие маркера полиморфа арагонита, наблюдаемого при 1059,12 см ^-1 , 854,80 см ⁻¹ , и 706,40 см ⁻¹ , которые, как известно, сообщают об алкильных группах, встречающихся в наночастицах, происходящих из раковин раковины, которые соответствуют пикам спектра [55]. Точно так же слабый пик наблюдался при 1785,68 см ^-1 . из-за наличия карбоксильной группы [54], и дополнительный пик наблюдался при 464,16 см ^-1 . Все пики показали значительную характеристику наличия ковалентных связей, углерод-углеродных (C – C), углерод-кислородных (C – O) и углерод-азотных (C – N) связей, соответствующие функциональные группы которых присутствовали в наших сопряженных наночастицы. FTIR по существу идентифицировал присутствующие функциональные группы, получая пики инфракрасного спектра сопряженного наноматериала и одновременно собирая данные с высоким спектральным разрешением в широком спектральном диапазоне (400–4000 см ^-1 ) [63]. Однако сообщается, что кальцитовый полиморф карбоната кальция имеет пики в диапазоне от 2000 до 2900 см ^-1 . с наночастицами, полученными методом карбонизации [64].

УФ-видимый спектрофотометр

Синтезированные конъюгированные наночастицы показывают сильный пик поглощения при 530 нм, как показано на рис. 5.

Спектр поглощения УФ-видимого спектрофотометра Au-CSCaCO ₃ НП, как описано в тексте

Золотые наноструктуры обладают широким светопоглощением из-за эффекта локализованного поверхностного плазмонного резонанса AuNP [65, 66]. Ряд отчетов показал, что частицы золота часто имеют острый пик поглощения, наблюдаемый между 500–520 нм [66,67,68,69]. Этот метод позволил дополнительно оценить конъюгированный Au-CSCaCO ₃ Размер, концентрация и уровень агрегации НЧ [65]. Также известно, что полоса поглощения смещается в сторону меньших длин волн, что указывает на уменьшение размеров частиц, а симметричная форма спектров поглощения указывает на узкое распределение частиц по размерам [70], что подтверждает наш конъюгированный Au-CSCaCO ₃ НЧ с более широким пиком поглощения между 500–550 нм и высшей точкой при длине волны 530 нм. Приемлемо в ближней инфракрасной области видимого спектра, в которой свет легко ослабляется тканью и пик поглощения значительно смещается в сторону большей длины волны [71]. Возможное объяснение этому могло быть связано с синтезом и сопряжением наноматериала. Также согласуется с Srinath et al., Которые показали, что положение полосы поглощения в основном зависит от изменения цвета, агрегации и поверхностно-адсорбированных частиц [72]. Кроме того, спектр поглощения наночастиц может смещаться в зависимости от цвета, морфологии и размера из-за свойства золотого плазмонного резонанса [73]. Наноструктуры с фототермическими свойствами в ближнем инфракрасном диапазоне обладают способностью сильно рассеивать свет, что находит важное применение в биомедицинской визуализации [74, 75].

Исследования цитотоксичности

МТТ (3-диметилтиазо-2,5-дифинилтетразолий бромид)

Исследования цитотоксичности клеток карциномы молочной железы человека (MCF-7) и эмбриональных фибробластных клеток мыши (NIH3T3) показывают, что Au-CSCaCO ₃ НЧ подавляли более 70% пролиферации клеток, вызывая гибель раковых клеток и почти 40% ингибирование клеток фибробластов при дозировке 100 мкг. IC ₅₀ и более низкие дозы концентрации, такие как 25 мкг, также оказались токсичными для раковых клеток, выявив низкую жизнеспособность клеток, а также подавляя более чем 50% пролиферацию раковых клеток для наночастиц. С другой стороны, идентичные дозировки для клеток фибробластов показали повышенную и постоянную жизнеспособность клеток фибробластов. IC ₅₀ отображает до 80% жизнеспособности клеток фибробластов, как показано на рис. 6.

Оценка цитотоксичности Au-CSCaCO ₃ , обработанных MCF-7 и NIH3T3 Клетки NPs с использованием анализа МТТ, дающего процент жизнеспособности клеток

3-Dimethylthiazo-2,5-diphynyltetrazolium Bromide (MTT) is a colorimetric assay acceptably used to determine cell viability [76]. Utilizing mitochondrial enzymes in the electron transport chain [77], viable cells with active metabolism converted MTT into purple-colored formazon crystals in the cellular cytosol [78]. The crystals were dissolved after cell lysis on adding an organic solvent dimethyl sulfoxide (DMSO) which is proportional to live cell number, unlike dead cells, due to cytotoxicity that are unable to carry out the reaction [79]. The conjugated nanoparticles displayed consistent cell death against the cancer cells and reliable cell viability of the fibroblast cells with concentration doses ranging from 25–100 μg. Furthermore, attesting low cytotoxicity and highlighting the biocompatibility of Au-CSCaCO₃ NPs and potential usefulness for biomedical applications, the cytotoxicity could be due to the internalization of the nanoparticles which possibly triggered intracellular responses and thus induced cellular damage because of interaction with cell organelles. Despite contrary cytotoxicity findings with works done on HeLa cells (human cervical cancer cell line) due to nanoparticles inducing oxidative damage [35, 80], Zhang et al. demonstrated the biocompatibility of the nanoparticles and its likely use for drug delivery systems [80]. Similarly, reports of gold nanoparticles confirmed nontoxic dependent on their size [81] and concentration [39]. Studies strongly confirmed that biogenic gold conjugates are stable and nontoxic nanocarrier used in biomedical application [35, 39] suggesting use for biomedical applications such as drug delivery and cancer therapy [82].

Выводы

Spherical-shaped conjugated gold-cockle shell-derived calcium carbonate nanoparticles (Au-CSCaCO₃ NPs) were obtained. The conjugated nanoparticles were synthesized using a simpler, environmental friendly, and cost-efficient synthetic approach. Furthermore, based on the results, the obtained conjugated nanoparticles were relatively pure and stable. The source of material used for the cockle shell-derived nanoparticles is biogenic, readily available, and naturally occurring as seawater mollusca cockle shell. Based on the presented evidences, the conjugated Au-CSCaCO₃ NPs could be a good biomaterial for biomedical applications.

Сокращения

Au-CSCaCO₃ NPs :

Synthesized Conjugated Gold-Cockle Shell Derived Calcium Carbonate Nanoparticles

AuNPs:

Gold nanoparticles

BS-12:

Dodecyl dimethyl betaine

C–C:

Carbon-carbon bond

C–N:

Carbon-nitrogen bond

C–O :

Carbon-oxygen bond

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

EDX:

Energy dispersive X-ray

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

FESEM:

Field emission scanning electron microscope

FRGS:

Fundamental Research Grant Scheme

FTIR:

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

HeLa cells:

Human cervical cancer cell line

IC₅₀ :

50% inhibition concentration

ICG:

Indocyanine green dye

JCRB:

Japanese Collection Research Bioresource

LSPR:

Localized surface plasmon resonance

MCF-7:

Human breast adenocarcinoma cell line

MTT:

3-Dimethylthiazo-2, 5-diphynyltetrazolium Bromide Dye

NIH-3T3:

Mouse embryonic fibroblast cell line

NIR:

Ближний инфракрасный порт

O–H:

Oxygen-hydrogen bond

OD:

Optical density

PBS:

Phosphate-buffered saline

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп