Новые биосовместимые наночастицы Au Nanostars @ PEG для КТ-визуализации in vivo и свойства очищения почек

Фон

Последнее десятилетие стало свидетелем быстрого развития наночастиц в нанобиотехнологии из-за их разнообразных составляющих материалов и большой площади поверхности [1, 2]. Среди этих наночастиц золото широко применяется в биомедицинской сфере благодаря своей превосходной биосовместимости и сродству [3, 4]. В последние несколько лет наночастицы Au широко используются в компьютерной томографии из-за их большего атомного номера, драгоценного металла и химической инертности, а также из-за того, что белки не вступают в реакцию организма [5,6,7].

КТ - это неинвазивный инструмент клинической диагностики через различную плотность и толщину различных тканей или органов ослабления генератора рентгеновских лучей в разной степени, чтобы сформировать различное распределение контрастности изображения в градациях серого в тканях или органах и, таким образом, к относительному положению поражение, и размер изменения формы [8,9,10,11]. В настоящее время клиническое применение контрастных агентов CT в основном содержит соединение йода, которое представляет собой небольшую молекулу, включая органический йод и низкомолекулярные соединения неорганического йода, такие как диазтризоат (диатризойная кислота (DTA)) и иогексол (Omnipaque) [12]. Однако низкомолекулярный контрастный агент на основе йода, устраняющий эффекты йодсодержащих соединений, требует очень короткого времени визуализации и не обладает низкой токсичностью для почек [13, 14]. В клинической практике одним из осложнений применения йодсодержащих рентгеноконтрастных препаратов является ухудшение функции почек [15]. Таким образом, развитие наноматериалов дает новые идеи и методы решения этих проблем. Недавние исследования также подтвердили, что контрастный агент на основе наночастиц для КТ может эффективно продлить время визуализации, ослабить токсичность почек и иметь лучшее ослабление рентгеновских лучей, чем контрастные вещества на основе йода, такие как наночастицы золота и наночастицы серебра, используемые в качестве Контрастные вещества для КТ привлекли внимание исследователей [16,17,18]. Дендримерная наноплатформа не только как модифицированная небольшая молекула йодированного контрастного вещества, но также как шаблонная упаковка и стабильность различных неорганических наночастиц, улучшают время циркуляции контрастного вещества в крови, что делает его более удобным для компьютерной томографии [19].>

В этом исследовании мы приготовили наночастицы наночастиц Au, функционализированные ПЭГ (AuNS @ PEG); из-за большей площади поверхности по сравнению с обычными наночастицами Au того же размера, Au nanostar может значительно улучшить КТ-изображение. После функционализации с помощью PEG наночастицы Au nanostar могут улучшить их биосовместимость и свойства почечного клиренса. Для определения характеристик и биосовместимости наночастиц AuNS @ PEG использовались различные методы, включая ТЕМ, EDX, XPS, МТТ и проточную цитометрию. Кроме того, гистологический анализ и гематологические исследования использовались для испытаний токсичности наночастиц AuNS @ PEG in vivo, и результаты подтвердили хорошую биосовместимость наночастиц AuNS @ PEG. Более того, эксперименты по визуализации КТ in vitro и in vivo также продемонстрировали превосходные возможности КТ-визуализации наночастиц AuNS @ PEG. Все эти результаты показали, что синтезированные наночастицы контрастного вещества AuNS @ PEG в качестве отличного потенциального кандидата могут широко использоваться для компьютерной томографии и обладают хорошими свойствами почечного клиренса.

Методы

Все протоколы экспериментов, включая любые соответствующие детали, были одобрены Региональным этическим комитетом Медицинского университета Цзиньчжоу, провинция Ляонин, Китай.

Материалы и инструменты

Все химические вещества были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури) и использовались напрямую, если не указано иное.

Синтезированные наночастицы были охарактеризованы с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и энергодисперсионного рентгеновского анализа (EDX) с использованием ускоряющего напряжения 200 кВ (Tecnai G2 Twin, FEI, Hillsboro, OR). Образец ПЭМ был приготовлен сушкой разбавленных растворов наночастиц на медной сетке, покрытой формваром / углеродом. Образцы были приготовлены путем нанесения капли разбавленного коллоидного раствора на угольную сетку и позволяя жидкости высохнуть на воздухе при комнатной температуре. Спектры адсорбции в УФ-видимой области записаны на спектрофотометре Shimadzu UV-2450 UV / Vis / NIR. Измерение динамического рассеяния света (DLS) проводилось на Malvern Zetasizer NANO ZS при 25 ° C.

Синтез наночастиц Au Nanostars / PEG (AuNS @ PEG)

Золотые нанозвезды (Au NS) были синтезированы методом опосредованного семенами роста в соответствии с предыдущим отчетом [20,21,22] с некоторыми небольшими изменениями. Обычно затравки Au, которые были сформированы с диаметром 10 нм, были синтезированы путем химического восстановления HAuCl ₄ согласно предыдущему отчету [23]; 6 мл HAuCl ₄ решение ( w / v 1%) добавляли к 140 мл сверхчистой воды и нагревали до кипения при перемешивании. Затем быстро вводили 0,75 мл олеиламина и кипятили полученную смесь еще 2 ч. Коллоид Au охлаждали естественным образом до комнатной температуры; К коллоиду добавляли 60 мл циклогексана и раствор перемешивали на магнитной мешалке еще в течение 1 часа. Затем в смесь вводили 1,5 мл NaOH (4 М) при интенсивном перемешивании в течение еще 30 мин. Смесь оставлена ​​иерархической. Зерно золота, содержащееся в верхнем слое, осаждали добавлением этанола. Осадки поочередно очищали этанолом и водой еще раз и диспергировали в воде.

Нанозвезды золота диаметром около 50 нм были синтезированы в соответствии с предыдущей работой путем быстрого и одновременного смешивания AgNO ₃ (1 мл, 3 мМ) и аскорбиновая кислота (500 мкл, 0,1 М) со 100 мл раствора, содержащего 0,25 мМ HAuCl ₄ , 1 мМ HCl и 1,5 мл семян золотой наносферы. Затем в большом избытке добавляли тиолированный полимер полиэтиленгликоля (ПЭГ, 6 кДа) для пассивирования поверхности наночастиц. Раствор смеси непрерывно перемешивали в течение 24 ч, затем полученные наночастицы AuNS @ PEG собирали с помощью 3 циклов центрифугирования / редиспергирования в воде. Образованные наночастицы AuNS @ PEG были повторно диспергированы в воде для дальнейшего использования.

Культура клеток и воздействие наночастиц AuNS @ PEG

Клетки нейроглии собирали из тканей спинного мозга крыс. Клетки культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Gibco, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 Ед на мл пенициллина и 100 мкг на мл стрептомицина при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO <. sub> 2 . Клетки высевали в культуральные планшеты с последующим воздействием наночастиц AuNS @ PEG в течение 2 ч при определенных концентрациях (50, 100, 200, 500 и 1000 ppm). DMEM без наночастиц AuNS @ PEG использовали в качестве контрольной группы.

Животные и лечение

Эта работа проводилась в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья. Протокол был одобрен Комитетом по этике экспериментов на животных Медицинского университета Цзиньчжоу (номер разрешения:LMU-2013-368), Китай. Самцы крыс Sprague Dawley (180-200 г) были приобретены в Центре животных Медицинского университета Цзиньчжоу (номер лицензии:SCXK 2009-0004). Всех крыс кормили в помещении с контролируемой температурой (25,0 ± 0,2 ° C) в лаборатории, свободной от конкретных патогенов, с фотопериодом 12 часов / 12 часов свет / темнота и влажностью 50%. Крысам был предоставлен свободный доступ к пище и воде.

Гуманные конечные точки выбираются для минимизации или прекращения боли или страданий экспериментальных животных посредством эвтаназии, включая ингаляционные агенты, неингаляционные фармацевтические агенты и физические методы, а не ожидание их смерти в качестве конечной точки. В данной работе крысы были разделены на две группы:(1) контрольная:крысам вводили внутрибрюшинно раствор хлоралгидрата (10 мас.%), А затем через хвостовую вену вводили 800 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером. (2) Тест:крыс анестезировали внутрибрюшинной инъекцией раствора хлоралгидрата (10 мас.%), А затем через хвостовую вену вводили 800 мкл раствора наночастиц AuNS @ PEG (200 мкг / мл). Для исследования H&E крыс умерщвляли смещением шейных позвонков без предварительной анестезии, их сердца, печень, почки, селезенки и кишечник немедленно вырезали, хранили при -80 ° C и мгновенно замораживали в изопентане на сухом льду до следующего периода. обработано.

Анализ жизнеспособности клеток

Клетки нейроглии в логарифмической фазе высевали на 96-луночный планшет в количестве 1 × 10 ⁴ . клеток на лунку в 100 мкл клеточной суспензии. В окружающие лунки добавляли фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Планшет инкубировали при 37 ° C и 5% CO ₂ . в течение 24 часов, чтобы клетки могли прилипнуть. Затем клетки были разделены на четыре группы:клетки контрольной группы инкубировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки; в группе наночастиц AuNS @ PEG в культуральную среду добавляли 0, 25, 50, 100, 200, 500 или 1000 ppm наночастиц AuNS @ PEG; клетки наблюдали через 24 ч под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Heidelberger, Германия). Затем 20 мкл МТТ (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) добавляли в каждую лунку на 4 часа. Среду удаляли, и клетки инкубировали со 150 мкл диметилсульфоксида в течение 10 мин при 37 ° C. Значения оптической плотности (OD) измеряли при 490 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Проточная цитометрия

Клетки инкубировали в 6-луночных планшетах в течение 24 ч, затем группировали и обрабатывали, как описано выше. Одноклеточную суспензию готовили с использованием трипсина и центрифугировали при 300 g на 3 мин. После удаления супернатанта клетки дважды промывали предварительно охлажденным PBS и центрифугировали в 1 мл аннексина V (Tianjin Sungene Biotech Co, Ltd., Тяньцзинь, Китай) в течение 10 мин. Ячейки были доведены до 10 ⁵ / мл. Суспензию клеток центрифугировали и трижды промывали PBS. В пробирки Эппендорфа добавляли образцы (100 мкл) с 5 мкл аннексина V-APC (Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd.) и 7-AAD (Tianjin Sungene Biotech Co, Ltd.) и перемешивали. Объем доводили до 500 мкл с помощью PBS, и пробирки инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин в темноте. Апоптоз количественно оценивали с помощью проточной цитометрии (BD FACSCanto II, BD Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния, США). Скорость апоптоза клеток рассчитывалась следующим образом:количество апоптотических клеток / общее количество клеток × 100%.

Компьютерная томография

КТ-изображение было получено с использованием 128-рядной 64-срезовой спиральной компьютерной томографии, произведенной General Electric Company (GE). Параметры визуализации:толщина среза 0,625; средний - голые мыши; энергия трубки, квп, составляет 120 мкА и 100 мА; CTDIVOL составляет 6,53 мГр; и радиус 4,8 см. Всех животных сканировали в черепном и каудальном направлении от нижней части грудной клетки до таза. Данные КТ были проанализированы по изображениям и после лечения.

Гистологический анализ

Органы извлекали и фиксировали в 4% параформальдегиде, затем 30% растворе параформальдегида сахарозы один раз в 2 дня, делали срезы и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) для гистологического исследования с использованием стандартных методик. Срезы исследовали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом .

Оценка почечной функции

Биохимический анализатор (Медицинский университет Цзиньчжоу) использовался для оценки BUN, Crea, β ₂ -MG и CO ₂ в крови. Функцию почек оценивали по изменению сывороточных уровней BUN, Crea, β ₂ -MG и CO ₂ до и после инъекции наночастиц AuNS @ PEG крысе.

Статистический анализ

Данные выражали как среднее значение ± стандартное отклонение и анализировали с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США) и SPSS. Группы сравнивали с использованием одностороннего дисперсионного анализа и теста наименьшей значимой разницы. P <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика наночастиц AuNS @ PEG

Наноматериалы попадают в организм человека и играют роль обнаружения. Физические и химические свойства наночастиц сначала рассматриваются, прежде чем они попадут в систему кровообращения [24, 25]. Как мы знаем, есть два ключевых фактора в разработке высокоэффективных нанозондов для КТ in vivo и свойств почечного клиренса. Один из них - дальнейшая функционализация поверхности; другой - размер.

Для подтверждения структуры наночастиц AuNS @ PEG было использовано крупномасштабное изображение просвечивающей электронной микроскопии (TEM) (рис. 1a), которое показало, что были получены наночастицы AuNS @ PEG звездчатой ​​структуры, и эти наночастицы имели идеальные размеры около 50 нм с высокой однородностью. Кроме того, элементы Au, обнаруженные в энергодисперсионном рентгеновском (EDX) спектре наночастиц AuNS @ PEG, также подтверждают получение нанозвезды Au (рис. 1c). Кроме того, состав на поверхности наночастиц AuNS @ PEG был дополнительно охарактеризован XPS-спектрами, а Au4f, C1s и O1s, полученные из нанозвезд Au и PEG, были четко показаны на рис. 1b, что также подтверждает образование AuNS. @ Наночастицы ПЭГ.

Электронные микрофотографии наночастиц AuNS @ PEG ( a ), XPS ( b ) и EDX ( c ) наночастиц AuNS @ PEG

Вышеуказанные характеристики продемонстрировали успешный синтез наночастиц AuNS @ PEG.

CT Ценность наночастиц AuNS @ PEG

Наночастицы Au широко используются в качестве контрастных агентов для КТ из-за их лучшего ослабления рентгеновских лучей, чем обычные низкомолекулярные контрастные вещества на основе йода для КТ. Йод ( Z =53) исторически был атомом первого выбора в области компьютерной томографии. Чтобы оценить возможность использования наночастиц AuNS @ PEG для рентгеновской компьютерной томографии, мы измерили значения компьютерной томографии (единицы Хаунсфилда, HU). На рис. 2а показано, что наночастицы AuNS @ PEG имеют более высокое значение CT по сравнению с йодом и деионизированной водой при той же концентрации. Когда концентрация наночастиц AuNS @ PEG увеличивалась, интенсивность КТ-изображения также непрерывно увеличивалась с более яркими изображениями. Построив график значения CT (в HU) AuNS @ PEG как функции концентрации (рис. 2b), мы смогли увидеть линейное ослабление значения CT наночастиц AuNS @ PEG с различными концентрациями. Эти результаты показывают, что наночастицы AuNS @ PEG являются идеальными кандидатами на роль нанозонда для получения положительного изображения при КТ.

Интенсивность ослабления рентгеновских лучей наночастицами AuNS @ PEG в зависимости от концентрации Au ( a ) и КТ-изображение наночастиц AuNS @ PEG при различных концентрациях (йодогидрин, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,75, 15,625 и 7,8125 частей на миллион, соответственно) ( b )

Анализ цитотоксичности

Было критически важно изучить биосовместимость наночастиц AuNS @ PEG in vitro, прежде чем они были использованы в КТ-визуализации in vivo в качестве контрастного вещества. МТТ-анализ проводили для оценки их цитотоксичности в отношении клеток нейроглии. После инкубации с наночастицами AuNS @ PEG в различных концентрациях (25, 50, 100, 200, 500 и 1000 частей на миллион соответственно) в течение 24 часов проводили анализ жизнеспособности клеток нейроглии МТТ. Видно, что жизнеспособность клеток после обработки наночастицами AuNS @ PEG в исследованном диапазоне концентраций вполне аналогична контролю, что ясно указывает на то, что образующиеся наночастицы AuNS @ PEG обладают хорошей цитосовместимостью при концентрации до 200 ppm. . Даже при относительно высокой дозе наночастиц (1000 частей на миллион) жизнеспособность клеток все еще оставалась выше 90% (рис. 3а).

Жизнеспособность клеток нейроглии, инкубированных с различными концентрациями наночастиц AuNS @ PEG в течение 24 часов ( a ); апоптоз клеток, индуцированный наночастицами AuNS @ PEG, показан с помощью проточной цитометрии:контроль ( bi ), 25 частей на миллион ( ii ), 50 частей на миллион ( iii ), 100 частей на миллион ( iv ), 200 частей на миллион ( v ), 500 частей на миллион ( vi ) и 1000 частей на миллион ( vii )

Цитосовместимость наночастиц AuNS @ PEG была дополнительно подтверждена проточным цитометрическим анализом клеток, обработанных наночастицами AuNS @ PEG при различных концентрациях в течение 2 часов. При проточном цитометрическом анализе клетки окрашивали аннексином V-APC и 7-AAD после обработки PBS и наночастицами AuNS @ PEG. Клетки Neuroglia, обработанные PBS без окрашивания, использовали в качестве контроля (фиг. 3bi). Видно, что клетки обрабатывали наночастицами AuNS @ PEG в концентрациях 25, 50, 100, 200, 500 и 1000 ppm соответственно (рис. 3bi – vii). Взятые вместе с результатами анализа МТТ, наши результаты показали, что наночастицы AuNS @ PEG обладают хорошей цитосовместимостью, и не было явных изменений клеточной морфологии после обработки наночастицами AuNS @ PEG, что согласуется с данными MTT.

Компьютерная томография и биораспределение in vivo

Воодушевленные их высокими контрастными характеристиками CT в эксперименте in vitro, мы дополнительно подтвердили возможность использования наночастиц AuNS @ PEG в качестве контрастного агента CT in vivo. Наночастицы AuNS @ PEG (200 ppm) вводили внутривенно в хвостовые вены крысы. Такая доза наночастиц AuNS @ PEG была выбрана из-за результатов низкой токсичности и процента апоптоза МТТ и проточной цитометрии, а также высокой чувствительности КТ. Перед инъекцией в хвостовую вену и в различные моменты времени после инъекции в хвостовую вену были записаны КТ-изображения важных областей органов (рис. 4). Наше исследование направлено на проверку возможностей компьютерной томографии и почечного клиренса. Таким образом, мы подчеркиваем изменение органа почек и мочевого пузыря на КТ. Рисунок 4а - это КТ-изображение почки крысы до инъекции. По сравнению с предварительной инъекцией изображение почек значительно улучшается от 0,5 до 2 часов (рис. 4b – d). Зависимое от времени распределение наночастиц AuNS @ PEG у крыс также отслеживалось по величине сигнала CT после внутривенной инъекции. Визуализация почек и мочевого пузыря была значительно улучшена с 0,5 до 2 часов, а значение HU для них выросло с 95 до 464 и от 105 до 664. Через 6 часов после инъекции интенсивность КТ-контраста в почках крыс, очевидно, со временем уменьшается ( Рис. 4д). Через 24 часа после инъекции КТ-изображение органа мочевого пузыря становится полностью четким, демонстрируя превосходные свойства почечного клиренса наночастиц AuNS @ PEG (рис. 4f). Благодаря оптимальному размеру частиц и функционализации поверхности, удаление наночастиц AuNS @ PEG из крови во время циркуляции может быть очень медленным. Следовательно, эти результаты показывают, что полученные наночастицы AuNS @ PEG могут быть уникальным и многообещающим нанозондом для получения изображений КТ в реальном времени in vivo. Это полезно для будущих клинических применений, поскольку контрастные вещества можно вводить пациентам в больнице.

КТ-изображения крысы перед инъекцией ( a ) и в разные моменты времени (0,5, 1, 2, 6 и 24 ч) ( b - е ) после внутривенного введения наночастиц AuNS @ PEG (200 ppm)

Окрашивание H&E

Гистологические изменения в органах мышей были выполнены через 24 часа после инъекции наночастиц AuNS @ PEG, и результаты показаны на рис. 5. Мы можем видеть, что никаких явных изменений в гистологии основных органов не наблюдалось, и, что наиболее важно, в этих органах не остается остаточных наночастиц AuNS @ PEG. Основываясь на приведенных выше результатах, наночастицы AuNS @ PEG продемонстрировали хорошую биосовместимость и отсутствие очевидной токсичности in vivo, что обещает их использование в качестве нового контрастного агента для КТ-изображений для применения в биологической медицине.

Срезы тканей, окрашенные H&E: a сердце, b печень, c селезенка, d легкое, e почка и f кишечник. Масштабные линейки представляют 100 мм

Исследование почечной функции наночастиц AuNS @ PEG

Для дальнейшей оценки токсичности наночастиц AuNS @ PEG in vivo параметры BUN, Crea, β ₂ -MG и CO ₂ были измерены для исследования функции почек; мы проанализировали сыворотку. Эти значения позволяют оценить, насколько хороша функция почек у крысы. Значения BUN позволяют оценить мочеиспускательную функцию крысы. Изменяющееся значение Crea представляет различные заболевания в организме крысы. Β ₂ -Концентрация МГ в основном связана с функцией почечных канальцев. И значение CO ₂ может оценить функцию закисления почечных канальцев. Крысе давали наночастицы AuNS @ PEG в концентрации 200 ppm. Уровень этих результатов был исследован через 24 часа после инъекции, и не было различий между до и после инъекции наночастиц AuNS @ PEG крысам (таблица 1).

Выводы

Таким образом, мы разработали простые наночастицы AuNS @ PEG для применения в компьютерной томографии. Образующиеся наночастицы AuNS @ PEG имеют ультрамалые размеры, низкую токсичность, хорошую диспергируемость в воде, гемосовместимость и цитосовместимость в заданном диапазоне концентраций. Значения CT показывают, что наночастицы AuNS @ PEG имеют хорошее яркое изображение. Результаты визуализации in vitro показывают, что наночастицы AuNS @ PEG обладают сильными свойствами ослабления рентгеновских лучей в качестве нового контрастного агента для приложений компьютерной томографии, что также было продемонстрировано на компьютерной томографии почки крысы in vivo. Более того, распространение биологических исследований и изучение токсичности in vivo показывают, что наночастицы AuNS @ PEG могут метаболизироваться и обладают высокой биологической совместимостью. Таким образом, наночастицы AuNS @ PEG могут быть многообещающими кандидатами для медицинского применения.