Редокс-реактивные двойной-нацеленные наночастицы для доставки куркумина в митохондрии CD44-позитивных опухолей

Аннотация

Мы спроектировали многофункциональную мицеллярную систему, которая одновременно нацелена на CD44 рецепторы на опухолевых клетках и митохондрии внутри этих клеток. Носитель, обозначенный TPP-oHA-S-S-Cur, собирается из (5-карбоксипентл)трифенилфосфониевого бромида (TPP), олигомерной гиалуроновой кислоты (oHA), редуктивно-расщепляемого дисульфидного линкера и куркумина (Cur). TPP обеспечивает митохондриальную аккумуляцию, oHA обеспечивает CD44-медированную эндоцитозу, а дисульфидная связь обеспечивает глутатион (GSH)-реактивное высвобождение. Характеризация ¹H-NMR подтвердила успешный синтез каждого компонента. Самосборка в водных средах дала мицеллы со средним диаметром 122,4 ± 23,4 нм и дзета-потенциалом −26,55 ± 4,99 мВ. In vitro исследования раскрыли выраженную редуксовую чувствительность и двойную нацеленность, подчеркивая эту платформу как перспективную стратегию для улучшения растворимости куркумина, снижения системной токсичности и усиления терапевтической мощности против рака.

Введение

Конвенциональные химиотерапевтические препараты часто страдают от плохой растворимости, быстрого клиренса и офф-таргет токсичности. Наноносители, способные увеличивать биодоступность препарата, обеспечивать активную нацеленность и стимуло-реактивное высвобождение, поэтому привлекают интенсивный исследовательский интерес. Куркумин, естественно встречающееся дифенольное соединение, изолированное из Curcuma longa, демонстрирует широкий антираковый эффект, но клинически ограничен своей гидрофобностью, химической нестабильностью и низкой оральной биодоступностью. Предыдущие усилия по инкапсуляции куркумина в полимерные мицеллы или липидные наночастицы улучшили его водную растворимость и удлинили время циркуляции; однако большинство формулировок лишены опухоль-специфической доставки или внутриклеточного контроля высвобождения.

Олигомерная гиалуроновая кислота (oHA) — короткий фрагмент HA, сохраняющий отличную гидрофильность, биосовместимость и способность связывать CD44 рецептор, который сверхэкспрессирован на многих твердых опухолях, включая рак груди и легких. CD44-медированный эндоцитоз предлагает путь для селективного захвата злокачественными клетками. Более того, митохондрии являются критическими регуляторами апоптоза, и митохондриальная нацеленность показана усиливающей антираковитую эффективность. Липофильные катионы, такие как трифенилфосфоний (TPP), селективно аккумулируются в митохондриях из-за отрицательного мембранного потенциала органеллы.

Внутриклеточные концентрации глутатиона (GSH) обычно составляют 2–10 мМ в опухолевых клетках, заметно выше, чем в нормальных тканях. Дисульфидные связи эффективно расщепляются GSH, предоставляя механизм для контролируемого высвобождения препарата в микросреде опухоли. Объединяя эти концепции, мы спроектировали TPP-oHA-S-S-Cur как двойной-нацеленный, редуктивно-реактивный наносноситель, способный доставлять куркумин в CD44-позитивные опухолевые клетки и их митохондрии, обеспечивая быстрое высвобождение препарата в ответ на повышенные уровни GSH.

Материалы и методы

Материалы

Куркумин (Shanghai Zhanyun Chemical Co. Ltd), oHA (Mn = 10 кДа, Shandong Freda Biological Engineering Co. Ltd), 3,3'-дитиодипропионовая кислота (Adamas Reagent Co. Ltd), TPP бромид, THF, DMSO, TEA, EDC, DMAP и аналитические реактивы получены от стандартных поставщиков.

Синтез TPP-oHA-S-S-Cur

Синтез проходил в трех этапах (Рисунок 2). Сначала TFF этерифицировали с oHA через EDC/DMAP сцепление в DMSO для получения TPP-oHA. Вторые, 3,3'-дитиодипропионовая кислота активировали оксалил хлоридом, затем сцепили с куркумином под катализом TEA для формирования S-S-Cur. Наконец, S-S-Cur сцепили с TPP-oHA через еще одну EDC/DMAP-медированную реакцию, давая итоговый амфифильный полимер. Диализ (MWCO 2000 Da) и лиофилизация удалили нереагировавшие малые молекулы. ¹H-NMR спектры (Рисунок 3) подтвердили появление характерных ароматических пиков TPP (7,57–7,72 ppm) и метиленового сигнала S-S-Cur при 2,50 ppm, устанавливая успешный синтез.

Подготовка и характеристика мицелл

TPP-oHA-S-S-Cur (10 мг) и куркумин (1,5 мг) растворяли в формамиде (6 мл), затем диализировали против деионизированной воды (MWCO 2000 Da) в течение 24 ч в темноте для удаления растворителя. Центрифугирование при 2500 об/мин в течение 10 мин удалило любую неинкапсулированную куркумин. Полученную суспензию фильтровали (0,45 мкм) для получения Cur/TPP-oHA-S-S-Cur мицелл. Размер, полидисперсность (PDI) и дзета-потенциал измеряли динамическим световым рассеянием (DLS) на системе Delsa Nano C; морфологию изучали TEM (Hitachi H-600). Загрузка препарата (DL) и эффективность инкапсуляции (EE) квантифицировали HPLC при 425 нм после фильтрации (0,45 мкм).

Редуктивно-стимулируемое высвобождение

Профили высвобождения оценивали диализом против PBS (pH 7,4, 45% FBS, 0,5% Tween 80) содержащего 0, 2 или 10 мМ GSH при 37 °C. Образцы собирали в определенные временные точки до 120 ч и анализировали HPLC. Высвобождение куркумина заметно увеличивалось с концентрацией GSH, подтверждая расщепление дисульфидной связи.

Клеточные исследования

МДА-МБ-231 клетки рака груди (высокая CD44 экспрессия) культивировали в DMEM с 10% FBS. Цитоксичность оценивали MTT после 24-часового воздействия свободного куркумина, Cur/oHA-Cur мицелл или Cur/TPP-oHA-S-S-Cur мицелл при 0,5–40 мкг/мл. Клеточный захват и митохондриальная локализация визуализировали конфокальной флуоресцентной микроскопией, используя интринзичную флуоресценцию куркумина и окраску MitoTracker Red CMXROS. Потоковая цитометрия квантифицировала среднюю флуоресцентную интенсивность (MFI) клеток, инкубированных с каждой формулировкой во времени.

Результаты и обсуждение

Характеристика носителя

Рисунок 2 описывает синтетический путь; ¹H-NMR спектры (Рисунок 3) подтверждают каждый этап сцепления. Мицеллы демонстрировали единообразную сферическую морфологию со средним диаметром 122,4 ± 4,6 нм и низким PDI 0,132 (Рисунок 4). Дзета-потенциал −21,56 ± 1,46 мВ для Cur/TPP-oHA-S-S-Cur мицелл указывает на улучшенную коллоидную стабильность по сравнению с Cur/oHA-Cur мицелл (−19,17 ± 0,55 мВ). Загрузка препарата и EE составляли 7,8% и 94,3% соответственно, превосходя конвенциональные мицеллы.

Редуктивно-триггерируемое высвобождение

В PBS без GSH только 32,5% куркумина высвобождалось за 120 ч, в то время как наличие 2 мМ или 10 мМ GSH ускоряло высвобождение до 57,5% и 75,3% соответственно (Рисунок 5). Эта GSH-зависимая высвобождение демонстрирует способность системы освобождать препарат предпочтительно в редуктивной микросреде опухоли.

Цитоксичность

MTT анализы (Рисунок 6) раскрыли, что Cur/TPP-oHA-S-S-Cur мицеллы показали наименьший IC₅₀ (3,87 мкг/мл) по сравнению с свободным куркумином (6,53 мкг/мл) и Cur/oHA-Cur мицелл (5,09 мкг/мл), указывая на усиленную внутриклеточную мощность, вероятно, из-за комбинированной CD44 и митохондриальной нацеленности.

Клеточный захват и митохондриальная локализация

Флуоресцентная микроскопия (Рисунок 7) показала быстрое, время-зависимое накопление Cur/TPP-oHA-S-S-Cur мицелл в МДА-МБ-231 клетках, с более высокой интенсивностью, чем Cur/oHA-Cur мицеллы. Предварительная инкубация с свободной HA (2 мг/мл) снизила захват, подтверждая CD44-медированный вход. Ко-окраска с MitoTracker Red раскрыла сильную колокализацию флуоресценции куркумина с митохондриальными маркерами (Рисунок 8), подтверждая митохондриальную нацеленность через TPP.

Потоковая цитометрия

MFI измерения (Рисунок 9) отражали наблюдения микроскопии, с Cur/TPP-oHA-S-S-Cur мицеллами, достигающими значительно более высокой флуоресценции во всех временных точках (p < 0,05).

Заключение

Мы разработали редуктивно-реактивную, двойной-нацеленную наночастицу платформу, доставляющую куркумин в CD44-позитивные опухолевые клетки и их митохондрии, обеспечивая контролируемое высвобождение в присутствии высокого GSH. TPP-oHA-S-S-Cur мицеллы демонстрируют превосходную загрузку препарата, стабильность и клеточный захват, преобразуясь в усиленную цитоксичность in vitro. Эта платформа решает проблемы растворимости и биодоступности куркумина и предоставляет универсальный носитель для гидрофобных антираковых агентов. Будущие in vivo исследования оценят терапевтическую эффективность и биодистрибуцию.

Аббревиатуры

oHA

Олигомерная гиалуроновая кислота

S-S-Cur

Дитиодипропионат-куркумин конъюгат

TPP

(5-Карбоксипентл)трифенилфосфоний бромид