Инженерные монодисперсные GFP-доперированные силициевые наночастицы для эффективной внутриклеточной доставки белков и биообраза

Аннотация

Сообщается об оптимизированном одностадийном синтезе, дающем монодисперсные наночастицы кремнезема, доперированные зеленым флуоресцентным белком (GFP), диаметром 15–35 нм. Метод использует L-аргинин-катализированную соль-гель химию в двухфазной системе цикгексан/вода, позволяя селективно включать GFP в ядро, оболочку или оба без потери флуоресценции белка. Детальная характеристика — ТЭМ, ДСС, зета-потенциал, флуоресценционная спектроскопия и анализ квантового выхода — показывает, что GFP сохраняет свои фотофизические свойства и достигает квантового выхода 0,62 против 0,38 для свободного GFP. Исследования стабильности показывают пренебрежимо малую утечку белка, повышенную термическую стойкость и фотostability, в то время как протеазные анализы подтверждают защиту от энзиматического деградации. Тесты клеточного поглощения в клетках легкого карциномы A549 раскрывают эффективную эндоцитозную интернализацию и цитозольную доставку GFP с минимальным лисосомальным кенчанием. Эти находки устанавливают GFP-доперированные силициевые наночастицы как надежные, многофункциональные платформы для внутриклеточной доставки белков и высокоразрешающего биообраза.

Введение

Инкапсуляция белков в наночастицы — краеугольный камень современной биомедицинской технологии, позволяя биосенсирование, контролируемую доставку и тканевую инженерию. Сохранение конформации и активности белка во время инкапсуляции критично, особенно для терапевтических антител и ферментов. Кремнезевые наночастицы, ценные за биосовместимость и настраиваемую химию, предлагают привлекательную матрицу для запечатления белков. Предыдущие подходы — обратная эмульсия, соль-гель, мезопористый кремнезем — часто требуют суровых условий, которые могут денатурировать чувствительные белки или давать широкие распределения размеров. Здесь представлен мягкий, масштабируемый протокол, сохраняющий флуоресценцию GFP и производящий узко распределенные частицы, пригодные для внутриклеточной доставки.

Методы

Материалы

Все реактивы приобретены у Sigma-Aldrich и использованы без дополнительной очистки. Ультрачистая вода (18,2 МОм) служила для всех водных стадий.

Подготовка GFP

GFP с N-терминальным His₆-тегом экспрессировали в E. coli XL1-Blue с вектором pQE, очищали никель-аффинной хроматографией и буфер-обменивали в 7,2 мМ L-аргинин (pH 10,3) или 10 мМ NaHCO₃ (pH 9,2). Финальная концентрация 1 мг/мл.

Синтез наночастиц

Ядра формировали гидролизом 5,5 мл TEOS в 69 мл воды, содержащей 91 мг L-аргинина и 4,5 мл цикгексана при 40 °C 20 ч. Последующий рост оболочки включал 10 мл дисперсии ядер, 5 мл цикгексана и 3,52 мл TEOS, снова при 40 °C 20 ч. GFP (200 мкг) добавляли через 30 мин после добавления TEOS для включения белка во время нуклеации.

Очистка

Наночастицы диализировали (MWCO 10 кДа) против воды 4 ч с периодическими обменами, затем стерильно фильтровали (0,22 мкм).

Характеризация

ТЭМ (JEM-2100F) квантифицировало диаметры ядер. ДСС (Malvern Zetasizer) давало гидродинамические диаметры и зета-потенциалы. Флуоресценционные спектры (Fluoromax-3) записывали при возбуждении 488 нм; квантовые выходы рассчитывали относительно родямина 6G и Atto488 методом Уильямсона. Стабильность зондировали термической инкубацией (20 °C vs 60 °C), фотоблеккированием под зеленым LED, и протеазой K. Аналитическая ультрацентрифугация (Beckman-Coulter XL-80 K) оценивала удержание GFP. Клеточное поглощение оценивали в клетках A549 конфокальной микроскопией после 24-часового воздействия 37 мкг/мл SiO₂ наночастиц (5 мкг/мл GFP) или свободного GFP.

Результаты и обсуждение

Морфология и размер частиц

Получены три поколения частиц: ядро (15,5 ± 1,1 нм), ядро + оболочка 1 (23,5 ± 2,0 нм), ядро + оболочка 1 + оболочка 2 (35,3 ± 2,0 нм). Распределение размеров оставалось <10 % полидисперсности, независимо от загрузки GFP или выбора буфера. Немаркированные контроли показывали идентичные диаметры, подтверждая, что включение белка не нарушает рост.

Зета-потенциал

Все формулировки демонстрировали высокоотрицательные зета-потенциалы (−28 до −36 мВ), указывая на надежную электростатическую стабильность и то, что включение GFP не меняет поверхностный заряд.

Флуоресцентные свойства

Максимумы эмиссии последовательно центрировались при 508 нм, совпадая со свободным GFP. Нормализованная флуоресцентная интенсивность пропорционально возрастала с числом GFP-доперированных оболочек, отражая объемное масштабирование. GFP, включенный из L-аргинин буфера, давал 1,3-кратно более высокую интенсивность, чем из NaHCO₃, вероятно, из-за более высокого pH (10,3 против 9,2). Измерения квантового выхода выявили 0,62 для GFP-доперированных частиц против 0,38 для свободного GFP, показывая, что силициевая матрица повышает фотонную эффективность, возможно, за счет ограничения движения белка и экранирования от кенчеров.

Стабильность

• Утечка белка: ультrafильтрация через 100 кДа мембраны не выявила GFP в фильтрате.
• Термическая стабильность: после 24 ч при 60 °C GFP-доперированные частицы удерживали 20 % начальной флуоресценции, тогда как свободный GFP терял весь сигнал.
• Фотостабильность: после 20 мин воздействия LED наночастицы сохраняли 89 % флуоресценции, против 81 % для свободного GFP.
• Стойкость к протеазам: после 90 мин с протеазой K GFP-доперированные частицы сохраняли 52 % флуоресценции, против <7 % для свободного белка.

Клеточное поглощение

Конфокальное изображения клеток A549 показали перинуклеарную флуоресценцию после обработки наночастицами, указывая на эндоцитозную интернализацию и цитозольную доставку GFP. Внутриклеточный GFP сигнал не наблюдался для свободного белка, согласуясь с ограниченной интернализацией или быстрым лисосомальным деградированием.

Заключение

Разработан универсальный низкотемпературный синтез, дающий монодисперсные GFP-доперированные силициевые наночастицы (15–35 нм) с сохраненной флуоресценцией, высоким квантовым выходом и превосходной стабильностью. Способность контролировать размещение белка в ядре или оболочке позволяет проектировать многофункциональные носители. Важно, что силициевая матрица защищает груз от термического, фотонного и энзиматического деградации и облегчает эффективную внутриклеточную доставку. Эти частицы представляют перспективную платформу для таргетированных белковых терапевтов и передовых биообраза.