Наночастицы кремнезема для доставки внутриклеточного белка:новый подход к синтезу с использованием зеленого флуоресцентного белка

Фон

В последние годы инкапсуляция белков в микро- и наночастицы привлекла широкое внимание благодаря широкому потенциалу применения таких материалов, как биосенсоры [1] или биореакторы [2], а также в области контролируемой доставки белков [3], внутриклеточная доставка белка [4] и тканевая инженерия [5]. Во многих из этих применений каталитическая активность инкапсулированных ферментов является одной из основных функций таких материалов. Напротив, фармацевтически релевантные белки, пептидные гормоны или антитела в качестве потенциального груза таких наноматериалов выполняют свою функцию путем специфического связывания мишеней в тканях или клетках. Следовательно, одним из предварительных условий всех этих применений является поддержание неповрежденной конформации и функциональности грузовых белков. Наноструктурированные системы стали одним из наиболее быстро развивающихся направлений биомедицинских исследований из-за их небольшого размера, большой удельной поверхности и других уникальных свойств [6]. Следовательно, разработка новых носителей твердых частиц для улучшения функциональности и стабильности разработанных систем является важной темой в этой области [7]. Матрица носителей в виде наночастиц может быть основана на биомакромолекулярных или органических компонентах, таких как углеводы, липиды или полимеры, образуя системы, такие как твердые липидные наночастицы, липосомы или дендримеры. Кроме того, наноструктурированные системы также могут быть основаны на неорганических материалах, таких как металлы или оксиды [8]. Все эти системы материалов должны удовлетворять как общим, так и особым требованиям. Прежде всего, матричные материалы должны быть биосовместимыми, чтобы облегчить безопасное применение [9]. Во-вторых, они должны быть достаточно стабильными, чтобы выполнять свою функцию материалов-носителей на протяжении всего жизненного цикла систем. Кроме того, они должны обеспечивать значительную белковую нагрузку и удерживание, а также контролируемое высвобождение белка [10].

Помимо прикрепления белков к поверхности нанообъектов посредством адсорбции или ковалентного связывания [11], белки могут быть захвачены в наноструктурах, тем самым повышая их стабильность и ферментативную активность [2]. Нанообращение может быть достигнуто путем гидролиза и конденсации предшественника диоксида кремния с помощью золь-гель обработки [12] или с помощью подходов к микроэмульсии вода-в-масле, вызывая полимеризацию фермента, окружающего оболочку, на границе раздела вода-масло [13]. В этих методах захват белков может происходить двумя разными химическими подходами, с использованием процессов ковалентного или нековалентного связывания [14]. В частности, аморфный диоксид кремния является перспективным материалом-носителем для белков из-за его высокой биосовместимости, инертности и механической стабильности [15]. Были использованы различные пути, особенно биомиметические подходы для инкапсуляции ферментов в диоксид кремния [2, 16], в соответствии с которыми профиль высвобождения ферментов регулируется химическими реакциями линкера или разложением кремнеземной матрицы. Мезопористые материалы также использовались в качестве матрицы для иммобилизации ферментов в порах от 2 до 50 нм [13, 17]. Высвобождение груза из мезопористых наночастиц можно регулировать, используя стратегию «привратника» или модифицируя внутреннюю поверхность пор для контроля аффинности связывания с лекарствами [10b]. Тем не менее, размер пор может ограничивать загрузку ферментов в мезопористые каркасы из диоксида кремния [18], поэтому в последнее время изучаются новые стратегии доставки белка.

Поскольку наночастицы кремнезема широко используются для биоимиджинга [19], включение флуоресцентных белков является одним из вариантов создания биосовместимых флуоресцентных зондов. Например, включение зеленого флуоресцентного белка (GFP) в наночастицы кремнезема с помощью методов обратной эмульсии описано в литературе [20]. Эти исследования показывают, что включение GFP в матрицу частиц диоксида кремния не только увеличивает интенсивность флуоресценции белка, но также его термостабильность, устойчивость к химической денатурации и обработке протеазами. Тем не менее, этот метод менее подходит для синтеза четко определенных наночастиц диоксида кремния в нижнем наноразмерном диапазоне с узким распределением по размерам. Кроме того, условия синтеза включают контакт с поверхностно-активными веществами, спиртами или щелочными основаниями, а также высокие температуры, которые могут быть несовместимы с включением чувствительных белков [20, 21].

Таким образом, мы сообщаем о новом подходе к приготовлению белковых наночастиц диоксида кремния с использованием GFP в качестве модельного белка. Для этой цели мы использовали однореакторный синтез в мягких условиях синтеза (комнатная температура, низкая соленость) с последующими стадиями диализа для очистки. Подход характеризуется своим потенциалом для получения захваченных белком наночастиц диоксида кремния, демонстрирующих узкое распределение по размерам в режиме размеров менее 50 нм.

Методы

Материалы

Все химические вещества использовали в том виде, в котором они были закуплены у Sigma-Aldrich (Тауфкирхен, Германия), без дополнительной очистки. Для всех стадий синтеза и очистки использовалась сверхчистая вода (18,2 МОм, система очистки воды Milli-Q типа ELIX 20, Millipore Corp., США).

Подготовка GFP

GFP получали экспрессией белка и последующей очисткой, как описано в другом месте [22]. Вкратце, GFP, включающий N-концевую метку His6, экспрессировали с использованием бактериального вектора экспрессии высокого уровня на основе векторной системы pQE (Qiagen, Hilden, Германия) в E. coli XL1-Blue и очищают с помощью Ni-заряженной аффинной хроматографии (Qiagen, Hilden, Германия). Затем белок переносили в концентратор (мембрана с отсечкой по молекулярной массе 3 кДа (MWCO), Pall, Dreieich, Германия) для замены буфера. GFP промывали три раза, добавляя 15 мл раствора-аргинина и бикарбоната натрия, соответственно, а затем выделяли в 3 мл раствора-аргинина / бикарбоната натрия. После этого суспензию GFP фильтровали в стерильные пробирки через стерильные ацетатцеллюлозные фильтры 0,22 мкм (Carl Roth, Карлсруэ, Германия). Перед использованием концентрацию белка доводили до 1 мг / мл ^-1 . либо в 7,2 ммоль л ^-1 ʟ-аргинин (pH =10,3) или 10,0 ммоль л ^-1 NaHCO ₃ (pH =9,2) раствор.

Синтез и очистка наночастиц

Наночастицы кремнезема получали согласно модифицированному протоколу, описанному ранее [23]. Вкратце, тетраэтоксисилан (TEOS), используемый в качестве неполярного предшественника, подвергался гидролизу в двухфазной системе вода / циклогексан посредством катализа β-аргинина.

Подготовка основных частиц

В трехгорлой круглодонной колбе 91 мг (0,52 ммоль)-аргинина растворяли в 69 мл воды перед добавлением 4,5 мл циклогексана в качестве верхнего слоя. Реакционную смесь нагревали до 40 ° C при перемешивании. После добавления 5,5 мл (24,63 ммоль) TEOS смесь выдерживали в этих условиях еще 20 часов.

Слои кремнеземной оболочки

Для последующих стадий роста оболочки использовали либо частицы ядра, либо частицы, полученные на первой стадии роста оболочки. Для роста скорлупы 14 мг (0,08 ммоль)-аргинина растворяли в 36 мл воды и добавляли 10 мл предварительно приготовленных дисперсий частиц. После добавления 5 мл циклогексана смесь нагревали до 40 ° C. После добавления 3,52 мл (15,8 ммоль) TEOS смесь перемешивали еще 20 часов.

Приготовление наночастиц, допированных GFP. Для приготовления наночастиц, легированных GFP, через 30 мин после добавления TEOS добавляли 200 мкг (6,9 нмоль) GFP.

Очистка от частиц

Наночастицы очищали путем последующего диализа против воды (4 л, водообмен через 30, 90 и 180 мин) в течение 4 ч с использованием мембраны из гидрата целлюлозы (трубка для диализа Надир, MWCO 10 кДа, Carl Roth, Карлсруэ, Германия). Наконец, наночастицы фильтровали в стерильные колбы с использованием стерильных мембранных фильтров из ацетата целлюлозы 0,22 мкм (Carl Roth, Карлсруэ, Германия).

Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ)

Морфологию и средний диаметр частиц определяли с помощью микроскопа JEM-2100F (JEOL, Фрайзинг, Германия). Распределение частиц по размерам определяли на случайном образце из 50 наночастиц с использованием программного обеспечения X-ImageJ (версия:1.45 s, winPenPack X-ImageJ Launcher от Национального института здравоохранения (http://rsb.info.nih.gov/ij /).

Гидродинамический диаметр

Гидродинамический диаметр наночастиц регистрировали с помощью Zetasizer Nano ZSP (Malvern Instruments, Херренберг, Германия). Перед измерениями дисперсии частиц разбавляли водой 1:10. Измерения проводились при 25 ° C. Каждый образец был измерен 3 × 15 раз. Диаметр определялся расчетом распределения объема. Это было преобразовано из распределения интенсивности по размерам с использованием теории Ми.

ζ-потенциал

Ζ-потенциал измеряли с использованием того же прибора в описанных выше условиях, за исключением того, что образцы разбавляли 0,01 М KCl (9:1).

Аналитическое ультрацентрифугирование (AUC)

Для измерения скорости седиментации использовался модифицированный Beckman-Coulter XL-80 K с ротором AnTi60. Для экспериментов устанавливали температуру 20 ° C, скорость 10 000 об / мин и выполняли 21 сканирование. Длины волн были установлены на 261 нм для кремнезема и 488 нм для обнаружения GFP.

Флуоресцентная спектроскопия

Спектры флуоресценции наночастиц, чистого GFP и фильтрата из экспериментов по выщелачиванию регистрировали с помощью спектрофлуориметра Fluoromax-3 (Spex, Horiba Scientific, Оберурзель, Германия). Для измерений чистый GFP, дисперсии частиц и фильтрат разбавляли водой 1:10. Длину волны возбуждения устанавливали равной 488 нм, и спектр регистрировали в спектральном диапазоне от 498 до 800 нм.

Квантовые выходы флуоресценции

Квантовые выходы полученных наночастиц и чистого GFP определяли с использованием относительного метода Williamson et al. [24]. В качестве эталона для GFP использовали родамин 6G и Atto488. Сравнительные измерения проводились с использованием нелегированных наночастиц, смешанных с эталонным красителем. Спектры флуоресценции регистрировали при длине волны возбуждения 450 нм. Дополнительные УФ / видимые измерения были выполнены с использованием Varian Cary 300 Scan UV (Agilent Technologies, Дармштадт, Германия).

Для расчета квантового выхода уравнение. Было использовано 2.

Здесь φ _P квантовый выход продукта, φ _S квантовый выход эталона. Условия наклона _S и уклон _P представляют собой наклоны, полученные из графиков интегральной интенсивности флуоресценции в зависимости от оптической плотности эталона и продукта, соответственно. нет _P и н _S соответствуют показателю преломления используемого растворителя [25].

Утечка протеина

Для экспериментов по выщелачиванию неразбавленные дисперсии частиц подвергали ультрафильтрации через мембраны из модифицированного полиэфирсульфона (MWCO =100 кДа или 300 кДа, Pall, Dreieich, Германия) центрифугированием (16000 g, 5 мин).

Термическая стабильность

Для анализа термостабильности наночастицы и чистый GFP выдерживали в течение 0 и 24 ч при 20 или 60 ° C. Наночастицы и чистый GFP разбавляли, как описано выше.

Фотообесцвечивание

Чтобы исследовать стабильность наночастиц, легированных GFP, и чистого GFP против фотообесцвечивания растворы подвергали воздействию света, излучаемого семью зелеными светодиодами в течение периода времени до 20 минут. Интенсивность флуоресценции образцов, взятых в t =0, 2 и 20 мин.

Устойчивость к расщеплению белков

Чтобы определить стабильность GFP против протеиназы K, чистый GFP, немеченые наночастицы кремнезема (C _U S _1U S _2U ) с дополнительным GFP и трижды меченными наночастицами кремнезема (C _F S _1F S _2F ) были использованы при одинаковых концентрациях GFP и одинаковом количестве частиц. Все образцы были разбавлены 1:100. Из количества 10 молекул GFP была выбрана одна молекула протеиназы К. Перед добавлением фермента один образец был измерен в вышеуказанных условиях. После добавления измерения были выполнены через t =0, 15, 30, 45, 60 и 90 мин.

Эксперименты по использованию сотовой связи

Чтобы определить интернализацию наночастиц и GFP клетками, были проведены эксперименты по поглощению клетками с использованием линии клеток карциномы легкого A549 (ACC-107).

Культивирование клеток

Клетки A549 (DSMZ, Брауншвейг, Германия) культивировали в колбах Т75 (Greiner bio-one, Фриккенхаузен, Германия) с использованием среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Thermo-Fisher-Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), содержащей 10% плода. телячья сыворотка (FCS). 2 × 10 ⁴ см ⁻² Клетки A549 высевали на покровные стекла в 12-луночные планшеты и культивировали в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали наночастицами, легированными GFP, и раствором GFP в 1 мл среды в течение 24 часов. SiO ₂ концентрация наночастиц составляла 37 мкг мл ^-1 в то время как концентрация GFP составляла 5 мкг мл ^-1 как для наночастиц, так и для чистого GFP. После обработки клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS).

Подготовка образцов и конфокальная визуализация

Клетки фиксировали 4% параформальдегидом в PBS в течение 20 мин при комнатной температуре. Для окрашивания клеточной мембраны конъюгированный с тетраметилродамином WGA (агглютинин зародышей пшеницы (2 мкг мл ^-1 (в PBS), добавляли W849, Thermo-Fisher-Scientific (Invitrogen), Waltham, MA, USA) и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. После трех стадий промывки PBS клетки трижды промывали PBS и помещали на предметные стекла с помощью Mowiol / DABCO (Carl Roth, Карлсруэ, Германия).

Конфокальные изображения получали на системе TCS SP5 (Leica, Wetzlar, Германия). Для получения изображений использовался масляный иммерсионный объектив 63 × ( n =1,518). Последовательное сканирование проводилось с использованием линии аргон-ионного лазера на λ =488 нм (25%) для возбуждения GFP и твердотельного лазера с диодной накачкой на λ =561 нм (25%) для возбуждения тетраметилродамина.

Результаты и обсуждение

Это исследование направлено на функционализацию наночастиц диоксида кремния с помощью GFP в подходящих условиях, которые поддерживают биохимические характеристики и функциональность белка. В предыдущей работе мы синтезировали монодисперсные флуоресцентные наночастицы диоксида кремния, легированные в ближнем ИК-диапазоне, в диапазоне размеров от 15 до 80 нм, используя контролируемый ʟ-аргинином гидролиз тетраэтоксисилана (TEOS) в двухфазной системе циклогексан / вода [26]. Здесь мы приняли эту процедуру синтеза, чтобы внедрить GFP в качестве модельного белка в матрицу кремнезема. На схеме 1 схематически изображена процедура синтеза частиц. Легированные GFP и нелегированные структуры (сердечник / оболочки) выделены зеленым и серым цветом соответственно. На первом этапе частицы ядра диоксида кремния, легированные GFP (C _F ) были получены. Последующие шаги восстановления роста (C _F S ₁ и C _F S ₁ S ₂ ) позволил синтезировать частицы большего размера. На первом этапе восстановления оболочка была изменена с помощью (C _F S _1F ) или без (C _F S _1U ) включение белка. Точно так же на втором этапе возобновления роста либо помеченный (C _F S _1F S _2F , C _F S _1U S _2F ) или немаркированный (C _F S _1F S _2U , C _F S _1U S _2U ) была добавлена ​​оболочка. Эти вариации позволяют превосходно контролировать количество встроенного белка и его индивидуальное расположение в определенных оболочках или ядре частицы. Кроме того, наночастицы чистого кремнезема без встроенного GFP (C _U , C _U S _1U , и C _U S _1U S _2U ) были синтезированы для исследования потенциального влияния встраивания белка на свойства частиц. Кроме того, на всех этих этапах GFP растворяли в двух разных буферных системах (-аргинин и NaHCO ₃ ) различных значений pH, чтобы определить влияние белкового растворителя на синтез частиц, морфологию, интенсивность флуоресценции, длину волны излучения и ζ-потенциал.

Обзор синтезированных частиц и их структуры. Зеленый цвет указывает на встраивание GFP либо в ядро, либо в оболочки соответственно. Серый цвет представляет оболочки без GFP (C _F =Сердцевина флуоресцентная, C _U =Ядро без ярлыка, S _F =Оболочка флуоресцентная, S _U =Оболочка без метки, S ₁ =Первый слой оболочки, S ₂ =Второй слой оболочки)

Характеристика наночастиц

Определение атрибутов физических частиц

Для описания размера и морфологии частиц после включения GFP и для определения влияния двух различных буферных систем на эти свойства были записаны изображения ПЭМ (рис. 1). Дополнительные изображения ПЭМ GFP (NaHCO ₃ ) модифицированные, модифицированные GFP (-аргинин) и немеченые наночастицы представлены в SI (Дополнительный файл 1:Рисунок S1, Дополнительный файл 2:Рисунок S2, Дополнительный файл 3:Рисунок S3, Дополнительный файл 4:Рисунок S4). После процедуры синтеза с двумя стадиями повторного роста были получены частицы трех различных размеров. Частицы ядра имели размер около 15 нм, частицы после первой стадии повторного роста около 22 нм и частицы после второй стадии около 32 нм. Таким образом, все наночастицы были приблизительно сферическими и имели узкое распределение по размерам ( p <10%). Три поколения полностью окрашенных наночастиц GFP (ʟ-аргинин) (C _F , C _F S _1F , и C _F S _1F S _2F ) и GFP (NaHCO ₃ ) (C _F ) ядерные наночастицы были выбраны в качестве модели.

ПЭМ-изображения трех поколений наночастиц, модифицированных GFP--аргинином, и частиц ядра GFP (NaHCO ₃ ) модифицированные наночастицы. В а , c и d показаны три поколения GFP (ʟ-аргинин):C _F частицы ядра ( a , d _ТЕМ =15,5 ± 1,1 нм); C _F S _1F наночастицы после первого этапа роста (ядро + оболочка 1) ( c , d _ТЕМ =23,5 ± 2,0 нм) и C _F S _1F S _2F после второго этапа отрастания (ядро + оболочка 1 + оболочка 2) ( d , d _ТЕМ =35,3 ± 2,0 нм). В б , GFP (NaHCO ₃ ) -меченные ядерные наночастицы (d _TEM =15,2 ± 1,2 нм)

Сравнивая размеры различных наночастиц, допированных и немеченых GFP (таблица 1), следует отметить, что одинаковое количество стадий возобновления роста привело к одинаковому среднему размеру частиц, независимо от присутствия белка или используемого буферного раствора. Немеченые частицы также имели аналогичный размер (C _U :d _ТЕМ =13,4 ± 0,4 нм, d _DLS =10 ± 3 нм; C _U S _1U :d _ТЕМ =20,9 ± 1,3 нм, d _DLS =20 ± 6 нм; C _U S _1U S _2U :d _ТЕМ =33,2 ± 1,0 нм, d _DLS =38 ± 10 нм).

В заключение, было продемонстрировано, что включение белка в матрицу диоксида кремния и буферный раствор, в котором был предоставлен белок, не оказало значительного влияния на размер и морфологию получаемых частиц.

Насколько нам известно, в литературе не описаны другие наночастицы диоксида кремния, встроенные в GFP, которые демонстрируют такие же малые размеры, а также столь же узкое распределение по размерам (<10%) [20, 27]. Такие маленькие наночастицы обладают многообещающим потенциалом применения в области доставки внутриклеточного белка, а также в диагностике и терапии рака [28].

ζ-потенциал

Ζ-потенциал всех наночастиц определялся расчетным путем с использованием их электрофоретической подвижности. Все типы легированных наночастиц проявляли отрицательный ζ-потенциал с абсолютными значениями от -28 до -36 мВ (рис. 2). Для сравнения, ζ-потенциал немеченых частиц показывает очень похожие значения:-35,5 ± 2,0 мВ для частиц ядра, -34,0 ± 3,7 мВ после первого этапа повторного роста и -34,5 ± 1,2 мВ после второго этапа повторного роста. Эти сильно отрицательные значения ζ-потенциала (<- 28 мВ) указывают на высокую стабильность наночастиц против агломерации из-за электростатического отталкивания. По сравнению с ζ-потенциалом немеченых наночастиц данные показывают, что ни полученный размер частиц, ни включение GFP в матрицу частиц ядра или оболочки не оказали значительного влияния на заряд частицы.

ζ-потенциал [мВ] меченых наночастиц. Наночастицы получали, исходя из GFP, растворенного либо в 7,2 мМ-аргинине, либо в 10 мМ NaHCO ₃ . . Планки погрешностей указать стандартное отклонение, полученное по трем измерениям

Спектроскопические исследования

Флуоресцентная спектроскопия

Все наночастицы диоксида кремния, легированные GFP, показали одинаковый максимум излучения ( λ _em =508 нм), что также было сопоставимо с максимумом эмиссии свободного GFP (SI, дополнительный файл 5:Рисунок S5). Для сравнения интенсивности флуоресценции различных меченых наночастиц концентрация наночастиц была нормализована (расчеты в SI 5.). Как и ожидалось, пошаговое добавление меченых оболочек вызвало усиление флуоресценции наночастиц (рис. 3).

Нормализованная интенсивность флуоресценции максимума излучения при 508 нм для каждой из различных систем частиц. Далее, теоретическая интенсивность флуоресценции ( серые точки ) частиц в зависимости от увеличения объема частиц

Наночастицы только с меченым ядром, но с нелегированной оболочкой, показали самую низкую флуоресценцию. Наночастицы с одной дополнительной меченой оболочкой проявляли промежуточную флуоресценцию, а наночастицы с двумя мечеными оболочками демонстрировали самую сильную флуоресценцию (рис. 3). Примечательно, что добавление внешней нелегированной оболочки, по-видимому, немного уменьшило флуоресценцию наночастиц по сравнению с наночастицами, имеющими легированный внешний слой. Этот эффект может быть вызван экранирующими эффектами немеченой оболочки из диоксида кремния. Таким образом, добавление оболочек, легированных GFP, к частицам ядра вызывало увеличение интенсивности флуоресценции полученных наночастиц, что, по-видимому, коррелировало с изменением объема, сопровождающим рост наночастиц.

Включение GFP, первоначально растворенного в-аргинине после очистки, привело к увеличению интенсивности флуоресценции полученных наночастиц в 1,3 раза по сравнению с наночастицами, полученными с помощью процесса встраивания аналога, начиная с GFP, растворенного в NaHCO ₃ . Точно так же GFP, разбавленный ʟ-аргинином, демонстрировал более высокую интенсивность флуоресценции по сравнению с GFP, разбавленным в NaHCO ₃ . (Дополнительный файл 5:Рисунок S5). Эффект можно объяснить разными значениями pH буферов (pH _{ʟ-аргинин} =10,3, pH \ (_ {{\ mathrm {NaHCO}} _ 3} \) =9,2).

По этой причине флуоресценцию чистого GFP систематически измеряли как функцию значения pH (SI, дополнительный файл 6:рисунок S6). Данные показали гиперболическое усиление флуоресценции с увеличением pH в диапазоне pH 5,5 - 10,5. Результаты согласуются с другими сообщениями о pH-зависимой флуоресценции GFP. Сообщалось, что для GFP дикого типа флуоресценция не изменяется в диапазоне pH 6-10, но уменьшается при более низком pH и увеличивается при значениях pH> 10 [29]. Кроме того, чувствительность GFP к pH может быть изменена путем введения точечных мутаций [30]. GFP, используемый в этом исследовании, обладает трехточечными мутациями по сравнению с Aequorea белок дикого типа, а именно S2A, F64L, S65T. Из них было показано, что замена серина в положении 65 на треонин увеличивает интенсивность флуоресценции белка при возбуждении на длине волны 480 нм, поскольку эта аминокислота участвует в образовании хромофора. Кроме того, вариант S65T / F64L демонстрирует pH-зависимую флуоресценцию [30]. Наночастицы, легированные GFP (C _F ) демонстрировал сопоставимую pH-зависимую флуоресценцию (рис. 3), что указывает на то, что на механизм зависимости pH не повлиял процесс заливки.

Квантовый выход флуоресценции

Чтобы дополнительно охарактеризовать свойства флуоресцентных наночастиц, были определены их квантовые выходы. Это было достигнуто путем построения графика зависимости интегральной интенсивности флуоресценции от оптической плотности при 488 нм (рис. 4). Впоследствии квантовые выходы были рассчитаны по формуле. 2. Используя родамин 6G в качестве эталона, квантовые выходы легированных GFP наночастиц C _F S _1F и чистый GFP был определен как φ \ (_ {\ mathrm {C}} _ ​​{\ mathrm {F}} {\ mathrm {S}} _ {1 \ mathrm {F}}} \) =0,62 и φ _pureGFP =0,38 соответственно. Результаты были подтверждены при использовании Atto488 в качестве второго эталона (SI, дополнительный файл 7:рисунок S7). Более высокий квантовый выход наночастиц, допированных GFP, по сравнению с чистым GFP, по-видимому, вызван инкапсуляцией GFP в матрицу кремнезема и может быть связан либо с пространственной иммобилизацией белка, либо с измененной химической средой, обеспечиваемой матрицей кремнезема. .

Графики интегральной интенсивности флуоресценции частиц, допированных GFP, и чистого GFP в зависимости от поглощения при 488 нм. Родамин 6G был использован в качестве ссылки. Линейная корреляция была аппроксимирована прямыми линиями . Соответствующие линейные уравнения выглядят следующим образом: y _pureGFP =1,00554 × 10 ¹⁰ × x , R ² =0,97712; y \ (_ {C_F {S} _ {1F}} \) =6,12332 × 10 ⁹ × x , R ² =0,99331; г _{родамин6G} =4,1772 × 10 ⁹ × x , R ² =0,99678

Устойчивость частиц

Утечка протеина

Были проведены эксперименты по выщелачиванию, чтобы доказать стабильность связывания наночастиц, допированных GFP. После ультрафильтрации через мембраны с MWCO, который позволяет пропускать GFP (MW ~ 27 кДа), но сохраняет наночастицы, в фильтрате не может быть обнаружена флуоресценция, что указывает на постоянное связывание GFP с матрицей диоксида кремния.

Аналитическое ультрацентрифугирование

Для подтверждения полученных результатов и определения типа связывания GFP с матрицей частиц было проведено аналитическое ультрацентрифугирование. For this purpose, labelled C_F S_1F S_2F particles and unlabelled C_U S_1U S_2U particles mixed with GFP were measured at the same particle and GFP concentrations. The results (Additional file 8:Figure S8 in the SI) indicate that most of the GFP molecules are embedded into the silica matrix during the synthesis.

Thermal Stability

To determine their thermal stability, the fluorescence signals of C_F in comparison to pure GFP were measured after incubation at room temperature and 60 °C respectively (Fig. 5). After 24 h at room temperature, no decrease in the fluorescence of both samples was detectable, indicating no influence on the protein stability. However, after 24 h at elevated temperature of 60 °C, only 20% of the initial fluorescence intensity of C_F could be observed, whereas no fluorescence signal of pure GFP reverted. This strongly indicates a higher thermal stability of GFP-embedded silica compared to pure GFP. Since an elevated temperature leads to a significant increase in the thermal motions of the protein molecule, which can disrupt its structure, it is hypothesised that the surrounding silica matrix protected the GFP against external influences by spatial constraints.

Influence of temperature (r.t., 60 °C) on the fluorescence of GFP-doped particles (C_F , ʟ-arginine) and pure GFP. The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm versus time [h] is shown

Photostability

Furthermore, the photostability of the samples was tested. For measurements, the nanoparticle stock suspension (C_F , ʟ-arginine) was diluted tenfold. Pure GFP was diluted in ʟ-arginine according to the calculated concentration of GFP in the nanoparticle suspension. After exposure of the samples to light of a green LED array over a period of time up to 20 min, the fluorescence intensity was measured (Fig. 6). Within 20 min, the fluorescence intensity of the nanoparticle suspension decreased only slightly. After 20 min, 89% of the initial fluorescence (100%) of the nanoparticles was preserved. In comparison, the pure GFP seemed to be more affected by light exposure. After 20 min, only 81% of the initial fluorescence of pure GFP remained. This result indicated, that GFP, when embedded into silica nanoparticles, was better protected from photochemical alterations induced by the LED light than the pure protein.

Photostability of GFP-doped nanoparticles (C_F ) and pure GFP in ʟ-arginine. The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm was measured after exposure to LED light for the given times. Data are mean values. Error bars indicate the standard deviation

Stability Against Protein Degradation

As a further characterisation step, the degradation of GFP in the presence of proteinase K was tested. Therefore, three different systems were used (pure GFP, unlabelled C_U S_1U S_2U mixed with GFP and labelled C_F S_1F S_2F ). For all systems, equal amounts of GFP and particles were used. After 90 min of incubation, the fluorescence intensity of pure GFP and unlabelled particles with added GFP decreased to 5 - 7% of the initial fluorescence intensity, whereas the one of the labelled particles decreased to 52% (Fig. 7). This result indicates that the GFP is protected by the silica matrix and is degraded slower than free GFP in presence of proteolytic enzymes.

Stability against protein degradation of pure GFP (grey ), unlabelled particles mixed with GFP (C_U S_1U S_2U , blue ), and GFP-doped silica nanoparticles (C_F S_1F S_2F , green ). The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm was plotted against the incubation time [min] with proteinase K

To conclude, the encapsulation of GFP into silica matrix appeared to bring about significant advantages:The stability of the protein was increased not only against elevated temperatures and light-induced photobleaching but also against the degradation through enzymes. Therefore, the silica matrix seems to protect the embedded GFP as compared to the free GFP.

Cellular Uptake Experiments

In order to determine, if the GFP-doped nanoparticles are able to deliver their cargo into cells, uptake experiments were performed (Fig. 8). A549 cells were exposed to GFP-doped nanoparticles and for comparison to the pure protein. In order to optimise the GFP load of the particles for imaging, a higher amount of GFP as compared to the nanoparticles described before was embedded into the particles. More specifically, a 20-fold amount of GFP in ʟ-arginine was used to label the second shell of the C_F S_1F S_2F particles. These nanoparticles were diluted to a final concentration of 37 μg SiO₂ per millilitre in cell culture medium and incubated for 24 h with the cells. The amount of GFP in both samples (nanoparticles and pure GFP) was 5 μg mL ⁻¹ .

Confocal microscopy images of A549 cells after 24 h exposure to GFP dissolved in ʟ-arginine (A1 –A3 ) and GFP-doped nanoparticles C_F S_1F S_2F (B1 –B3 ), and control cells (C ). Top (1):merge-images; middle (2):Cell membrane (WGA):red; bottom (3):GFP, green . Arrows indicate internalised nanoparticles. Contrast and brightness were enhanced by using the ImageJ software

In order to visualise the cells, the cell membrane was labelled, using tetramethylrhodamine-coupled WGA (wheat germ agglutinin). Confocal imaging was used to localise the GFP-doped nanoparticles and the pure GFP in the cells. After exposure of cells to GFP, no signal related to GFP was observed inside the cell bodies (Fig. 8a). Compared to the control cells, no difference in signal intensity of both channels could be observed (Fig. 8c).

In contrast, after exposure of the cells to the GFP-loaded nanoparticles, bright fluorescence signals were detected in the perinuclear region, indicating internalisation of the loaded nanoparticles through endocytosis. The GFP-loaded nanoparticles appeared to be excluded from the nuclear compartment. A second fraction of agglomerated nanoparticles was detected on top of the cell membrane (Fig. 8b).

In conclusion, the GFP-doped nanoparticles are internalised by the cells and are able to transport their cargo into the cells. After exposure of the cells to GFP, fluorescence signals were not detected inside the cell body. This finding is in line with the results of Pesce et al. [31], who did not observe cell-associated fluorescence after incubation of A549 cells with GFP for 24 h. The lack of cell-associated GFP signals might be due to the fact that GFP is not internalised by the cells. Alternatively, GFP fluorescence might be quenched by the low pH value present in endocytic vesicles or lysosomes or degraded by proteolytic enzymes. Therefore, the fluorescence signals of the nanoparticles might indicate a protective effect of the silica nanoparticle matrix against lysosomal degradation.

Conclusions

In this study, a novel approach is presented for synthesis of monodisperse GFP-doped silica nanoparticles with a mean particle-core size of 15 nm. By subsequent growth steps, the particle size and the amount of embedded GFP can be varied. At the end of this procedure, the fluorescence properties of GFP are kept. Incorporation of GFP into additional outer shells results in an increase in the nanoparticle fluorescence. Coverage of the nanoparticles by non-doped shells seems to slightly decrease their fluorescence. These properties indicate the potential to incorporate cargo molecules into specific particle shells. The GFP-doped nanoparticles exhibit a higher quantum yield as compared to the pure GFP. The incorporation into the silica matrix appeared to be durable, as no leaching of protein was detected by ultrafiltration. The silica matrix also seems to improve the thermal properties and photostability of the protein. Furthermore, it is possible to encapsulate different proteins in the different shells, in order to prepare multifunctional nano-carriers. Finally, the nanoparticles are applicable for intracellular delivery of their cargo. The incorporation of proteins into the particle matrix seems to increase delivery and reduce lysosomal degradation of the cargo. Therefore, the protein-doped silica nanoparticles constitute a promising novel tool for biomedical applications of nanoparticles, especially in the field of intracellular delivery of macromolecules.

Abbreviations

AUC:

Analytical ultracentrifuge

DLS:

Dynamic light scattering

FCS:

Foetal calf serum

GFP:

Green fluorescent protein

MW:

Molecular weight

MWCO:

Molecular weight cut off membrane

PBS:

Phosphate buffered saline

r.t.:

Room temperature

TEM:

Transmission electron microscopy

TEOS:

Tetraethoxysilane