Хитозановые, ферментово-реагирующие полые мезопористые кремнеземные наноплатформы для таргетированной доставки лекарств в толстую кишку

Аннотация

Разработана ферментово-реагирующая колоноспецифическая система доставки на основе полых мезопористых кремнеземных сфер (HMSS), к которым биодеградируемый хитозан (CS) прикреплен через расщепляемые азо-соединения (HMSS–N=N–CS). Доксорубицин (DOX) инкапсулирован в некристаллическом состоянии в полость и мезопоры HMSS с высокой загрузкой 35,2%. Ин витро высвобождение лекарства подтвердило, что HMSS–N=N–CS/DOX демонстрирует ферментозависимое высвобождение. Привитый CS повышает биосовместимость и стабильность, а также снижает адсорбцию белков на HMSS. Результаты тестов на раздражение слизистой ЖКТ и цитотоксичность клеток показали хорошую биосовместимость HMSS и HMSS–N=N–CS. Клеточный поглощенный анализ указал, что поглощение DOX заметно увеличивается после предварительной инкубации HMSS–N=N–CS/DOX с ферментной смесью толстой кишки. HMSS–N=N–CS/DOX, инкубированный с колоническими ферментами, проявил повышенную цитотоксичность, а его значение IC₅₀ было в три раза ниже, чем у группы HMSS–N=N–CS/DOX без колонических ферментов. Данная работа закладывает основу для последующих исследований мезопористых переносчиков для пероральной колоноспецифической доставки лекарств.

Введение

В последнее время стимуло-реагирующие системы доставки лекарств (ДДЛ) привлекли широкое внимание для эффективной загрузки и селективного высвобождения препаратов в целевых больных тканях [1]. Проектируемые стимуло-реагирующие системы могут доставляться в очаги заболевания и обеспечивать контролируемое высвобождение лекарства для улучшения терапевтического эффекта и предотвращения преждевременной утечки, вызывающей побочные эффекты. Все внутренние и внешние стимулы, такие как окислительно-восстановительный потенциал [2], pH [1], ферменты [3], температура и свет [4, 5], используются для создания стимуло-реагирующих ДДЛ. Среди этих стимулов ферменты, как внутренние стимулы, получили широкое внимание благодаря своим характерным концентрациям в разных тканях [6].

За последние два десятилетия мезопористые кремнеземные сферы (МКС) с мезопорами размером 2–50 нм установили себя как стимуло-реагирующие переносчики лекарств [7, 8], поскольку МКС обладают исключительно большим поровым объемом и высокой удельной поверхностью для высокой загрузочной способности, хорошо организованной поровой структурой, легко функционализируемой поверхностью и хорошей биосовместимостью [9]. Более того, нанчастицы полых мезопористых кремнеземных сфер (HMSS) с мезопористой оболочкой и полой полостью превосходят обычные МКС, так как полая структура может эффективно удерживать больше лекарств с более высокой емкостью хранения, чем переносчики МКС [10, 11]. Различные стимуло-реагирующие нанопереносчики на основе МКС были разработаны для размещения молекул лекарств с использованием различных «затворов», таких как полимеры [12], неорганические нанчастицы [13], дендримеры, биомакромолекулы [14], макrocиклические соединения пептидов [15] и липиды [16]. Хотя многочисленные ДДЛ на основе МКС с функциональными «затворами» могут реализовывать высвобождение в ответ на различные внешние или внутренние стимулы, мало из них использовались для колоноспецифической таргетированной доставки лекарств.

Известно, что пероральная доставка лекарств является предпочтительным и простым способом введения препаратов. Колоноспецифическая таргетированная доставка очень привлекательна для лечения заболеваний толстой кишки, включая болезнь Крона, рак толстой кишки и язвенный колит. Однако колоноспецифическая доставка может сталкиваться с рядом трудностей, включая меньшее содержание воды и относительно меньшую площадь для перорального всасывания по сравнению с другими участками желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [17,18,19]. Кроме того, пероральные ДДЛ также сталкиваются с сильно кислой средой в желудке, которая может ускорить деградацию загруженных лекарств в ЖКТ, тем самым лишая способность осуществлять колононаправленную доставку [19]. По этой причине было разработано несколько pH-зависимых ДДЛ для реализации pH-триггерного высвобождения лекарства при почти нейтральных значениях pH (6–7) ЖКТ, устойчивых к высококислотным условиям в желудочной области [20,21,22,23]. Существует лишь незначительная разница в кислотности между тонкой кишкой (pH 6,8) и толстой кишкой (pH 7,4); следовательно, такие pH-реагирующие ДДЛ испытывают трудности с реализацией колоноспецифического высвобождения.

Хитозан (CS), катионный и биодеградируемый природный полисахарид, состоит из β-(1-4)-связанных единиц глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина [24]. CS привлекл большое внимание в биомедицине благодаря своим уникальным свойствам, включая биодеградируемость, биосовместимость, мукоадгезивность и антибактериальную активность [25,26,27,28,29]. По сравнению с полимерами, полиэлектролитами и супермолекулами, синтезируемыми сложными процессами, CS относительно дешев и легко доступен путем исчерпывающей деацетилирования хитина [30,31,32]. Кроме того, сообщалось, что CS может открывать плотные контакты между клетками, тем самым увеличивая всасывание лекарств [33]. Поэтому полимер CS был выбран в качестве «затвора» благодаря своей хорошей биосовместимости и подходящему размеру для покрытия мезопор HMSS и блокирования высвобождения лекарства.

В нашей работе впервые была разработана колоноспецифическая ферментозависимая ДДЛ на основе материала HMSS (HMSS–N=N–CS), как показано на Схеме 1. В этой системе переносчики HMSS были получены методом селективного травления. Полимер CS был прикреплен к поверхности HMSS азо-соединениями для действия в качестве «затвора», блокирующего отверстия HMSS. Азо-соединения между HMSS и CS могут расщепляться ферментами в колонических областях [34, 35], что приводит к отделению CS от отверстий HMSS. DOX использовался как модельное лекарство для загрузки в полость HMSS, а эксперименты по ин витро высвобождению проводились для оценки ферментозависимого высвобождения в присутствии колонических ферментов. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) и потоковая цитометрия (FCM) использовались для изучения клеточного поглощения клетками Caco-2. Наконец, измерялась цитотоксичность HMSS–N=N–CS/DOX по отношению к клеткам Caco-2.

Материалы и методы

Материалы

Тетраэтоксисилан (TEOS); N-(3-диметиламинпропил)-N-этилкарбодиимид гидрохлорид (EDC); хитозан (DAC ≥ 95%); цетилтриметиламмоний бромид (CTAB); 3-аминпропилтриитоксисилан (APTES); 3-(4,5-диметилтиазол-2-il)-2,5-дифенилтетразолий бромид (MTT); азобензен-3,3'-дикарбоновая кислота; бромид калия (спектральной чистоты, ≥ 99,5%); N-гидроксискцинимид (NHS) и DOX были приобретены в Aladdin Chemical Inc. (Шанхай, Китай). Азобензен-3,3'-дикарбоновая кислота поставлена Inno-chem Technology Co. Ltd. (Пекин, Китай). Культурные среды DMEM, пенициллин-стрептомицин и фетальная теленья сыворотка (FBS) поставлялись GIBCO, Invitrogen Co. (Карлсбад, США). Все аналитические реагенты не подвергались дополнительной очистке перед использованием.

Подготовка HMSS–N=N–CS

Подготовка HMSS–NH₂

Нанчастицы HMSS были получены на основе опубликованной работы с использованием метода селективного травления [36]. Твердые кремнеземные сферы сначала синтезировались модифицированным методом Стёбера. Кратко: 6 мл TEOS добавляли в смесь из 10 мл деионизированной воды, 74 мл этанола и 3 мл концентрированного NH₃·H₂O. Затем смесь перемешивали 60 мин для получения коллоидного раствора кремнезема при комнатной температуре. Твердые сферы центрифугировали, вымывали и сушили для дальнейшего использования. Затем мезопористая кремнеземная оболочка наносилась на твердые кремнеземные сферы. 300 мг твердого кремнезема диспергировали в 50 мл деионизированной воды ультразвуком в течение 45 мин. Раствор кремнезема вливали в смесь из 60 мл этанола, 450 мг CTAB, 90 мл воды и 1,7 мл NH₃·H₂O. После перемешивания в течение 60 мин добавляли TEOS (0,75 мл). Затем нанчастицы центрифугировали после перемешивания в течение 6 ч для сбора образцов и повторно диспергировали в 40 мл воды. Примерно 1,2 г Na₂CO₃ добавляли в водную суспенсию с интенсивным перемешиванием. После поддержания смеси при 55 °C в течение 12 ч продукты нанчастиц HMSS собирали и вымывали безводным этанолом. Метод пост-графтирования с соотношением HMSS и APTES 4:1 (м/об) использовали для подготовки HMSS–NH₂ при 80 °C в условиях N₂ в течение 8 ч, CTAB удаляли рефлюксом [3].

Подготовка HMSS–N=N–COOH

Азобензен-3,3'-дикарбоновая кислота (50 мг) добавляли в ФСБ pH 5,8. Затем (5 мг/мл) EDC и (3 мг/мл) NHS добавляли для активации азобензена-3,3'-дикарбоновой кислоты при 30 °C в течение 1 ч. И 10 мл ФСБ, содержащего 15 мг/мл HMSS–NH₂, добавляли, и смесь перемешивали 24 ч. Полученный HMSS–N=N–COOH отделяли центрифугированием и вымывали этанолом.

Подготовка HMSS–N=N–CS

0,15 г CS и 0,5 мл уксусной кислоты добавляли в 50 мл воды для получения раствора CS. 100 мг HMSS–N=N–COOH диспергировали в 25 мл ФСБ pH 5,0 и активировали EDC и NHS в течение 0,5 ч. Затем раствор CS (10 мл) вливали в суспенсию с непрерывным перемешиванием в течение 1 суток. Наконец, синтезированный HMSS–N=N–CS центрифугировали и вымывали для сбора образцов.

Извлечение ферментной смеси колоновой микрофлоры

Колоновая микрофлора собиралась согласно опубликованной работе [37]. Затем культуру инокулировали для получения ферментной смеси, секретируемой колоновой микрофлорой, при 37 °C. Моделируемая колоновая среда, содержащая ферментную смесь, фильтровали через фильтр 0,22 мкм для удаления всего клеточного мусора из культурной жидкости. Затем фильтрат лиофилизировали для получения ферментной смеси в порошковой форме, которая использовалась в дальнейшем исследовании.

Процесс загрузки лекарства и ферментозависимое высвобождение

25 мг DOX растворяли в 5 мл раствора HCl pH 3,5. 100 мг HMSS–N=N–CS добавляли в раствор DOX и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. Затем 0,2 М раствор NaOH использовали для корректировки pH смеси до 7,0, и суспенсию перемешивали еще 12 ч. Затем загруженный DOX HMSS–N=N–CS (далее HMSS–N=N–CS/DOX) центрифугировали и вымывали для удаления адсорбированного DOX на поверхности HMSS–N=N–CS. Сверхнатый собирали на каждом этапе для измерения эффективности загрузки (LE) DOX при 480 нм УФ-Вис спектрофотометрией. Общая масса DOX, загруженного в HMSS–N=N–CS, рассчитывалась вычитанием незагруженного DOX после процесса загрузки из начальной массы добавленного DOX. HMSS/DOX готовили в качестве контроля, используя HMSS как исходный переносчик. LE DOX рассчитывали по уравнению:

$$ \mathrm{LE}\ \left(\%\right)=\frac{m_A-{m}_B}{m_A-{m}_B+{m}_C} \times 100 $$

Где m_A — добавленная масса DOX, m_B — масса DOX в сверхнатом, а m_C — общая масса HMSS–N=N–CS.

Ин витро ферментозависимое высвобождение DOX из HMSS–N=N–CS/DOX оценивали следующим образом. 2 мг HMSS–N=N–CS/DOX и HMSS/DOX нанчастиц диспергировали в ФСБ pH 7,4 на шейкере при 125 об/мин с разными концентрациями колоновой ферментной смеси (0 мг/мл, 0,3 мг/мл и 1 мг/мл). В заданные интервалы времени забирали 1 мл среды высвобождения для измерения абсорбции. Высвобождение DOX измеряли при 480 нм. HMSS/DOX использовали в качестве контроля.

Адсорбция БСА

Количество адсорбированного БСА оценивали на основе опубликованных работ [38, 39]. БСА добавляли в ФСБ pH 7,4 (0,5 мг/мл). 5 мг HMSS, HMSS–NH₂ и HMSS–N=N–CS добавляли в 2,5 мл ФСБ (pH 7,4). Добавляли равный объем раствора БСА, и суспенсию помещали в шейкер при 100 об/мин. Через 6 ч центрифугированием собирали верхний раствор. В конце концентрацию БСА измеряли при 595 нм после окрашивания раствором Кумасси блестящий синий.

Характеризация

Мезопористая сетевая структура и морфология нанчастиц HMSS оценивали TEM-изображениями (EM–208S, CSIS, США). Удельная площадь и распределение размера пор нанчастиц характеризовали азотным адсорбционным анализатором (V-Sorb 2800P, Gold APP Instrument Corporation, Китай). ξ- потенциалы и размеры частиц измеряли на наноразмерном анализаторе Nano-z90 (Malvern Instruments Ltd., Вустершир, Великобритания). ТГ-анализ проводили на оборудовании TGA-50 (Shimadzu, Киото, Япония) с скоростью нагрева 10 °C/мин под потоком азота. Фурье-спектры ИК-спектрофотометрии (FT-IR) измеряли на ИК-спектрометре (Bruker Tensor27, Швейцария). Диапазон проводили от 400 до 4000 см⁻¹ методом таблеток из KBr. Рентгеновская порошковая дифракция (XRD) выполняли на дифрактометре Siemens D5005 (Карлсруэ, Германия) с Cu-Kα излучением (λ = 1,5418 Å).

Клеточная культура и эксперимент по клеточному поглощению

Клетки Caco-2 культивировали в среде с добавлением 10% FBS, 1% неосновных аминокислот, 1% (об/об) пирувата натрия и 1% стрептомицина. Клетки NIH-3T3 культивировали в DMEM с 1% стрептомицина и 10% FBS. Клеточное поглощение нанопереносчиков клетками Caco-2 характеризовали с помощью FCM и CLSM. Клетки Caco-2 посевали в 24-колбовые пластины. После культивирования на ночь свободный DOX, HMSS–N=N–CS/DOX и HMSS–N=N–CS/DOX, предварительно инкубированный с нанчастицами колонового фермента (равномерно концентрации 5 мкг/мл DOX), добавляли в соответствующие колбы. После продолжения инкубации в течение 2 ч среду удаляли и тщательно промывали ФСБ. Затем клетки фиксировали 4% формальдегидом и окрашивали Hoechst 33258 для наблюдения в CLSM. FCM использовали для количественной оценки клеточного поглощения. Клетки Caco-2 посевали в 6-колбовые пластины и дальше инкубировали 24 ч. После промывки ФСБ клетки Caco-2 инкубировали со свободным DOX, HMSS–N=N–CS/DOX и HMSS–N=N–CS/DOX, предварительно инкубированным с нанчастицами колонового фермента (равномерно концентрации 5 мкг/мл DOX) в сывороточнобезой DMEM в течение 2 ч. Затем клетки Caco-2 промывали холодным ФСБ, трипсинизировали и ресуспендировали в 0,5 мл ФСБ. Флуоресценция DOX в клетках измеряли с помощью потокового цитометра FACS Canto (Becton, Dickinson, США).

Ин витро анализ клеточной пролиферации

Цитотоксичность пустых переносчиков HMSS и HMSS–N=N–CS по отношению к клеткам NIH-3T3 и Caco-2 проверяли MTT-тестом [40, 41]. Кратко: клетки Caco-2 и NIH-3T3 отдельно посевали в 96-колбовые пластины и инкубировали на ночь. Старая клеточная среда заменяли на сывороточную среду, содержащую разные концентрации нанчастиц. После инкубации в течение 2 суток добавляли 50 мкл раствора MTT (2 мг мл^–1) и инкубировали 4 ч для измерения живых клеток. Затем раствор MTT удаляли, и добавляли 150 мкл DMSO для растворения формазана. Затем абсорбцию измеряли на фототометре для микроплит (Tecan, Мяннедорф, Швейцария) при 570 нм. Цитотоксичность свободного DOX, HMSS–N=N–CS/DOX и HMSS–N=N–CS/DOX, предварительно инкубированного с ферментными смесями, извлеченными из колоновой микрофлоры, измеряли с использованием клеток Caco-2 при соответствующих концентрациях DOX (0,1; 1; 5; 10 и 20 мкг/мл). Время инкубации составляло 48 ч, остальные этапы эксперимента были теми же, что описаны выше.

Токсикологические исследования

Тесты на раздражение слизистой ЖКТ жизненно важны для оценки в vivo биобезопасности пероральной доставки лекарств. Самцы крыс Sprague-Dawley (180 ± 10 г) случайным образом разделяли на три группы (по три крысы в каждой). Крысам вводили физраствор, HMSS и нанчастицы HMSS–N=N–CS дозой 100 мг/кг в сутки. Через 7 дней всех крыс убивали, ткани собирали и исследовали гистопатологическим методом (H&E). Для оценки биобезопасности нанчастиц HMSS и HMSS–N=N–CS массу тела мышей BALB/c (18–20 г) фиксировали после перорального введения дозой 100 мг/кг через день. Все экспериментальные процедуры выполнялись в соответствии с руководством по уходу и использованию лабораторных животных Цыцихарского медицинского университета и были одобрены Этический комитетом Цыцихарского медицинского университета.

Статистика

Статистические данные анализировали с помощью программного обеспечения SPSS с использованием двустороннего t-критерия Стьюдента. Погрешности, представленные в этом исследовании, — это SD. p < 0,05 считается статистически значимым.

Результаты и обсуждение

Подготовка и характеризация HMSS–N=N–CS

HMSS получали на основе предыдущих работ с незначительными изменениями [36]. Сначала готовили твердые наносферы SiO₂, а затем наносили мезопористую оболочку на поверхность твердых кремнеземных наносфер с матрицей CTAB. Затем Na₂CO₃ использовали для селективного травления твердых наносфер SiO₂, в то время как мезопористая оболочка защищалась матрицей CTAB. Подготовка HMSS–N=N–CS с CS, прикрепленным в качестве «затвора» азо-связью, описана на Рисунке 1а. Сначала поверхность нанчастиц HMSS модифицировали APTES в качестве алкильного связующего реагента для получения аминофункционализированных HMSS (HMSS–NH₂) методом пост-модификации. Затем HMSS–N=N–COOH получали амидационной реакцией между аминогруппами HMSS–NH₂ и карбоксиловыми группами азобензена-3,3'-дикарбоновой кислоты. Затем CS ковалентно модифицировали на поверхности нанчастиц HMSS амидационной реакцией между карбоксиловыми группами HMSS–N=N–COOH и аминогруппами в CS.

Как показано на изображении передаточной электронной микроскопии (TEM) на Рис. 1а, средний диаметр HMSS составлял 280 нм, и HMSS имели однородную полую структуру и высокоупорядоченную мезопористую оболочку. Средняя толщина мезопористой оболочки составляла примерно 90 нм. По сравнению с гладкой поверхностью HMSS, поверхность графтированного полимера HMSS–N=N–CS (Рис. 1б) была шершавой, что указывает на то, что CS покрыл переносчик HMSS.

Удельные площади и поровые распределения мезопористых материалов играли ключевую роль в загрузке и доставке гостевых молекул для контролируемого высвобождения. Кривые распределения размера пор и изотермы измеряли азотным адсорбционно-десорбционным анализом (Рис. 2). Подробные параметры (удельная площадь BET (S_BET), общий поровый объем (V_P) и распределение размера пор (D_P)) представлены в Таблице 1. S_BET и V_P чистого HMSS составляли 810,7 м²/г и 0,969 см³/г соответственно, а D_P был примерно 3,8 нм. D_P HMSS–NH₂ был почти таким же, как у HMSS после аминирования, что указывает на то, что мезопоры не были заблокированы после аминофункционализации. S_BET и V_P HMSS–N=N–CS заметно снизились после модификации азосоединением и покрытия CS, что указывает на то, что CS покрыл поверхность HMSS [1].

Успешное графтирование HMSS–N=N–CS подтверждали различными методами. ξ-потенциал HMSS–NH₂ претерпел значительное изменение после функционализации, меняясь от −27,9 до +31,4 мВ, как показано на Рис. 3а, что приписывали добавлению аминогрупп на поверхность HMSS. После реакции HMSS–NH₂ с азобензеном-3,3'-дикарбоновой кислотой для образования HMSS–N=N–COOH ξ-потенциал дальше снизился до −2,0 мВ из-за карбоксиловых групп на поверхности HMSS. После дальнейшего графтирования полимера CS на поверхности HMSS для образования HMSS–N=N–CS ξ-потенциал вернулся к +32,4 мВ. Результат приписывали аминообогащенному положительно заряженному покрытию CS на поверхности HMSS [1]. Кривые термогравиметрического анализа (ТГА) HMSS, HMSS–NH₂, HMSS–N=N–COOH и HMSS–N=N–CS показаны на Рис. 3б. По сравнению с HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS потерял дополнительный вес примерно 19%, что было связано с удалением цепей CS. Графтирование азо-соединений на поверхности HMSS также подтверждали изменением цвета при подготовке HMSS–N=N–COOH, как показано на вставке на Рис. 3б. Реагент HMSS–NH₂ белый, в то время как продукт HMSS–N=N–COOH был желтовато-коричневым после реакции азобензена-3,3'-дикарбоновой кислоты с аминогруппами HMSS. Гидродинамический диаметр (D_H) и индекс полидисперсности (PDI) HMSS, HMSS–NH₂ и HMSS–N=N–CS определяли в дистиллированной воде, как показано на Рис. 3в. HMSS имел диаметр 309 нм и PDI 0,190. После добавления аминогрупп на поверхности HMSS для образования HMSS–NH₂ D_H увеличился до 324 нм. Диаметр HMSS–N=N–CS составлял 342 нм, что было больше, чем у HMSS–NH₂, из-за графтированных цепей CS. PDI HMSS–N=N–CS (0,177) был меньше, чем у HMSS–NH₂, что указывает на то, что средние размеры частиц стали более равномерными после графтирования CS. По сравнению с диаметрами, полученными TEM, диаметры HMSS и HMSS–N=N–CS, измеренные ДЛС, были больше. D_H нанчастиц измеряли в водной среде с гидратационным слоем, в то время как размер нанчастиц, полученный TEM, относился к сухим нанчастицам [3]. FT-IR спектры HMSS–NH₂, HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS и CS показаны на Рис. 4г. По сравнению с пиками для HMSN–NH₂, увеличение пиков адсорбции при 2853 и 2925 см⁻¹ приписывали колебаниям −CH₂ при графтировании карбоксильно-терминальных азо-соединений. После добавления CS на поверхность HMSS–N=N–COOH наблюдались увеличения пиков адсорбции при 1660 см⁻¹ и 3435 см⁻¹, что приписывали υ_(C=O) в амидной полосе и колебаниям N–H в CS. Все результаты доказали успешную подготовку HMSS–N=N–CS.

Состояние лекарства и эффективность загрузки

DOX выбирали для изучения поведения загрузки и высвобождения HMSS–N=N–CS. Когда pH суспензии нанчастиц HMSS–N=N–CS корректировали до pH 3,5, биополимер CS становился положительно заряженным (pK_a CS составлял 6,3) из-за протонированных аминогрупп в кислой среде [24]. Полимер CS становился положительно заряженным и набухал, что приводило к раскрытию мезопор HMSS из-за отталкивающего взаимодействия между зарядами CS. Таким образом, DOX получал доступ к мезопорам HMSS–N=N–CS диффузией. Однако после корректировки pH загруженной смеси до 7,4 цепи CS депротонировались и коллабировали, препятствуя преждевременному высвобождению DOX.

LE HMSS–N=N–CS/DOX составлял 35,2%, что было намного больше, чем у других DOX-загруженных мезопористых кремнеземных систем доставки [3, 16]. Высокая LE DOX в нанопереносчиках HMSS приписывалась полой полости, большой удельной площади и мезопористой сети, которые могли использоваться как резервуар лекарства. Физическое состояние DOX в HMSS–N=N–CS/DOX оценивали рентгеновской порошковой дифракцией (XRD). Как показано на XRD профилях (Рис. 4), исходный DOX демонстрировал характерные и интенсивные кристаллические дифракционные пики. Физическая смесь (PM) HMSS–N=N–CS и DOX также показывала явные кристаллические дифракционные пики. Однако HMSS–N=N–CS/DOX не демонстрировал выраженных кристаллических пиков, что доказывало, что физическое состояние DOX в HMSS–N=N–CS/DOX было некристаллическим из-за ограничений мезопористой структуры HMSS.

Ин витро ферментозависимое высвобождение в имитированной колоновой среде

Для изучения ферментозависимого высвобождения HMSS–N=N–CS, нанчастицы HMSS–N=N–CS/DOX и HMSS/DOX добавляли в ФСБ pH 7,4 с разными концентрациями колоновой ферментной смеси. Как показано на Рис. 5а, HMSS–N=N–CS/DOX демонстрировал медленное высвобождение DOX в ФСБ pH 7,4, и кумулятивный процент высвобождения составлял только около 10% в течение 24 ч, что указывает на хорошую способность «затвора» полимеров CS и азо-соединений. Как и ожидалось, в случае разбавленного фермента в ФСБ pH 7,4 кумулятивное высвобождение DOX увеличивалось до более чем 20% за тот же период. Кроме того, количество высвобожденного DOX резко возрастало до почти 40% в присутствии концентрированного фермента. По сравнению с ферментозависимым высвобождением из HMSS–N=N–CS/DOX, высвобождение DOX из HMSS/DOX имело похожие тенденции в присутствии или отсутствии концентрированного фермента. Относительно низкий процент высвобождения лекарства был связан с электростатическим взаимодействием между отрицательно заряженным HMSS и положительно заряженным DOX [42]. Вышеприведенные результаты доказали, что высвобождение DOX из HMSS–N=N–CS/DOX заметно ускоряется ферментами, извлеченными из микрофлоры в колонических областях. Механизм ферментозависимого высвобождения может заключаться в том, что азо-соединения в HMSS–N=N–CS деградируют ферментом, вызывая отщепление CS от поверхности HMSS и быстрое высвобождение из HMSS. Известно, что азо-соединения расщепляются ферментами, секретируемыми колоновой микрофлорой [34, 35].

Кроме того, для дальнейшей оценки ферментозависимого высвобождения из HMSS–N=N–CS/DOX в имитированной среде ЖКТ, наноплатформы HMSS–N=N–CS/DOX сначала диспергировали в СЖС в течение 2 ч, затем дальше диспергировали в СКС в течение 6 ч, и наконец переносчики добавляли в ФСБ pH 7,4, содержащий 1 мг/мл извлеченного фермента. Как показано на Рис. 5б, в имитированном желудочном соке высвобождение DOX было относительно быстрым, и кумулятивное количество достигало 15% в течение 2 ч. Относительно быстрое высвобождение было связано с более слабым взаимодействием между HMSS–N=N–CS и DOX в кислых условиях, чем в нейтральных [1]. Затем высвобождение DOX замедлялось в СКС в течение 2–8 ч. Однако после инкубации HMSS–N=N–CS/DOX с извлеченными ферментами в ФСБ pH 7,4 высвобождение DOX продолжало увеличиваться заметно, и кумулятивное количество высвобождения достигало более 50% в течение 24 ч. Неполное высвобождение DOX из HMSS–N=N–CS/DOX было связано с сильным взаимодействием между положительно заряженным DOX и отрицательно заряженным HMSS.

Адсорбция белка и стабильность HMSS–N=N–CS

Для перорального введения поверхностные свойства нанопереносчиков неизбежно влияют на поведение высвобождения лекарства и биoadсорбцию [43]. Анализ адсорбции белка на поверхности использовали для оценки влияния графтированного CS на поверхности HMSS. Как показано на Рис. 6а, голые нанопереносчики HMSS имели драматичную адсорбцию БСА до 16,5%, что приписывали большой удельной площади и полой полости HMSS, сильной адсорбционной способности и неспецифическим взаимодействиям силиanolовых групп HMSS и БСА [38, 39]. Кроме того, HMSS–NH₂ также имел относительно высокую адсорбированную величину БСА 10,2%. Тем не менее, процент адсорбированного БСА на поверхности заметно снизился до 2,5% после добавления полимера CS в качестве покрытия, что драматически снижало влияние на в vivo поведение HMSS–N=N–CS. Для дальнейшего наблюдения стабильности образцов HMSS–N=N–CS и HMSS, 20 мг HMSS–N=N–CS и HMSS добавляли в ФСБ pH 7,4 и деионизированную воду. Как показано на Рис. 6б, хотя HMSS–N=N–CS и HMSS были относительно стабильны в воде, HMSS быстро флокулировал в ФСБ pH 7,4. Напротив, дисперсность HMSS–N=N–CS была очевидно улучшена после графтирования полимера CS на поверхности HMSS. Кроме того, переносчики HMSS–N=N–CS могли оставаться стабильными более 12 ч без осаждения в ФСБ pH 7,4. Эти результаты доказали, что покрытие гидрофильным полимером CS могло улучшить дисперсность и снизить адсорбцию белка на поверхности HMSS–N=N–CS.

Клеточное поглощение

Клетки Caco-2, как клетки человеческого эпителиального аденокарциномы толстой кишки, широко используются как модельные клетки в пероральной доставке лекарств. Как показано на Рис. 7а, клетки Caco-2, инкубированные со свободным DOX, показывали относительно сильный флуоресцентный сигнал от DOX, поскольку положительно заряженный DOX мог проникать в клетку, а затем в ядро. По сравнению с группой свободного DOX, группа HMSS–N=N–CS/DOX демонстрировала более слабую интенсивность флуоресцентного сигнала из-за неполного высвобождения лекарства из HMSS–N=N–CS/DOX. Однако после предварительной инкубации HMSS–N=N–CS/DOX с колоновой ферментной смесью в течение 1 ч наблюдался заметно усиленный флуоресцентный сигнал. Это было связано с расщеплением азо-соединений ферментной смесью, что приводило к удалению CS с поверхности HMSS, тем самым значительно ускоряя высвобождение DOX из HMSS–N=N–CS/DOX. Для количественной оценки различий в клеточном поглощении HMSS–N=N–CS/DOX и HMSS–N=N–CS/DOX, инкубированного с извлеченными ферментами, использовали FCM. Как показано на Рис. 7б, средняя флуоресцентная интенсивность (MFI) для группы HMSS–N=N–CS/DOX составляла 124,7, что было слабее, чем у группы свободного DOX, со значением p менее 0,001. Восхитительно, после предварительной инкубации HMSS–N=N–CS/DOX с колоновой ферментной смесью в течение 1 ч MFI заметно увеличился до 357 и даже превысил группу свободного DOX благодаря ускоренному высвобождению лекарства из HMSS–N=N–CS/DOX после разрыва азо-соединений. Все эти результаты указали, что азо-соединения в HMSS–N=N–CS/DOX могли расщепляться в присутствии колонических ферментов, что приводило к сбрасыванию CS с поверхности HMSS и ускорению высвобождения DOX из HMSS.

Ин витро оценка жизнеспособности клеток

Для доказательства ферментозависимого эффекта высвобождения HMSS–N=N–CS/DOX в имитированных колонических условиях проводили ин витро анализ жизнеспособности клеток с использованием клеток Caco-2. Классическое антираковое лекарство DOX использовали в анализе жизнеспособности клеток. Перед этим анализом разные концентрации пустых HMSS и HMSS–N=N–CS использовали для определения биосовместимости наноплатформы по отношению к клеткам Caco-2 и нормальным клеткам NIH-3T3 (фибробласты эмбриона мыши) при различных концентрациях от 10 до 250 мкг/мл MTT-тестом [44, 45]. Как показано на Рис. 8а, б, HMSS и HMSS–N=N–CS при разных концентрациях демонстрировали пренебрежимую цитотоксичность после инкубации с клетками Caco-2 или NIH-3T3, и жизнеспособность клеток Caco-2 составляла 87,9% и 88,3% при высокой концентрации 100 мкг/мл соответственно, что достаточно высоко для клинических применений благодаря высокой загрузке лекарства HMSS. Кроме того, клетки NIH-3T3, инкубированные с HMSS и HMSS–N=N–CS в течение 48 ч, имели высокую жизнеспособность (выше 80%) при относительно высокой концентрации 100 мкг/мл. Эти результаты указали, что HMSS и HMSS–N=N–CS цитокомпатибельны и могут использоваться для пероральной доставки.

Влияние нанопереносчика, загруженного DOX, HMSS–N=N–CS/DOX на жизнеспособность клеток Caco-2 показано на Рис. 8в. Свободный DOX проявил сильную и концентрационно-зависимую цитотоксичность по отношению к клеткам 4T1, что приписывали тому, что положительно заряженный свободный DOX легко проникал через мембраны клеток 4T1. Значение IC₅₀ для группы свободного DOX определяли как 10,18 мкг/мл с использованием программного обеспечения SPSS Statistics. По сравнению с свободным DOX, HMSS–N=N–CS/DOX демонстрировал более высокую жизнеспособность клеток при той же концентрации DOX из-за неполного высвобождения DOX из HMSS–N=N–CS, вызванного сильными электростатическими взаимодействиями между отрицательно заряженными переносчиками HMSS и положительно заряженным DOX. Значение IC₅₀ для группы HMSS–N=N–CS/DOX составляло 32,22 мкг/мл, что было намного выше, чем для свободного DOX. Однако HMSS–N=N–CS/DOX, предварительно инкубированный с концентрированными колоническими ферментами, проявил очевидную концентрационно-зависимую цитотоксичность, и значение IC₅₀ рассчитывали как 9,41 мкг/мл, что было намного ниже, чем у HMSS–N=N–CS/DOX. Причина могла заключаться в том, что колонические ферменты деградировали азо-соединения в HMSS–N=N–CS, что приводило к отщеплению графтированного CS от поверхности HMSS, вызывая быстрое высвобождение DOX из переносчиков HMSS.

Токсикологические исследования

Опасность использования HMSS–N=N–CS является важным фактором, который необходимо учитывать перед будущими клиническими применениями. H&E окрашивание раздражения слизистой ЖКТ необходимо для оценки в vivo биобезопасности системы доставки для перорального введения (Рис. 9а). По сравнению с группой физраствора, обе группы HMSS и HMSS–N=N–CS не демонстрировали выраженных гистопатологических изменений или гиперемии после перорального введения в течение недели с дозой 100 мг/кг. Смерти или необычного поведения крыс не наблюдалось в ходе эксперимента. Снижение массы тела широко считается важным и простым индексом в vivo системной токсичности [46]. Как показано на Рис. 9б, масса тела мышей в группах HMSS и HMSS–N=N–CS незначительно увеличивалась и была похожа на группу физраствора. Вышеприведенные результаты указали, что HMSS и HMSS–N=N–CS демонстрировали хорошую биосовместимость в качестве переносчиков лекарств для перорального введения.

Заключение

Подводя итог, биодеградируемый CS был прикреплен через азо-соединения для затвора отверстий HMSS с целью достижения ферментозависимой колоноспецифической доставки лекарств. DOX загружали в полую полость и мезопоры HMSS в некристаллическом состоянии с высокой эффективностью загрузки 35,2%. Результаты стабильности и адсорбции БСА проиллюстрировали, что «затворы» CS могли повысить биосовместимость и стабильность HMSS. Результаты ин витро высвобождения доказали, что HMSS–N=N–CS/DOX демонстрировал ферментозависимое поведение высвобождения лекарства в присутствии колонических ферментов. Результаты CLSM поглощения и FCM указали, что клеточное поглощение DOX было очевидно увеличено после инкубации HMSS–N=N–CS/DOX с колоновой ферментной смесью. Результаты жизнеспособности клеток указали, что HMSS–N=N–CS/DOX, инкубированный с колоническими ферментами, проявлял повышенную цитотоксичность, и значение IC₅₀ заметно снижалось с 32,22 мкг/мл для HMSS–N=N–CS/DOX до 9,41 мкг/мл после инкубации.