Полостные кремнеземные наносферы с инкапсулированной пероксидазой редьки для внутриклеточного сенсирования ROS

Аннотация

Реактивные формы кислорода (ROS) ключевы в клеточной сигнализации, но их избыток вызывает окислительное повреждение. Точная, живая клеточная квантификация ROS поэтому необходима для базовой биологии и клинической диагностики. Традиционные флуоригенные зонды с пероксидазой редьки (HRP) страдают от плохой проницаемости мембран HRP. Здесь мы представляем пероксидазу редьки, инкапсулированную в полостные кремнеземные наносферы (HRP@HSNs), изготовленные через микроэмульсионно-шаблонированный соль-гель подход. Эти нанореакторы сохраняют надежную ферментативную активность, легко проникают через клеточные мембраны и демонстрируют отличную биосовместимость. Связывание HRP@HSNs с зондом дигидроrhodamine 123 (DHR123) позволило качественное и полуколичественное обнаружение внутриклеточного перекиси водорода (H₂O₂) в активированных макрофагах RAW 264.7. Платформа может быть легко функционализирована таргетирующими лигандами, предлагая органелло- или клеточно-специфические возможности ROS-визуализации.

Введение

ROS — включая супероксид, перекись водорода, гидроксильные радикалы, одиночный кислород и пероксинитрит — непрерывно генерируются при аэробном метаболизме, в основном из митохондриальной электрон-транспортной цепи. Антиоксидантная защита, как ферментативная (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидазы), так и неферментативная (витамины A, C, E, урат, билирубин), обычно нейтрализует эти виды. Дисбаланс ведет к окислительному стрессу, повреждая ДНК, липиды, белки и способствуя болезням: диабет, рак, сердечно-сосудистые и нейродегенеративные заболевания (Альцгеймер, Паркинсон) [1–5].

Недавние достижения в флуоресцентной микроскопии позволили неинвазивную, одноклеточную визуализацию ROS, в основном через ратиометрические или интенсивностные зонды, становящиеся флуоресцентными при окислении нефлуоресцентного предшественника [6–8]. Специфичность критична; борат-базированные зонды, например, таргетируют H₂O₂ через биоортогональное окисление [9]. Однако многие зонды нестабильны in vivo, слабо проникают в ткани и быстро выводится почками [12–14]. Стратегии вроде стабилизирующих линкеров, генетически кодируемых сенсоров, биолюминесцентных репортеров или PET-трейсеров исследовались [15–18]. Нано-формуляции дальше улучшают ROS-визуализацию, повышая специфичность и чувствительность [19–22].

Ферменты с высокой каталитической активностью — мощные биосенсоры, но их свободная форма нестабильна и не проникает через мембраны, ограничивая внутриклеточное использование. Электродные HRP-сенсоры не подходят для живой клеточной визуализации. Инкапсуляция HRP в наночастичатые оболочки может защитить фермент и облегчить внутриклеточную доставку, как показано с полостными кремнеземными наносферами (HSNs) [25–27]. Это исследование оценивает HRP@HSNs для внутриклеточного детектирования ROS, изучая загрузку, активность, клеточное поглощение, цитотоксичность и функциональную визуализацию в макрофагах.

Методы/Эксперимент

Химикаты и реактивы

Декан, n-гексанол (98%), аммиачный гидроксид (35% м/м), ТЕОС (98%), АПТМС (95%), ФИТЦ и другие реактивы из ACROS и Sigma-Aldrich. HRP (тип VI-A), DHR123, PMA и H₂O₂ (35%) куплены в Cayman и SHOWA Chemical Industry. Все реактивы использованы как получены.

Синтез полостных кремнеземных наносфер (HSNs)

HSNs готовились водно-в-масле микроэмульсией с селективным травлением, следуя протоколам нашей ранней работы [25, 29]. Кратко: 20 мл декана, 1,63 мл CA-520 и 550 мкл n-гексана мешали при 650 об/мин, затем добавляли 350 мкл воды для формирования микроэмульсии. АПТМС (25 мкл, 200 мкл в 1,4 мл этанола) и ТЕОС (100 мкл) вводились, за ними 250 мкл 35% аммиака при 20 °C. Через 10 ч 95% этанол дестабилизировал эмульсию; твердые кремнеземные наночастицы (SSNs) осаждали центрифугированием (11 000 об/мин, 20 мин). SSNs травляли в воде при 40 °C 40 мин для получения полостных оболочек, затем вымывали и хранили в 99,5% этаноле.

Синтез HRP-инкапсулированных полостных кремнеземных наносфер (HRP@HSNs)

Процедура зеркалит синтез HSNs, заменяя 350 мкл воды на 350 мкл водного HRP (10 мг/мл). HRP@HSNs хранились в деионизированной воде при 4 °C.

Синтез FITC-HSNs и HRP@FITC-HSNs

Для введения зеленой флуоресценции FITC-АПТМС (10 мг ФИТЦ, 200 мкл АПТМС в 1,4 мл этанола, 18 ч, в темноте) заменял этанольный АПТМС в синтезе, давая FITC-HSNs и HRP@FITC-HSNs.

Эффективность инкапсуляции HRP и грузоподъемность

HRP маркировали RITC для создания RITC-HRP, который инкапсулировали в RITC-HRP@HSNs. После растворения в 1 M NaOH флуоресценция измерялась (Hitachi F-4500, λ_ex = 543 нм, λ_em = 550–650 нм) и сравнивалась с калибровочной кривой. Эффективность инкапсуляции (%) = (масса RITC-HRP в наносферах / начальная RITC-HRP) × 100; грузоподъемность (мкг HRP мг⁻¹ HSNs) рассчитывалась соответственно.

Анализ активности HRP

Активность HRP количественно определялась хромогенным субстратом ТМБ. Ферментные растворы (родной HRP и HRP@HSN) смешивали с 20 мкМ ТМБ и 20 мкМ H₂O₂ в фосфат/цитрат буфере (pH 5,2). Абсорбция на 655 нм регистрировалась ридером BioTek Synergy; активность выводилась из калибровки родного HRP.

Реактивность с различными ROS

DHR123 (20 мкМ) с или без HRP@HSNs (50 мкг/мл) инкубировали с 100 мкМ ROS (H₂O₂, TBHP, супероксид, •OH, •OtBu) в DMEM (pH 7,4). Флуоресценция (λ_ex = 488 нм, λ_em = 530 нм) измерялась каждые 5 мин в течение 120 мин.

Клеточная культура и тест жизнеспособности

Макрофаги RAW264.7 культивировали в DMEM + 10% ФБС + антибиотики при 37 °C, 5% CO₂. Для жизнеспособности 2 × 10⁵ клеток/колодку посеяли в 24-колодчатых пластинках; через 24 ч клетки экспонировали 0–200 мкг/мл наночастиц в сывороточнобезном DMEM на 2 ч. Реагент WST-1 (Clontech) оценивал жизнеспособность (450 нм, референс 650 нм) ридером Bio-Rad 680.

Анализ клеточного поглощения

1 × 10⁶ RAW264.7 клеток/колодку инкубировали с 0–200 мкг/мл FITC-маркированных наночастиц 2 ч. После промывки и трипсинизации поглощение количественно определялось потоковой цитометрией; трипан-синий гасил внеклеточную флуоресценцию.

Потоковая цитометрия ROS-продукции в PMA-стимулированных макрофагах

После 2 ч экспозиции наночастицами и 30 мин загрузки DHR123 клетки стимулировали 1 мкг/мл PMA на 1 ч перед анализом на FACS Canto II.

Количественный анализ

96-колодчатые пластинки посеяли 3 × 10⁴ RAW264.7 клеток/колодку. После 2 ч лечения наночастицами и 1 ч инкубации с PMA (вариабельно) + DHR123 (20 мкМ) флуоресценция (λ_ex = 488 нм, λ_em = 530 нм) измерялась. Калибровальная кривая (H₂O₂ + HRP@HSN) позволяла конвертировать флуоресценцию в концентрацию H₂O₂.

Характеризация

ТЭМ (JEOL JEM-1200 EX II, 100 кВ) подтвердила 45 нм полостные ядра; уранил-ацетатное окрашивание верифицировало внутренний HRP. Динамическое рассеяние света (Malvern Zetasizer Nano ZS) оценивало гидродинамический размер и дзета-потенциал; клетки образывали на Zeiss Axio Observer Z1.

Результаты и обсуждение

Дизайн и синтез HSNs и HRP@HSNs

HRP@HSNs производились аммиачно-катализированной соль-гель химией в w/o микроэмульсии (Схема 1). ТЭМ (рис. 1) показывает монодисперсные 45 нм сферы; уранил-ацетатное окрашивание подтверждает инкапсуляцию HRP внутри полостной полости. DLS раскрывает гидродинамические диаметры 188 ± 4 нм (HSNs) и 184 ± 6 нм (HRP@HSNs) в воде, которые растут до 1,8–1,7 мкм в сывороточнобезном DMEM из-за агрегации. Бovine сывороточный альбумин (BSA) снижает эту агрегацию, давая стабильные 195–197 нм частицы.

Схема синтеза пероксидазы редьки, инкапсулированной в полостные кремнеземные наносферы (HRP@HSNs). АПТМС, 3-аминпропиルトриметоксисилан; ТЕОС, тетраэтил ортосиликат; SSN, твердая кремнеземная наночастица

ТЭМ изображения (a) HSNs, (b) уранил-ацетат-окрашенных HSNs, (c) HRP@HSNs, (d) уранил-ацетат-окрашенных HRP@HSNs. Вставка: увеличенный вид

Эффективность инкапсуляции HRP и грузоподъемность

RITC-HRP инкапсуляция дала ~6% эффективности при загрузке 11–33 нмоль; максимальная грузоподъемность достигла 12,5 ± 1,2 мкг HRP мг⁻¹ HSN при 33,3 нмоль вводе. Пока эффективность скромна, она демонстрирует, что HRP может удерживаться в нанокавитете, и загрузка настраивается концентрацией фермента.

Цитотоксичность и клеточное поглощение

WST-1 анализы показывают отсутствие значимого снижения пролиферации RAW264.7 после 2 ч или 26 ч экспозиции до 200 мкг/мл HSNs или HRP@HSNs, указывая на низкую цитотоксичность. FITC-маркированные частицы достигли >80% эффективности маркировки при >50 мкг/мл за 2 ч, подтверждая эффективную внутриклеточную доставку без ущерба жизнеспособности.

Реактивность HRP@HSNs к различным ROS

Анализ активности HRP показывает ~40% сохранения родной активности после инкапсуляции, вероятно из-за диффузионных ограничений через кремнеземную оболочку. В бесклеточных анализах DHR123 один не реагирует на H₂O₂ или супероксид, но сильно реагирует на •OH и •OtBu. HRP или HRP@HSNs заметно усиливают флуоресценцию для всех тестированных ROS, с более высоким сигналом от родного HRP, коррелирующим с его большей активностью. Относительные флуоресцентные соотношения на 60 мин показывают, что оба варианта HRP усиливают детектирование H₂O₂ и супероксида, подтверждая, что нанокавитет сохраняет каталитическую функцию, разрешая диффузию субстрата.

(a–c) Временнозависимая флуоресценция DHR123 один (a), с HRP (b), или с HRP@HSNs (c). (d) Усиленное интенсивностное соотношение на 1 ч для каждого ROS (20 мкМ DHR123, 400 нг/мл HRP, 50 мкг/мл HRP@HSNs, 100 мкМ ROS). *p < 0,05 против контроля.

Внутриклеточное детектирование ROS с HRP@HSNs

RAW264.7 клетки, предобработанные HRP@HSNs (2 ч) и загруженные DHR123 (30 мин), показали заметно более высокую флуоресценцию после PMA стимуляции по сравнению с контролями. Потоковая цитометрия показывает >2-кратный рост флуоресценции R123 в стимулированных клетках; HRP@HSNs доставляют дополнительную каталитическую активность, тогда как простые HSNs дают скромный флуоресцентный рост, вероятно отражая клеточные стресс-ответы. Интенсивность флуоресценции дозированно зависела от PMA (0,1–2 мкг/мл) и HRP@HSNs (50–200 мкг/мл). Репрезентативные конфокальные образы подтверждают усиленную внутриклеточную ROS-визуализацию (Рис. 3d).

(a) Потоковая цитометрия RAW264.7 клеток с/без PMA и наночастиц. (b) PMA-концентрационно-зависимая флуоресценция. (c) HRP@HSN-концентрационно-зависимая флуоресценция. (d) Флуоресцентные образы (масштаб 50 мкм).

Применение HRP@HSNs для количественного H₂O₂ анализа

Используя внешнюю калибровочную кривую H₂O₂ (0,625–15 мкМ), внутриклеточный H₂O₂, генерируемый PMA-стимулированными RAW264.7 клетками, был количественно определен. Клетки, обработанные 100 мкг/мл HRP@HSNs и 20 мкМ DHR123, затем экспонированные 0,1–2 мкг/мл PMA, дали энногенные H₂O₂ концентрации ~10 мкМ при ≥0,25 мкг/мл PMA. Это полуколичественное измерение демонстрирует полезность платформы для оценки окислительного стресса в живых клетках.

(a) WST-1 жизнеспособность RAW264.7 после H₂O₂ или PMA лечения (1 ч). (b) Энногенное H₂O₂ квантификация с HRP@HSNs и DHR123. Вставка: калибровальная кривая.

Заключение

Мы спроектировали полостные кремнеземные наносферы, инкапсулирующие активный HRP, создавая надежные внутриклеточные ROS-сенсоры. Пористая кремнеземная оболочка позволяет малым субстратам достигать инкапсулированного фермента, защищая HRP от протеолиза. В связке с DHR123, HRP@HSNs обеспечивают усиленное, полуколичественное обнаружение энногенного H₂O₂ в макрофагах под окислительным стрессом. Поверхностная функционализация антителами или пептидами позволит органелло- или опухолевоклеточно-специфический таргетинг, и альтернативные полезные нагрузки (нанокатализаторы или борат-зонды) могут расширить сенсорный репертуар. Эти нанореакторы представляют универсальную платформу для одновременной ROS-визуализации, квантификации и таргетированной терапевтической доставки в биомедицинских исследованиях и клинической диагностике.

Аббревиатуры

APTMS

3-Аминпропилтриметоксисилан

BSA

Бovine сывороточный альбумин

DHR123

Дигидроrhodamine 123

DLS

Динамическое рассеяние света

FITC

Флуоресцеин изотиоцианат

HRP

Пероксидаза редьки

HSNs

Полостные кремнеземные наносферы

Igepal CA-520

Полиоксиэтилен (5) изооктилфенил эфир

mETC

Митохондриальная электрон-транспортная цепь

PET

Позитронно-эмиссионная томография

PMA

Форбол 12-миристат 13-ацетат

R123

Rhodamine 123

RITC

Rhodamine B изотиоцианат

ROS

Реактивные формы кислорода

SSN

Твердая кремнеземная наночастица

TBHP

Терт-бутил гидропероксид

TEM

Трансляционная электронная микроскопия

TEOS

Тетраэтил ортосиликат

TMB

3,3′5,5′-Тетраметилбензидин