Углеродные точки: передовой обзор нанотермометров нового поколения

Аннотация

Высокочувствительное бесконтактное температурное чувствирование существенно для изучения фундаментальных химических реакций, биологических процессов и применения в медицинской диагностике. Наномасштабные термометры обеспечивают неинвазивные зонды для чувствительного и точного температурного чувствирования с субклеточным разрешением. Флуоресцентные температурные сенсоры проявили большую способность, так как они работают в «бесконтактном» режиме и предлагают двойные функции клеточной визуализации и чувствирования температуры на молекулярном уровне. Прогресс в наноматериалах и нанотехнологиях привел к разработке новых сенсоров, таких как нанотермометры (новые температурно-чувствительные материалы с высоким пространственным разрешением на наномасштабе). Такие нанотермометры разрабатывались на разных платформах: флуоресцентные белки, органические соединения, металлические нанопartikel, редкоземельно легированные нанопartikel, полупроводниковые квантовые точки. Углеродные точки (УТ) привлекли интерес во многих областях исследований благодаря выдающимся свойствам: сильная флуоресценция, устойчивость к фотоблекчингу, химическая стабильность, дешевые прекурсоры, низкая токсичность и биосовместимость. Недавние отчеты показали термочувствительное поведение некоторых УТ, делая их альтернативой другим наноматериалам для термометрии. Этот вид люминесцентных термометров перспективен для температурного чувствирования в нанокавитатах и термической картографии для лучшего понимания биологических процессов. Поскольку УТ все еще на ранней стадии как наномасштабные материалы для термического чувствирования, в этом обзоре мы даем всестороннее понимание этого нового нанотермометра, методов функционализации для повышения термической чувствительности и разрешения, и механизма термочувствительного поведения.

Введение

Температура — фундаментальная термодинамическая переменная, оказывающая замечательное влияние на биологические и химические системы. Ввиду широкого спектра приложений почти во всех областях естественных наук, инженерии, сельского хозяйства и медицинских наук, точное определение температуры имеет большое значение [1, 2]. В медицинских приложениях термометрия используется для раннего обнаружения различных заболеваний, таких как инсульт, рак или воспаления, одним из начальных симптомов которых является появление локализованных температурных аномалий.

Исторически ранняя оценка температуры, вероятно, строилась на ощущениях или наблюдении. В древние времена, 200–10 гг. до н.э., пневматические эксперименты (расширение воздуха теплом) приписываются как старейшие признанные ссылки на приборы, используемые для количественных измерений тепла. Среди самых примитивных работ, связанных с расширением нагретого воздуха, приписываются труды Филона Византийского и Гера (или Герона) Александрийского о пневматических экспериментах [3]. Позже, между 1592 и 1603 гг., Галилео Галилей изобрел термоскоп, проводя эксперименты с расширением воздуха теплом через создание простого прибора с трубкой, содержащей воздух над колонной воды. После Галилея итальянский Санторио впервые интегрировал этот простой прибор в медицинские обследования лихорадки. Первый полностью герметичный жидкостный стеклянный термометр, спирту-наполненная стеклянная трубка, был собран Фердинандом II в 1641 г. Он мог измерять температуру без помощи барического давления, в отличие от открытого термоскопа Галилея и Санторио. Практическая работа Фаренгейта в термометрии появилась в 1706 г.; он начал со спирта, но впоследствии стал легендарен своими ртутными термометрами. Признание цельсиевой температурной шкалы предоставлено Андерсу Цельсию, который в 1742 г. предложил шкалу с нулем при температуре кипения воды и 100 при температуре замерзания воды. Электронные эксперименты в XIX веке, когда Томас Йоганн Зебек рассмотрел концепцию термоэлектричества. В серии экспериментов между 1820 и 1823 гг. он подтвердил электрический потенциал в точках соединения двух разных металлов при температурной разнице между соединениями. Это позже стало известно как эффект Зебека и служит основой термопары, которая считается самым точным измерением температуры [3–7]. Схематическая временная шкала эволюции термометров показана на рис. 1.

Нанотермометрия

Под «нанотермометрией» понимается использование наномасштабных термочувствительных материалов для получения температурной информации о локальной среде нано- или микромасштабной области [21, 22]. Нанопартикулярные термические зонды имеют большую способность в широком спектре сенсорных приложений, и 수많은 прогрессивные так называемые «нанотермометры» были недавно сообщены. Более того, различные виды традиционных наноматериалов сообщили о термочувствительных люминесцентных свойствах, таких как полимеры [23, 24], нанокристаллы [25], редкоземельно легированные нанопartikel [26, 27] и металлические нанопartikel [28].

Таким образом, нанотермосенсоры — неинвазивные, бесконтактные, точные термометры, работающие на наномасштабе с высокой чувствительностью и разрешением [9]. Термическое чувствование с использованием наноматериалов может быть достигнуто путем манипулирования их оптическими свойствами. Флуоресцентная нанотермометрия может быть классифицирована на несколько классов в зависимости от точного параметра, из которого извлекается термическое измерение: интенсивность сигнала, форма полосы, время жизни флуоресценции, сдвиг полосы, поляризация длины волны возбуждения и спектральный сдвиг. В первом случае флуоресценция меняется при разных температурах и может быть детектирована как абсолютное увеличение (или уменьшение) сигнала [9, 29–31].

Бесконтактная люминесцентная нанотермометрия, использующая люминесцентные наноматериалы с температурно-зависимой эмиссией, преимущественно подходит для биологических приложений [32, 33]. Эти люминесцентные наноматериалы включают флуоресцентные полимеры [24], металлические нанопartikel [34], редкоземельно легированные нанопartikel [35] и нанодиаманты [36], которые имеют термочувствительные свойства в физиологическом диапазоне. Эти пионерские работы способны были обеспечить среднюю температуру для отдельных клеток. Температурно-зависимые люминесцентные зонды на основе органических красителей (например, رودамин 6G) и полимеров (например, поли(N-изопропилакриламид)) обычно демонстрируют плохую фотстабильность и выраженную перекрестную чувствительность к кислороду, что нежелательно для работы с живыми клетками [8]. Кроме того, существует сильная pH-зависимость времени жизни флюорофора, что затрудняет использование без точного контроля pH исследуемой среды [37].

Другой класс нанотермометров основан на чистых и легированных полупроводниковых нанокристаллах, с наиболее заметными кандидатами, такими как CdSe, ZnS, InP или PbSe [19, 38–40]. Полупроводниковые квантовые точки (SQD) являются кандидатами для наномасштабных термометров, учитывая их высокий квантовый выход, долгую жизнь до фотоблекчинга и адекватную биосовместимость после надлежащей поверхностной модификации. Кроме того, их можно легко конюгировать с белками и ДНК для сенсирования и визуализации [41]. Исключительный вызов, с которым сталкивается этот тип люминесцентных термометров, — связанное признание яркости, фотстабильности, чувствительности и точности при T = 20–40 °C при зондировании субклеточных микросред. SQD были обширно рассмотрены в терминах синтеза, физико-химических свойств, люминесценции и потенциальных применений. Здесь мы направляем внимание читателя на эти многочисленные замечательные обзоры [42–46]. По сравнению с органическими красителями, SQD демонстрируют превосходную яркость для детекции, более широкий профиль возбуждения для мультиплексирования и лучшую фотстабильность для долгосрочных исследований. Более того, SQD как температурные сенсоры устойчивы к pH и другим экологическим вариациям, которые ожидаются внутри клетки [47].

В общем, в SQD из-за комбинации разных процессов увеличение температуры производит уменьшение интенсивности флуоресценции (квенчирование), сопровождаемое спектральным сдвигом. Этот сдвиг можно считать линейным в биофизическом диапазоне. Величина обоих эффектов (квенчирование люминесценции и спектральный сдвиг) сильно зависит от материала, составляющего QD, и их размера [48].

Каждая группа люминесцентных наноматериалов имеет ограничения использования вместе с их преимуществами. Как описано выше, SQD предпочтительнее флуоресцентных полимеров и органических красителей. SQD хороши в терминах фотстабильности, квантовой эффективности и настраиваемой флуоресценции, но QD не могут использоваться для отслеживания одной молекулы для долгосрочного мониторинга из-за их внутреннего мигания [49]. Более того, главная ловушка QD — их токсичность из-за содержания тяжелых металлов, включая кадмий; это ограничивает их биологические и экологические применения. Кроме того, доступность прекурсорных элементов в природе относительно низка, поэтому SQD считаются дорогими [50].

Углеродные точки как нанотермометры

Для преодоления проблем, возникших от не-углеродных нанотермометров (как объяснено в предыдущем разделе), углеродные наноматериалы были приготовлены и продемонстрировали уникальные свойства: низкую токсичность, легкую подготовку, дешевые прекурсоры, фотстабильность и биосовместимость. Эти углеродные наноматериалы показали чувствительные термические сенсорные свойства. Кроме того, улучшение безметаллических нанопартикул важно и срочно из-за экологической опасности для биологических применений таких токсичных материалов [51, 52]. Среди семейства углеродных наноматериалов флуоресцентные нанодиаманты были впервые сообщены как нанотермометры [53]. Флуоресцентные нанодиаманты обладают внутренней биосовместимостью, вытекающей из их химически стойкой и инертной поверхности [54]. Другие нанодиаманты недавно использовались для внутриклеточного термического чувствования с субградусной точностью [55, 56]. Термическая чувствительность этих нанодиамантов основана на так называемых азото-вакансионных цветных центрах, которые являются точечными дефектами, состоящими из азота, заменяющего углерод в решетке, и соседней вакантной решетки [48, 57]. Азото-вакансионный центр флуоресцентных нанодиамантов изучен обширно и хорошо охарактеризован для своей фотфизики и использования в биологических приложениях [58]. Принцип функционирования азото-вакансионной термометрии зависит от точного измерения этого цветного центра, который может быть оптически детектирован с высоким пространственным разрешением [30, 59]. Однако низкая флуоресцентная эффективность и плохая управляемость сильно препятствуют применению флуоресцентных нанодиамантов [36].

Один из более новых классов семейства углеродных наноматериалов — высоколюминесцентные углеродные точки (УТ), обладающие исключительно яркой фотолюминесценцией, фотокимической стабильностью, водорастворимостью, отличной биосовместимостью и нетоксичностью [60–62]. УТ — нуль-мерные сферические нанопartikel с диаметром менее 10 нм [63, 64]. Различные подходы применялись для приготовления разнообразных типов УТ, например, лазерная абляция [65], солвотермальный [66], гидротермальный синтез [67], микроволновая помощ [68], дуговая разрядка [69], кислотное окисление [70] и другие химические и физические подходы [71, 72]. Кроме того, УТ демонстрируют желательную перспективу для различных приложений, таких как биологическая визуализация [73], химическое и биосенсирование [74–76], адресная доставка лекарств [78], фармацевтический анализ [79] и катализ [80, 81]. Углеродные точки были обширно рассмотрены в терминах синтеза, физико-химических свойств и потенциальных применений. Здесь мы направляем читателя к многочисленным хорошим обзорам на углеродные точки [72, 82–88].

В последние годы флуоресцентные УТ как температурные сенсоры привлекли много внимания исследователей. В принципе, для эффективного температурного измерения требуются некоторые требования, например, углеродные нанодочки должны демонстрировать заметное изменение своей фотолюминесценции в диапазоне соответствующих температур [89]. Фотстабильность, pH-стабильность и срок хранения — другие требования, которые должны учитываться для практического применения.

УТ — перспективные альтернативы традиционным полупроводниковым квантовым точкам (SQD). По сравнению с QD, УТ показывают многие выдающиеся преимущества: низкую стоимость, низкую токсичность и уникальные надежные оптические/химические свойства [90]. Кроме того, УТ демонстрируют очень малое фотоблекчинг. По сравнению с другими флуоресцентными сырьевыми материалами, УТ производятся из недорогих источников углерода, обильных в природе [91]. Кроме того, существует несколько простых методов модификации и функционализации поверхностного состояния УТ, позволяющих адаптировать растворимость, стабильность, физико-химические свойства и квантовые выходы УТ согласно экспериментальным требованиям [49, 92, 93].

В литературе мало сообщаемых статей об углеродных точках с температурно-зависимой флуоресценцией, показанных в Таблице 1.

Ю и соавт. [51] в 2012 г. впервые исследовали температурно-зависимую флуоресценцию в углеродных нанодочках и сравнили их с полупроводниковыми и металлическими нанопартикулами. Они опирались на измерение температурно-зависимых времен жизни фотолюминесценции через технику временно-коррелированного однофотонного счета (TCSPC). Динамика релаксации фотолюминесценции становится быстрее при более высоких температурах (рис. 2а), что можно приписать нерадиационным процессам распада. Измерение флуоресцентных спектров пленки УТ в функции температуры от криогенной до комнатной температуры выполнено (рис. 2b). С увеличением температуры интенсивность флуоресценции демонстрирует повторяющееся уменьшение.

PL-спектр демонстрирует асимметричные пики, поэтому PL-спектры при каждой температуре можно хорошо аппроксимировать функцией двух гауссиан (рис. 2c). Высокоэнергетическая полоса, полоса I; низкоэнергетическая полоса, полоса II (рис. 2d). Кроме того, энергетический разрыв (ширина полосы) флуоресценции инспектировали как функцию температуры (рис. 2d). Общая ширина полосы продиктована температурно-независимым (электрон-электронное рассеяние) и температурно-зависимым (электрон-фононное и поверхностное/дефектное рассеяние). Ширина полосы I и полосы II температурно-независима, что указывает на доминирование электрон-электронного рассеяния в УТ.

Следовательно, слабый температурный эффект в УТ согласуется с тем, что основной механизм взаимодействия включает электрон-электронные взаимодействия, а не электрон-фононную связь. Кроме того, широкая PL-полоса (>100 нм), обычно наблюдаемая даже при очень низкой температуре (77 К), относится к сильным электрон-электронным взаимодействиям (рис. 2c). Этот результат похож на металлические нанокластеры и отличается от полупроводниковых QD. Поэтому Ю и соавт. предположили, что π-электроны в УТ могут действовать аналогично свободным электронам в металлических нанокластерах.

Каличук и соавт. [89] синтезировали высоколюминесцентные водорастворимые N,S-УТ одноступенчатым гидротермальным лечением лимонной кислоты и L-цистеина. Они собрали стационарные поглощения в широком диапазоне температур для характеристики температурно-зависимых PL-свойств УТ. Поглощения N,S-УТ, диспергированных в воде при температурах между 10 и 70 °C (с шагом 5 °C), показаны на рис. 3а. В отличие от полупроводниковых нанокристаллов, положение и интенсивность полосы поглощения не менялись с температурой. Подобные результаты ранее сообщались для УТ, синтезированных гидротермальным лечением глюкозы в присутствии глутатиона [1].

В их работе они показали цветной график PL-спектров N,S-УТ, полученных при температурах от 2 до 80 °C с шагом 2 °C (рис. 3b). Увеличение температуры снизило интенсивность PL-эмиссии примерно в 2 раза без какого-либо детектируемого сдвига PL-эмиссий [89]. Положение максимума PL-эмиссии, PL полная ширина на полувысоте (fwhm) и интегрированная PL-интенсивность количественно определили при изучаемых температурах, сжав результаты на рис. 3c–e соответственно.

Положение PL-пика N,S-УТ показывает слабую температурную зависимость, в отличие от большинства полупроводниковых нанокристаллов, чей запрещенная зона меняется с температурой, индуцируя сдвиг PL-эмиссии. Более того, их PL fwhm демонстрирует лишь незначительное расширение (1,4 ± 1 нм) в том же температурном диапазоне (рис. 3d), указывая на то, что PL-пик N,S-УТ показывает пренебрежимое термическое расширение. Для характеристики нерадиационных процессов релаксации в УТ они проанализировали квенчирование интегрированной PL-интенсивности как функцию температуры. График температурно-зависимой интегрированной PL-интенсивности для N,S-УТ показан на рис. 3e, с значениями, нормализованными к интенсивности при 2 °C, показывая, что интенсивность монотонно уменьшается в изученном температурном диапазоне, при 80 °C составляя примерно половину от значения при 2 °C. Основываясь на этих результатах, активационная энергия термического квенчирования для УТ при температурах между 2 и 80 °C оценили в 17,0 ± 0,7 мэВ с использованием уравнения Аррениуса для N,S-УТ, что близко к значению, сообщенному Ю и соавт. [51].

Кроме того, Каличук и соавт. [89] исследовали динамику эмиссии УТ при разных температурах. Рис. 4a–c демонстрируют сильную температурную зависимость их времени-разрешенной PL-эмиссии, показывая данные спектроскопии времени-разрешенной эмиссии для трех разных температур. Трансientные карты PL-эмиссии УТ получены в спектральном диапазоне 375–650 нм при 2, 50 и 80 °C, как показано на рис. 4a–c. Есть явное снижение PL-затухания при повышении температуры, указывая, что УТ имеют удовлетворительные свойства для PL-времени жизни основанного температурного сенсирования. Важно отметить, что спектрально равномерное одноэкспоненциальное затухание наблюдалось по профилям эмиссии точек при всех изученных температурах, указывая на то, что рекомбинация происходит через очень похожие и высокоэмиссионные каналы по всему ансамблю УТ. PL-динамика УТ, вероятно, их наиболее многообещающее качество, относящееся к применениям температурного сенсирования. Конкретно, температурная чувствительность УТ делает их PL-времени жизни нанотермометрами.

Вариация PL-времени жизни УТ при температурах между 2 и 80 °C исследована тщательно; рис. 4d, e показывает данные времени-разрешенной PL, собранные на максимуме PL-эмиссии точек в функции температуры. Цветной график трансientной PL по изученному температурному диапазону представлен на рис. 4d, показывая, что повышение температуры приводит к монотонному сокращению видимого PL-затухания. Все записанные кривые затухания аппроксимировали одноэкспоненциальной функцией. Данные об извлеченных временах жизни представлены на рис. 4e. По мере увеличения температуры от 2 до 80 °C, PL-время жизни монотонно уменьшается с 11,0 до 5,3 нс. Температурный диапазон, в котором продемонстрирована эта PL-времени жизни чувствительность (2–80 °C), покрывает как физиологически релевантный температурный диапазон, так и типичные рабочие температуры многих электронных устройств. Абсолютная псевдо-линейная чувствительность этого PL-времени жизни CD-базированного термического зонда составляет 0,08 нс K⁻¹, а максимальная относительная чувствительность — 1,79% K⁻¹ при 62 °C. Одноэкспоненциальная аппроксимация PL-затухания CD-базированного люминесцентного нанозонда по изученному температурному диапазону дает единственный параметр, PL-время жизни (τ), который может быть напрямую конвертирован в температурные единицы с использованием калибровочной кривой. Это важное преимущество над типичными полупроводниковыми квантовыми точками, которые демонстрируют многоэкспоненциальное затухание, ограничивающее их полезность в применениях, включающих измерения PL-времени жизни.

Они также изучали температурную зависимость PL-времени жизни УТ в фосфатно-буферном растворе (PBS) и модифицированной среде Эйгла Дюльбекко (DMEM) и показали подобное поведение.

Для демонстрации повторного использования CD-базированных люминесцентных термометров, кривые PL-затухания выбранных образцов измеряли в течение семи последовательных циклов нагрева и охлаждения при температурах между 15 и 45 °C (рис. 5а).

В каждом цикле измерения PL-затухание измеряли после 5-минутного термического равновесия. Никакой термической гистерезиса не наблюдалось во время циклов нагрева и охлаждения, и полученная вариация PL-времени жизни построена как функция времени на (рис. 5b), демонстрируя, что PL-время жизни УТ демонстрирует отличную термическую стабильность.

Позже несколько УТ с температурно-зависимой эмиссией были приготовлены различными методами синтеза, такими как гидротермальное и солвотермальное лечение [2, 77, 92, 95, 97–103], тепловой рефлюкс [94, 96] и лазерная абляция [14], как показано в Таблице 1. Приготовленные УТ показывали линейную температурно-зависимую флуоресценцию в физиологических диапазонах (показано в Таблице 1). Интенсивность флуоресценции УТ уменьшалась с увеличением температуры. Кроме того, обратимость и восстанавливаемость интенсивности флуоресценции изучали во всех статьях. Рис. 6 показывает некоторые общие свойства УТ, изученные в различных статьях.

Нгуен и соавт. [14] синтезировали углеродные точки (УТ) с помощью фемтосекундной лазерной абляции графитного порошка в этилендиамине. На поверхности сформировались обильные функциональные группы, образующие множественные поверхностные состояния и приводящие к мультиэмиссии УТ. Они исследовали температурную чувствительность флуоресценции УТ с использованием стационарных флуоресцентных спектров. Температурно-зависимые спектры эмиссии УТ при возбуждении 320 нм показаны на рис. 7а. Обе интенсивности пиков 400 и 465 нм постепенно уменьшаются с повышением температуры из-за термической активации нерадиационных путей распада. Интенсивности пиков линейно меняются с температурой в диапазоне 5–85 °C (рис. 7b). Температурно-чувствительные УТ показали изменение интенсивностей флуоресценции 3,3 и 2,1% на °C для пиков 400 и 465 нм соответственно. Это указывает на то, что УТ могут использоваться как конвенциональные интенсивностные температурные сенсоры с высокой чувствительностью.

Замечательно, уникальное свойство мультиэмиссии делает УТ перспективными флюорофорами для ратиометрических флуоресцентных температурных сенсоров. Отношение двух интенсивностей флуоресценции при 400 и 465 нм (возбуждение 320 нм) в зависимости от температуры показано на рис. 7c. Существует очень хорошая линейная связь между отношением интенсивностей пиков и температурой в широком диапазоне 5–85 °C (R² = 0,998). Термическая линейность преимущественна, так как делает корреляцию между отношением интенсивностей пиков и температурой прямой и в то же время обеспечивает постоянную термическую чувствительность на всем динамическом диапазоне. Температурная чувствительность УТ определена как 1,48% °C⁻¹, что сравнимо с другими материалами. Следует отметить, что температурный диапазон отклика УТ намного шире, чем у других отчетов о двухэмиссионных температурных сенсорах, и охватывает как физиологическую температуру для биологических исследований, так и рабочую температуру для многих электронных устройств. Кроме возбуждения 320 нм, УТ также работают при других длинах волн возбуждения, таких как 340 и 365 нм, с той же чувствительностью. Таким образом, УТ могут использоваться для температурного сенсирования во многих практических приложениях путем выбора разных рабочих длин волн.

Они показали, что ратиометрический температурный сенсор был обратим между 20 и 50 °C, четыре цикла и фотстабилен (при изменении интенсивности источника питания) как показано на рис. 7d. Этот результат указывает на то, что система сенсирования УТ стабильна и надежна при любых изменениях концентрации образца, возбуждения или эффективности детекции.

Повышение температуры не всегда сопровождается PL-квенчированием; оно может также показывать усиление PL. Макаран и соавт. [29] показали PL-усиление двухфлуоресцентных углеродных точек с повышением температуры. Они приготовили биосовместимые двухфлуоресцирующие углеродные точки УТ в одноступенчатой микроволновой реакции с использованием формамида и глутатиона. Они обнаружили, что после возбуждения при 640 нм, интенсивность флуоресценции и интегрированная площадь PL увеличиваются в диапазоне 5–60 °C в 3,5 раза на всем аналитическом диапазоне и температуре (рис. 8а). Как показано на рис. 8b, линейный отклик (R² = 0,999) наблюдается на всем аналитическом диапазоне и температуре, а температурная чувствительность определена как высокая как 3,71% °C⁻¹.

Температурно-зависимая флуоресценция также изучалась при возбуждении 405 нм. Интересно, синие и красные флуоресцентные полосы не одинаково чувствительны к изменению температуры. С повышением температуры интенсивность флуоресценции (и соответствующая интегрированная площадь под кривой) синей компоненты показывает очень незначительное уменьшение в противовес красной компоненте, которая значительно увеличивается (рис. 8c). Эти наблюдения отмечены в диапазоне 5–60 °C, где синяя эмиссия уменьшается в 1,3 раза в противовес красной эмиссии, увеличивающейся в 3,0 раза.

Как показано на рис. 8d, отношение красной к синей флуоресценции увеличивается с температурой, и высоко линейный отклик триплицирован на 3 уникальных образцах, и линейный график отражает наблюдаемое с R² = 0,998. Эти анализы повторялись в среднем по этим измерениям, которые имеют небольшие отклонения при каждой температуре. Термическая чувствительность УТ на всем температурном диапазоне варьировалась от 1,33 до 4,81% °C⁻¹, что является улучшением по сравнению с ранее сообщенными системами нанотермометрии на основе углеродных точек и другими двухэмиссионными наноматериалами, такими как квантовые точки и композиты металло-органических каркасов-красителей. Термическое разрешение УТ рассчитано как 0,048 K⁻¹, указывая, что действительно возможно измерять малые термические изменения.

Чжан и соавт. [98] синтезировали УТ, имеющие температурно-отзывчивые характеристики в диапазоне 25–95 °C, с отличной чувствительностью и замечательной обратимостью/восстанавливаемостью (рис. 9а). Композиты УТ/эпоксидную смолу приготовили путем равномерного легирования УТ в эпоксидную смолу. Сначала 5 мкг УТ растворили в 50 мкл триэтилентетрамина (TETA). Затем добавили 350 мкл эпоксидной смолы в смешанный раствор и полностью смешали высокоскоростным перемешиванием. Полученный композит показал значительно улучшенный температурный отклик.

Эпоксидная смола — распространенная термоотверждающая смола, широко используемая для упаковки LED-кристаллов. Рис. 9б показывает оптические микрографы дисков композита УТ/эпоксидную смолу диаметром ~2 см и толщиной 8–10 мм. Отвердевшие композиты УТ/эпоксидную смолу прозрачны, и их спектры флуоресцентной эмиссии показаны на рис. 9c. Пик эмиссии композита УТ/эпоксидную смолу сине-сдвинут примерно на 10 нм по сравнению с УТ в растворе. Заметно, что температурный отклик композита значительно улучшен. В диапазоне 25–95 °C интенсивность флуоресценции уменьшается на 35% с повышением температуры, что более чем в два раза больше, чем в растворе, и линейные результаты более стабильны. Линейное уравнение удовлетворяет I₀/I = 0,0074 [°C] + 0,80454 (R² = 0,99724), где I₀ и I — интенсивность флуоресценции композита УТ/эпоксидную смолу до и после повышения температуры, а длина волны возбуждения 360 нм. Синий сдвиг пика эмиссии и усиление температурно-отзывчивых характеристик могут быть связаны с изменением диэлектрической постоянной среды, в которой находятся УТ. Композит имеет широкий температурный диапазон детектирования, и его отличная чувствительность и стабильность делают его подходящим для использования как температурный сенсор на основе флуоресцентного наноматериала в различных средах.

Механизм термочувствительности

На данный момент нет устоявшегося механизма для объяснения термочувствительного поведения углеродных точек. Некоторые отчеты приписывают механизм термической активации нерадиационных каналов поверхностных (ловушечных/дефектных) состояний. Общая картина такова: нерадиационные каналы не активированы при низких температурах, поэтому возбужденные электроны могут излучать фотоны радиативно. Наоборот, по мере повышения температуры все больше нерадиационных каналов активируется, и возбужденные электроны возвращаются в основное состояние нерадиационными процессами, приводя к уменьшению интенсивности флуоресценции [2, 95, 99, 100, 103]. Механизм эмиссии УТ при нагреве/охлаждении показан на рис. 10.

Для лучшего понимания термодинамики процессов эмиссии УТ, Каличук и соавт. [89] соотнесли радиационные (τᵣ⁻¹) и нерадиационные (τₙᵣ⁻¹) скорости рекомбинации образца УТ с его квантовым выходом PL. Радиационная скорость определяется из квантового выхода PL (QY) и измеренной скорости рекомбинации τ⁻¹ как τᵣ⁻¹ = QY × τ⁻¹. Нерадиационная скорость релаксации τₙᵣ⁻¹ выражается как τₙᵣ⁻¹ = τ⁻¹ - τᵣ⁻¹. Оба радиационный и нерадиационный коэффициенты рекомбинации, полученные из данных времени-разрешенных измерений PL, построены как функции температуры на рис. 11. Радиационная скорость рекомбинации больше соответствующей нерадиационной до 70 °C и не меняется заметно при температурах между 2 и 80 °C, оставаясь в диапазоне (0,74–0,82) × 10⁶ с⁻¹. В противовес, наблюдается выраженное (почти 7-кратное, от 0,16 × 10⁶ до 1,12 × 10⁶ с⁻¹) монотонное увеличение скорости нерадиационной рекомбинации при повышении температуры от 2 до 80 °C. Температурно-зависимый переход радиационных и нерадиационных скоростей происходит при 70 °C, при котором температуре PL QY составляет 50%. Эти результаты указывают, что температурная активация PL-квенчирования в их УТ в основном вызвана активацией нерадиационных каналов релаксации [89].

Гуо и соавт. [102] приписали термическое квенчирование их приготовленных углеродных точек не только активации нерадиационного процесса распада, но и возникновению нерадиационного захвата с повышением температуры. Они измерили температурно-зависимые времена жизни распада УТ, показанные на рис. 12а. Данные собраны путем мониторинга максимума эмиссии в функции температуры под лазерным возбуждением 320 нм. Результат показывает, что PL-время жизни падает с 15,03 до 11,70 нс при повышении температуры от 283 до 343 К, что можно приписать возникновению нерадиационных процессов распада. Кроме того, PL-динамика релаксации УТ раскрывает многоэкспоненциальное затухание с повышением температуры, что предполагает, что фотовозбужденные носители следуют сложным процессам релаксации. Возникновение нерадиационного захвата будет увеличиваться с повышением температуры, и это может быть количественно проанализировано графиком Аррениуса интегрированных PL-интенсивностей как: I = I₀ / [1 + a exp(-Eₐ/kT)].

где Eₐ — активационная энергия, k — постоянная Больцмана, a — постоянная. Рис. 12а показывает построение интенсивности эмиссии относительно 1/T, где значение активационной энергии (Eₐ) рассчитано как 0,329 ± 0,02 эВ. Для зондирования причины термического квенчирования процесса эмиссии УТ, радиационные (Vᵣ) и нерадиационные (Vₙᵣ) скорости рекомбинации УТ определялись из времени жизни (τ*) и квантового выхода (QY) как: τ* = 1/(Vᵣ+Vₙᵣ); QY = Vᵣ/(Vᵣ+Vₙᵣ). QY УТ при различных температурах рассчитывали из их температурно-зависимого поглощения и интегрированной PL-интенсивности с QY, определенным при комнатной температуре. Они заметили, что радиационные скорости незначительно снижаются при повышении температуры от 283 до 343 К; в то же время нерадиационные скорости рекомбинации постепенно увеличиваются примерно в 2 раза. Эти результаты дополнительно указывают, что температурно-активированное PL-квенчирование в УТ в основном обусловлено активацией нерадиационных каналов релаксации [102].

Другие группы использовали микроскопические и спектроскопические техники для понимания механизма термочувствительности углеродных точек.

Ван и соавт. использовали ТЭМ и UV-Vis спектры для изучения температурно-отзывчивого PL-поведения приготовленных УТ. Как показано на рис. 13а, УТ не показывают изменений в UV-Vis спектрах при повышении температуры от 20 до 80 °C. Однако обнаружили, что средний диаметр УТ увеличился с 2,6 ± 0,2 нм при комнатной температуре до 4,4 ± 0,2 нм при 80 °C (рис. 13b). Таким образом, повышение температуры привело к агрегации приготовленных УТ, что вызвало явное квенчирование флуоресценции [1].

Хе и соавт. [101] сообщили, что гидратационный размер частиц их УТ становится больше с повышением температуры (рис. 14а), что указывает на то, что повышение температуры приводит к агрегации УТ, в конечном счете приводящей к квенчированию флуоресценции. Тем не менее, с понижением температуры гидратационный размер частиц УТ начинает уменьшаться (рис. 14b), что указывает на то, что охлаждение имеет потенциал вызывать деполимеризацию УТ [101].

Другая группа, например Цуй и соавт., также приписали квенчирование флуоресценции агрегации УТ. Они также пытались применить нелегированные УТ, синтезированные только с акриловой кислотой как прекурсором, в температурных сенсорах. К сожалению, нелегированные УТ обладали более слабыми эффектами квенчирования при том же повышении температуры, чем легированные УТ [92].

Ян и соавт. [94] в своей работе предложили два ключевых фактора касательно температурно-зависимого PL-свойства N-УТ, включая (i) поверхностные функциональные группы и (ii) водородные связи. Для изучения эффекта первого фактора, поверхностных O-содержащих групп, провели контрольный эксперимент путем обработки N-УТ (4,0 мл) сильным восстановителем NaBH₄ (1,0 мл, 0,1 моль Л⁻¹) для удаления C=O видов на поверхности углеродных точек. Полученные восстановленные N-УТ обозначены как r-N-УТ для краткости. По сравнению с N-УТ, r-N-УТ демонстрируют более слабую интенсивность флуоресценции (рис. 15а). Кроме того, интенсивность флуоресценции r-N-УТ уменьшается всего на 13% при повышении температуры от 20 до 80 °C (вставка на рис. 15а), что дает намного более низкую температурную чувствительность, что приписывается уменьшению O-содержащих групп [94].

Второй фактор, эффект водородных связей с растворителем на флуоресцентное поведение N-УТ, исследовали. Раствор N-УТ (1,0 мл) капали на фильтровальную бумагу и оставляли высыхать на воздухе для получения твердого образца, который все еще излучает яркую флуоресценцию. Однако никакого очевидного изменения интенсивности флуоресценции твердых N-УТ с повышением температуры не наблюдалось. Они также измеряли флуоресценцию N-УТ, диспергированных в этаноле. Интенсивность флуоресценции N-УТ в C₂H₅OH ниже, чем в воде, и малое изменение PL-интенсивности наблюдается с повышением температуры от 20 до 80 °C (рис. 15b). Следовательно, сильные водородные связи играют ключевую роль в температурно-зависимом PL-свойстве N-УТ. Рис. 15c — схематический механизм температурно-зависимой интенсивности флуоресценции N-УТ [94].

Однако наша группа использовала ту же экспериментальную стратегию, что и группа Ян; в обоих случаях эмиссия r-УТ и e-УТ квенчировалась линейно с повышением температуры, так же как исходные результаты их УТ (рис. 16). Таким образом, наши результаты исключили синергетические эффекты обильных кислородсодержащих функциональных групп и водородных связей [77].

Биовизуализация в живых клетках (термическое изображения)

В литературе лишь несколько статей исследовали температурно-отзывчивые флуоресцентные свойства УТ в биологической визуализации. Перед такими экспериментами in vitro цитотоксический анализ критически важен для УТ, так как он позволяет оценить токсичность УТ в живых субъектах. In vitro цитотоксический анализ оценивает эффект или влияние наноматериала на культивируемые клетки [89].

Ян и соавт. [94] проверили, что УТ могут использоваться как эффективный термометр в живых клетках; клетки HeLa промывали PBS после инкубации с УТ 6 ч. Ярко-синяя флуоресценция УТ в клетках HeLa наблюдается при температуре 25 °C, как показано на рис. 17а. С повышением температуры до 37 °C синяя флуоресценция становится слабее (рис. 17b), флуоресценция N-УТ восстанавливается при снижении температуры до 25 °C (рис. 17c). Как термическое изображения in vivo, флуоресцентные изображения мышей собирали сразу после инъекции N-УТ при разных температурах. Устанавливая интенсивность флуоресценции при 28 °C как референс (I₀), I/I₀ области, куда инъецировали УТ, варьируется от 1,0 до 0,87 с повышением температуры от 28 до 34 °C (рис. 17d, e). При дальнейшем повышении температуры до 43 °C I/I₀ падает до 0,52 и флуоресценция становится почти не детектируемой (рис. 17f). И I/I₀ может обратимо возрасти обратно от 0,66 до 1,0 с понижением температуры от 39 до 28 °C (рис. 17g–i). Все эти результаты указывали на то, что N-УТ могут использоваться как эффективные in vitro и in vivo нанотермометры [94].

В исследовательском эксперименте Каличук и соавт. проверили способность УТ к внутриклеточному температурному мониторингу в человеческих цервикальных раковых клетках HeLa. Рис. 18 показывает измеренные внутриклеточные температуры клеток HeLa, инкубированных с УТ (500 мкг/мл). Кривые PL-затухания УТ при каждой температуре были высоковоспроизводимы и могли быть аппроксимированы одноэкспоненциальной функцией при всех записанных температурах. На рис. 18а записанные кривые PL-затухания для температур между 25 и 50 °C (с шагом 5 °C) указаны символами, в то время как соответствующие одноэкспоненциальные аппроксимации представлены сплошными линиями. Они смогли подтвердить, что PL-сигнал в этих измерениях PL-времени жизни был получен исключительно от УТ для концентрации УТ ≥ 100 мкг/мл. Внутриклеточная температура в каждом измерении определялась из калибровочной кривой между PL-временем жизни при повышении температуры от 2 до 80 °C. Температуры, определенные таким образом (T_meas), построены как функции PL-времени жизни на рис. 18b. Независимо, температура клетчатого раствора определялась с использованием калиброванного референс-термометра (показан на рис. 18b как T_set). Температуры, сообщенные люминесцентным зондом УТ и референс-детектором, в хорошем согласии. Эти результаты показывают, что PL-время жизни нанозондов на основе УТ может быть надежно использовано для измерения внутриклеточных температур [89].

Для дальнейшей оценки потенциала люминесцентных нанозондов УТ для долгосрочного мониторинга температуры в реальном времени, профили PL-затухания клеток HeLa, инкубированных с УТ (500 мкг/мл), каждые 15 мин в течение 24 ч записывали. PL-времени жизни, извлеченные из измеренных значений PL-затухания в этот период, затем строились как функции времени, как показано на рис. 18c. Используя эти результаты, вариация температуры во времени рассчитывали с использованием калибровочной кривой, как показано на рис. 18d. Кроме того, температура образца в каждой точке измерения определялась с использованием референс-термометра с воспроизводимостью температуры 60 мК. Температура, определенная с референс-термометром, построена на рис. 18e, показывая отличное согласование между измеренными и референсными температурами. Высокая точность PL-базированных температурных измерений дополнительно демонстрируется статистическим анализом разностей между измеренными и реальными (референсными) температурами (рис. 18f). Используя эти данные, абсолютная средняя точность детектирования температуры представленным методом рассчитана как 0,27 °C. Этот эксперимент подтверждает потенциал CD-базированных термических зондов в биологических системах [89].

Макаран и соавт. [29] продемонстрировали, что приготовленные УТ могут использоваться для термического сенсирования внутри клеток с использованием интенсивностных и ратиометрических подходов. Клетки HeLa, обработанные УТ, позволяли равновеситься при 32, 37 и 42 °C (рис. 19). Возбуждение при 640 нм использовалось для селективного мониторинга красной флуоресценции УТ в клетках. Термические изменения могли быть связаны с изменениями внутриклеточной концентрации или не коррелировать с изменением интенсивности (λex = 640 нм). Это могло быть связано с изменениями внутриклеточной концентрации или локализации УТ при более высоких температурах. Таким образом, простое доверие на изменения интенсивности флуоресценции ведет к точному внутриклеточному термическому сенсированию.

В противовес, эти ограничения исключаются с использованием ратиометрического подхода. УТ сохраняют двойную синюю и красную флуоресценцию в клетках после возбуждения 405 нм, как ранее наблюдалось для коллоидных дисперсий (рис. 19). Отношение красной к синей флуоресценции увеличивается с повышением температуры, со значениями 1,8 при 32 °C, 2,0 при 37 °C и 2,3 при 42 °C. Ратиометрическая связь красной-к-синей флуоресценции УТ подчеркивает преимущество ратиометрического температурного сенсирования в разработке флуоресцентных нанотермометрических зондов. Относительное отношение красной-к-синей эмиссии остается неизменным независимо от количества УТ, поглощенных клетками, что может зависеть от различных факторов, таких как конфлюэнтность, и не зависит от концентрации. Наконец, УТ показали обратимость флуоресценции относительно изменений внутриклеточной температуры. После инкубации в клетках HeLa они подвергали циклу нагрева/охлаждения 32/42/32 °C. Это подчеркивает надежность предложенного CD-нанотермометра и эти находки дополнительно демонстрируют флуоресцентную обратимость [29].

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия использовалась для термического изображения клеток колоректального рака HT-29 с использованием N, S, I-легированных УТ, как показано на рис. 20 [100]. Флуоресцентные пятна были температурно-зависимы, как показано на рис. 20g–i, самым интенсивным при 15 °C, в то время как самая слабая точка была при 35 °C. Интересно, флуоресцентные пятна были обратимы, и пятна были очень фотстабильны после 20 мин непрерывного возбуждения [100]. Шин и соавт. [96] также использовали конфокальную лазерную сканирующую микроскопию для клеток HeLa, показанные на рис. 20e–g.

Ли и соавт. [103] приготовили нанокомпозит, состоящий из MnOx-УТ, для использования как нано термо-отзывчивый флюорофор для биологических сред. Клетки HepG2 инкубировали с MnOx-УТ при разных температурах культивирования. Как проиллюстрировано конфокальной лазерной сканирующей микроскопией (возбуждено при 405 нм), синяя люминесценция MnOx-УТ в клетках HepG2 слаба, когда температура среды 40 °C (рис. 21а), и синяя люминесценция MnOx-УТ в клетках HepG2 усиливается при снижении температуры до 30 °C (рис. 21b) даже до 20 °C (рис. 21c). Благодаря температурно-отзывчивым свойствам, синтезированные MnOx-УТ могут быть легко применены в биомедицинских областях, таких как биовизуализация и фотодинамическая терапия при лечении рака [103].

Заключение и будущие перспективы

Углеродные нанодочки демонстрируют уникальные свойства для использования в нанотермометрии, такие как термочувствительность, низкая стоимость и фотстабильность. Гибкая поверхностная модификация и легкая подготовка прокладывают путь для создания огромного числа термочувствительных наноматериалов для различных приложений. Общие тенденции в термочувствительных наноматериалах направлены на повышение фотстабильности и термического разрешения с использованием дешевых и безопасных материалов. УТ можно классифицировать как новое поколение термометров, которые могут удовлетворить эти требования и использоваться для биомедицинских термометрических приложений, таких как температурный мониторинг при гипертермической терапии. Протоколы легкой подготовки, биосовместимость и легкая функционализация УТ — перспективные критерии, делающие УТ альтернативными материалами нанотермометров следующего поколения. Требуются больше усилий для продвижения фундаментальных исследований в этой области. Ограничения должны быть преодолены для производства нанотермометров на основе углеродных точек, включающих повышение термической чувствительности и работу в более широком температурном диапазоне. Лучшее понимание механизма флуоресцентного термического сенсирования — еще один ключевой вопрос для возможности проектирования и манипулирования структурой УТ и повышения термического разрешения. Необходимы больше экспериментов и теоретического моделирования для понимания корреляции между методами fabricación УТ и их термическим поведением.