F-актин медиумирует остеогенное дифференцирование мезенхимальных стволовых клеток на TiO2 нанотрубках через MKL1 и YAP/TAZ

Аннотация

Титан и титановые сплавы широко применяются в ортопедических имплантатах. Модификация нанотопографии дает новую стратегию улучшения остеоинтеграции титановых подложек. Полимеризация филаментозного актина (F-актин) как механическая нагрузочная структура считается вовлеченной в миграцию клеток, эндоцитоз, деление и поддержание формы. Остается неясным, участвует ли F-актин в нанотрубко-индуцированном остеогенном дифференцировании мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и каков его механизм. В работе TiO₂ нанотрубки получены на титановой подложке анодным окислением, характеристики изучены SEM, рентгеновским энергодисперсионным анализом (EDS) и атомно-силовой микроскопией (AFM). ALP-окраска, уэстерн-блоттинг, qRT-PCR, иммунофлуоресцентная окраска использовались для оценки остеогенного потенциала, уровня F-актина, экспрессии MKL1 и YAP/TAZ. Результаты: внутренний диаметр и шероховатость нанотрубок растут с увеличением напряжения анодного окисления от 30 до 70 В, высота постоянно ~2 мкм. Чем больше диаметр, тем сильнее способность нанотрубок стимулировать остеогенное дифференцирование МСК. Ингибирование полимеризации F-актина цитохалазином D (Cyto D) подавляет остеогенное дифференцирование и экспрессию белков фокальных адгезий (винкулин VCL, киназа фокальных адгезий FAK). Стабилизация F-актина жасплакинолидом (Jasp) усиливает экспрессию RhoA и транскрипционных факторов YAP/TAZ. Вывод: TiO₂ нанотрубки способствуют остеогенному дифференцированию МСК, эффект усиливается с ростом диаметра в диапазоне 30–70 В. F-актин медиумирует этот процесс через MKL1 и YAP/TAZ.

Введение

Титан и его сплавы из-за отличной биосовместимости, коррозионной стойкости и механических свойств широко используются в клинике: тотальные суставные эндопротезы, стоматологические импланты. Остаются проблемы: асептическое ослабление, инфекции. В последние годы многочисленные исследования направлены на улучшение остеоинтеграции и антибактериальных свойств. Например, покрытие MoS₂/PDA-RGD на титановых имплантах не только улучшает интеграцию с костью, но и эффективно подавляет бактерии. Поверхностная топография привлекает внимание: топографическая модификация меняет только микро- и наноструктуру, в отличие от химической. Химическая стимуляция клеток нестабильна и цитотоксична. Физические сигналы безопасны и контролируемы, избегают побочных эффектов химических молекул. Топографическая модификация имплантов и регуляция остеоинтеграции через топографию — новый путь решения проблемы плохой остеоинтеграции после имплантации.

В костной тканевой инженерии и регенерации взаимодействие клетка-морфология рассматривается как перспективная стратегия точного управления функцией и дифференцированием посевных клеток. Кость имеет элегантную иерархию в нанометровом и микрометровом масштабах. Поверхностная морфология может создать аналогичную нишу, имитирующую природную костную структуру и стимулирующую остеогенное дифференцирование МСК на поверхности кости и импланта. Морфологии бывают разными: нанотрубки, нанопроволоки, нанопоры. Особенно нанотрубчатые массивы привлекли интерес благодаря уникальным свойствам: высокое отношение площади к объему, биологическая пластичность, высокая адсорбционная способность. Например, нитрид бора нанотрубки (BNNT) — газосенсорный материал для мониторинга трансформаторов по растворенным газам в масле. В биомедицине нанотопография направляет клеточное поведение: миграция, адгезия, пролиферация, дифференцирование. Недавние работы показывают, что нанотопография направляет МСК в остеобласты для усиления ранней остеоинтеграции. Даже комбинированная микро- и наномодификация может дифференцировать МСК в сократительно-гладкомышечные клетки. Однако молекулярные механизмы, как поверхностная топография определяет клеточную судьбу, пока неясны — важно для оценки биосовместимости и дизайна материалов.

Филаментозный (F)-актин (микрофиламент) — один из трех основных компонентов цитоскелета эукариотических клеток. Состоит из полимеров глобулярного (G)-актина, модифицированных множеством белков. F-актин имеет структурную полярность: все субъединица микрофиламента направлены к одному концу. Заостренный конец направлен к соседнему мономеру, тупой — имеет субъединицу с открытым сайтом связывания АТФ. АТФ участвует в превращении G-актин ⇄ F-актин. Процесс в динамическом равновесии: полимеризация и деполимеризация одновременно (тредмиллинг), виден в ламеллиподиях и филоподиях. Очевидно, динамика актина важна для миграции, деления, поддержания формы. Но F-актин не только физическая опора, но и участник сигнального трансляции и генной экспрессии. Нарастающие доказательства: F-актин конвертирует физические сигналы в химические через взаимодействие с белками. Биомеханическая и геометрическая реконструкция индуцируют апоптоз опухолевых клеток, предотвращая полимеризацию актина. Ультразвук усиливает остеогенез человеческих МСК, ингибируя деполимеризацию F-актина. Наше предыдущее исследование показало, что механическое напряжение повышает стабильность F-актина. Поскольку полая структура нанотрубок дает меньше сайтов адгезии, перестройка цитоскелета неизбежна для поддержания биомеханического баланса. Следовательно, есть основания полагать, что F-актин медиумирует нанотопографию-индуцированное клеточное дифференцирование.

В работе изготовлены TiO₂ нанотрубки анодным окислением, модифицирована топография, изучена способность стимулировать остеогенное дифференцирование МСК. Исследована критическая роль F-актина в механико-трансдукции. Цитохалазин D (Cyto D) — конкурирует за заостренный конец F-актина, предотвращая включение G-актина в филамент — использовался для ингибирования полимеризации. Жасплакинолид (Jasp) — для усиления стабилизации актинового скелета. Также целью былоucidate, как F-актин превращает физические сигналы в биохимические. На основе предыдущих результатов гипотеза: задействован MAPK путь. Транскрипционные факторы YAP/TAZ и MKL1, считающиеся механиосенсорами и механико-трансдукторами, изучались как кандидаты на роль посредников влияния F-актина на судьбу стволовых клеток, так как в других областях показана их связь с F-актином. Цель — прояснить роль F-актина в дифференцировании стволовых клеток, индуцируемом нанотрубками, для направления дизайна материалов и биосоценки имплантов.

Материалы и методы

Фабрикация TiO₂ нанотрубок

Чистые титановые пластины (99,9%, толщина 2 мм; Shengshida, Хэбэй, Китай) как подложка шлифовались наждачной бумагой №400 и 1500. Последовательно промывались ацетоном, безводным спиртом, деионизированной водой в ультразвуковой ванне, сушились при комнатной температуре 3 ч. Для нанотопографии образцы фиксировали как анод, платиновый кусок — катод в водном электролите 0,15 М NH₄F + 90% гликоль 1 ч. Напряжение анодного окисления: постоянное 30, 40, 50, 60, 70 В. После окисления промывка деионизированной водой 30 мин, ультразвуковая промывка спиртом 15 мин. Стерилизация в автоклаве 120 °C 1 ч, затем смачивание средой перед использованием.

Механизм образования нанотрубок неясен, главная теория — полеусиленное растворение. Формирование массивов — динамическое равновесие полеового окисления, полеового растворения, химического растворения (рис. 1b). Процесс: шаг 1 — барьерный оксидный слой на границе электролит-металл: Ti⁴⁺ + 2H₂O → TiO₂ + 4H⁺ (1). Затем трещины и щели на поверхности из-за полеусиленного растворения оксидного слоя. Диффузия F^- в трещины ускоряет растворение. Трещины расширяются, соединяются с соседними. Наконец, скорость формирования и растворения титанового оксида достигают динамического баланса, нанотрубки перестают расти: TiO₂ + 6F^- + 4H⁺ → [TiF₆]^2- + 2H₂O (2).

Характеризация поверхности

Образцы при разных напряжениях (30, 40, 50, 60, 70 В) промывали этанолом и деионизированной водой 15 мин, сушили при комнатной температуре. SEM (SEM450, FEI Nova Nano SEM; Thermo Fisher Scientific, USA) для поверхностной структуры, измерения внутреннего диаметра и высоты после напыления тонкого слоя золота. EDS для элементного состава. AFM (NanoManVS, Bruker Nano Surfaces, Belgium) для поверхностной морфологии и шероховатости (Ra — среднее арифметическое отклонение профиля). Три зоны на образце, измерения в трикратном повторении.

Клеточная культура

Четырёхнедельные самцы крыс Sprague-Dawley (SD) из экспериментального центра Шанхайской 9-й больницы. Крысиные костнозилковые МСК (BMSC) асептично изолированы из бедренных и голеневых костей. Очищены и расширены в α-MEM (Hyclone, USA) с 10% ФБС (Gibco), 100 мг/мл стрептомицина, 100 МЕ/мл пенициллина, 37 °C, 5% CO₂, 95% воздуха. Среда менялась каждые 2 дня, пассажирование при 80% конфлюэнции. Использовались пассажи 3–5. Остеогенная индукционная среда: среда роста + 100 нМ дексаметазон, 10 мМ β-глицерофосфат, 50 мМ аскорбиновая кислота (Sigma-Aldrich).

Анализ пролиферации клеток

TiO₂ нанотрубчатые пластины нарезали кругами, поместили в ячейки 24- puits пластинки. BMSC пассажи 3–5 посеяли на нанотрубки плотностью 3×10⁴ клеток/диск в среде роста или остеогенной. Через 2 дня добавляли Cyto D и Jasp (регуляторы F-актина) ежедневно 3 дня. Финальные концентрации и время: Cyto D 5 мкМ, 1 ч; Jasp 2 мкМ, 3 ч. После инкубации среду меняли. Жизнеспособность и пролиферация: CCK-8 (Dojindo, Япония) через 12 ч после лечения. Инкубация с 10% CCK-8 2 ч при 37 °C, 5% CO₂. 100 мкл реакционной смеси в 96-путевую пластинку, абсорбция формазана при 450 нм (Multiscan UV-Vis, Safire2, TECAN, Швейцария). Также подсчет клеток автоматическим счетчиком (AMQAX1000, Life Technologies). Перед подсчетом BMSC энзиматически отделяли от нанотрубок, окрашивали трипан-синим.

ALP-окраска и анализ активности ALP

BMSC посеяли на пять типов TiO₂ нанотрубок (30, 40, 50, 60, 70 В) плотностью 3×10⁴/ячейку в остеогенной среде. Реагенты добавляли как выше. Через 7 дней инкубации: промывка 3×PBS, фиксация 4% параформальдегидом, инкубация в рабочем растворе ALP по инструкции к набору (Hongqiao, Шанхай). Результаты под стереомикроскопом после промывки PBS.

Для анализа активности ALP: лизис клеток RIPA-буфером без ингибиторов протеаз и фосфатаз, центрифугация, определение по набору ALP Assay Kit (Beyotime) по протоколу. Активность нормировали на белковую концентрацию лизата.

Иммуноцитохимия

Через 3 дня лечения Cyto D и Jasp: фиксация 4% параформальдегидом 20 мин при комнатной температуре, 3×PBS. Пермеабилизация 0,3% Triton X-100 30 мин, 3×PBS. Окраска родамином-сопряженным фаллоидином 1 ч при комнатной температуре в темноте. Промывка PBS, контрастная окраска DAPI (Beyotime) 10 мин. 3×PBS, монтаж на стеклобъективе, конфокальная микроскопия.

Уэстерн-блоттинг

Для оценки белковой экспрессии: BMSC на нанотрубках собраны трипсином (Gibco). 3×PBS, лизис RIPA с коктейлем ингибиторов протеаз/фосфатаз 30 мин на льду. Центрифуга 12 000×g 15 мин 4 °C. Белковая концентрация супернатанта — BCA-набор (Beyotime). Загрузочный буфер, кипячение 95 °C 15 мин. 10 мкл препарата на 12,5% SDS-PAGE (EpiZyme), электрофорез 120 В 1 ч, электроперенос на PVDF-мембрану 250 мА 2 ч. Блокировка 5–10% обезжиренного сухого молока в TBST 1 ч на шейкере при комнатной температуре. Инкубация с первичными антителами в буфере разбавления (Beyotime) 4 °C overnight. После 3×TBST 5 мин — вторичные флуоресцентно-сопряженные антитела, инкубация 1 ч при комнатной температуре в темноте. Детекция двухцветной инфракрасной флуоресцентной системой (Odyssey, LiCor Biosciences, USA). При единообразных полосах внутреннего референса — стриппинг мембраны и репробинг другим первичным антителом. Внутренний референс — анти-GAPDH. Другие первичные антитела: анти-винкулин (1:1000, Abcam), анти-FAK (1:1000, CST), анти-Runx2 (1:1000, CST), анти-RhoA (1:1000, CST), анти-F-актин (1:500, Abcam), анти-Osx (1:500, Abcam), анти-фосфо-YAP (1:1000, CST). Вторичные: коза anti-mouse IgG H&L (IRDye 680RD, 1:5000, Abcam), коза anti-rabbit IgG H&L (IRDye 680RD, 1:5000, Abcam).

Количественный PCR в реальном времени

qRT-PCR на 7-й день для оценки геновой экспрессии: Runx2, Osx, Alp, OCN, RhoA, YAP, TAZ, VCL, FAK, MKL1 в клетках в остеогенной среде на нанотрубках. Полный РНК извлечен набором Total RNA Kit (R6812-01HP, Omega Bio-Tek, USA). Концентрация и чистота по оптической плотности 260 нм: только образцы с A260/280 и A260/230 >1,8 анализировались. РНК → цДНК набором qScript cDNA Synthesis (Takara, Япония). qRT-PCR с SYBR Premix Ex Taq (Takara) на QuantStudio 6 Flex (Life Technologies). GAPDH — хаускипинг-ген. Анализ методом 2^-ΔΔCt, результаты как фолд-изменения относительно контроля. Праймеры в таблице 1.

Статистический анализ

Данные — минимум три независимых эксперимента в трикратном повторении, если не указано иначе. Выражаются как среднее ± SD. Различия между группами: однофакторный дисперсионный анализ с пост-хок тестом Стьюдента-Ньюмана-Кейлса или t-тестом Стьюдента. P < 0,05 — статистически значимо.

Результаты

Характеризация поверхности

TiO₂ нанотрубки на чистом титане анодным окислением при постоянных напряжениях 30, 40, 50, 60, 70 В на 1 ч (рис. 1). SEM: равномерный самосборный массив нанотрубок. Виды сбоку и сверху (рис. 2a, b). Высота нанотрубок во всех образцах ~2 мкм. Внутренние диаметры: ~74 нм (30 В), 92 нм (40 В), 112 нм (50 В), 128 нм (60 В), 148 нм (70 В) (рис. 2c). Высота зависит от времени окисления, диаметр — от напряжения. EDS (рис. 2d, e): нанотрубки состоят только из O и Ti. AFM (рис. 2f): шероховатость Ra растет с диаметром (т.е. с напряжением) (рис. 2g).

TiO₂ нанотрубки индуцируют остеогенное дифференцирование МСК

После 7 дней остеоиндукции: ALP-окраска (рис. 3а). МСК на нанотрубках — более высокая активность ALP, чем на гладком титане (контроль). Статистика площади окраски: способность индуцировать остеогенез значительно выше контроля. Тренд: в диапазоне диаметров эксперимента чем больше диаметр, тем сильнее индукция (рис. 3b). 70 В группа использована для последующих экспериментов. Анализ геновой экспрессии остеогенных маркеров на 3 и 7 днях (рис. 3d–g): МСК на нанотрубках на 3 и 7 днях показывают значительное повышение экспрессии RUNX2, ALP, OCN, OSX vs контроль. Уэстерн-блоттинг (рис. 3c): белковая экспрессия RUNX2 и OSX также повышена на 7-й день. Интересно: F-актин урегулирован в группе нанотрубок. Вывод: TiO₂ нанотрубки направляют МСК к остеобластическому дифференцированию, эффект зависит от диаметра. Также предполагается вовлеченность F-актина.

F-актин медиумирует остеобластическое дифференцирование МСК на TiO₂ нанотрубках

Для проверки участия F-актина использовали Jasp (позитивный регулятор полимеризации) и Cyto D (негативный). Конфокальные фото Rhodamine-Phalloidin (рис. 5a): при Cyto D F-актин почти полностью деполимеризован, фиброзные структуры редки; Jasp стабилизирует и полимеризует F-актин — более яркие и четкие пучковые структуры vs контроль. Уэстерн-блоттинг (рис. 5b) подтверждает изменение белковой экспрессии F-актина — препараты действуют как ожидалось. Пролиферация (рис. 4a, b): Cyto D значительно ингибирует, Jasp стимулирует рост (CCK-8 и автоматический счетчик согласованы).

Оценка остеогенного дифференцирования: ALP — ранний маркер (рис. 4c, d). Vs контроль: Cyto D снижает экспрессию и активность ALP, Jasp — повышает. Согласовано: Jasp повышает белковые уровни RUNX2 и OSX, Cyto D — противоположный эффект (рис. 4c). mRNA экспрессия остеоспецифических генов (RUNX2, ALP, OCN, OSX) показывает тот же тренд (рис. 4e–h). Вывод: F-актин играет важную роль в остеогенном дифференцировании МСК, индуцируемом TiO₂ нанотрубками. Продвижение деполимеризации ингибирует нанотопографию-индуцированное остеобластическое дифференцирование; стабилизация и полимеризация F-актина — усиливает.

F-актин регулирует остеобластическое дифференцирование МСК на TiO₂ нанотрубках через MKL1 и YAP/TAZ

Для раскрытия механизма изучали белки/молекулы, прямо взаимодействующие с F-актином или влияющие на его полимеризацию. Во-первых, как нанотопография влияет на баланс F-актин/G-актин. TiO₂ нанотрубки — физический сигнал, отличный от мембранопроницаемых химических, поэтому для передачи стимула в клетку нужны компоненты клеточной мембраны. Накопленные данные: фокальный адгезионный комплекс (интегрины, талин, FAK, винкулин VCL, тензин и др.) работает как сигнальный переносчик, информируя клетку о состоянии внеклеточной матрицы (ECM) и влияя на биологическое поведение. Важно: F-актин связывается с интегринами через фокальные адгезионные комплексы, формируя механические связи между внутриклеточными актиновыми пучками и ECM. Анализ экспрессии компонентов фокального адгезионного комплекса (рис. 5b, 6a, b): белковая и mRNA экспрессия VCL и FAK согласованы с изменениями F-актина — фокальный адгезионный комплекс участвует в остеогенном дифференцировании, индуцируемом нанотрубками. Также RhoA (малый GTPаза белок семейства Rho) урегулирован при Jasp и ингибирован Cyto D (рис. 5b, 6a, b). RhoA — важный восходящий сигнальный транслятор в MAPK пути, регулируется FAK. Главная функция RhoA — продвижение полимеризации и стабильности стресс-фибер (F-актин) и сборки фокального адгезионного комплекса. Вместе: TiO₂ нанотрубки влияют на полимеризацию F-актина через фокальный адгезионный комплекс и RhoA.

Но как F-актин регулирует клеточную судьбу? Большинство работ: F-актин в миграции, делении, эндоцитозе, инвазии опухолевых клеток. Мало работ о регуляции дифференцирования, тем более о молекулярном механизме. Поиск литературы по изменениям F-актина выявил: YAP/TAZ — два близких транскрипционных коактиватора в пути Hippo, шаттлющие между цитоплазмой и ядром, могут служить механико-трансдукторами регуляции дифференцирования МСК. Также MKL1 — ключевой регулятор дифференцировки гладкомышечных клеток, взаимодействует с транскрипционным фактором SRF, может связывать G-актин и циркулировать между цитоплазмой и ядром. Результаты идентифицировали вовлеченность YAP/TAZ и MKL1 в нанотрубко-индуцированное остеобластическое дифференцирование, медиумируемое F-актином (рис. 5b, 6d–f). Интересно: белковая экспрессия фосфо-YAP показывает обратный тренд — меняется не только экспрессия YAP, но и его фосфорилирование под действием Cyto D и Jasp (рис. 5b). Согласуется с данными: фосфорилирование YAP/TAZ удерживает их в цитоплазме.

Итог: F-актин регулирует остеобластическое дифференцирование МСК на TiO₂ нанотрубках через MKL1 и YAP/TAZ (схема на рис. 7).

Обсуждение

Титан и сплавы — основные металлы в ортопедии. Асептическое ослабление — острая проблема, ключ — улучшение интеграции импланта с костью. Предыдущие работы: покрытия, модификации, иммобилизация биофункциональных молекул полезны для остеоинтеграции. Недавно поверхностная топография имплантов привлекла исследователей благодаря изучению клеточного отклика на физические сигналы. В работе продемонстрирована способность нанотрубок стимулировать остеогенное дифференцирование МСК, усиливающаяся с ростом внутреннего диаметра (30–70 В). Это поможет выбрать диаметр нанотрубок на поверхности имплантов.

Как топографическая структура, нанотрубки меняют физические свойства материала: адсорбционную способность, электрическую и тепловую проводимость. Эти свойства определяют промышленное применение. Например, высоковольтные трансформаторы заполнены изоляционным материалом (трансформаторное масло или газ). При отказе изоляции из-за перегрева и ЧР возникают серьезные аварии. Нужен эффективный метод детектирования концентрации и типов растворенных газов или компонентов разложения изоляции для мониторинга состояния трансформатора. Традиционный подход — поиск материалов с хорошей газоадсорбцией в переходных элементах, богатых d-электронами (Pd(111)). Сейчас нанотрубки широко изучают для газоадсорбции. He et al.: CuO-BNNT пригоден для адсорбции C₂H₂ из-за более сильной адсорбции. TiO₂ сам по себе может быть газосенсорным материалом. Gui et al.: Co-допингованный TiO₂ усиливает газоадсорбцию и проводимость к C₂H₄. Mn-допингованный графен также показывает улучшенную проводимость и детекцию C₂H₂ и CO vs pristine графен. Указанные исследования показывают потенциал TiO₂ нанотрубок из нашего эксперимента для мониторинга состояния трансформаторов. Однако газоадсорбция и электрическая проводимость нанотрубок к газам нужно изучить дальше, особенно усиление после допинга переходными элементами (Mn).

Помимо изменения физических свойств поверхности, наноморфология влияет на биологическое поведение прикрепленных клеток. Клетки сначала адгезируют, затем мигрируют, пролиферируют, дифференцируются. По сравнению с плоской поверхностью, полая структура нанотрубок дает меньше сайтов адгезии. Для устойчивой адгезии и поддержания биомеханического баланса фокальный адгезионный комплекс начинает собираться и созревать, F-актин становится сильным и стабильным.

F-актин — линейный полимерный микрофиламент из G-актин мономеров, один из трех главных компонентов цитоскелета. Как механическая нагрузочная структура, считается вовлеченным в деление, миграцию, эндоцитоз, инвазию опухолевых клеток, но недавние работы показывают влияние на дифференцирование. Например, деполимеризация актина симвастатином индуцирует хондрогенное дифференцирование; деполимеризация усиливает адрогенное дифференцирование в человеческих стромальных стволовых клетках. Наши результаты: МСК на нанотрубках имеют более высокий уровень F-актина и более выраженную фиброзную структуру vs контроль. Jasp-усиленная полимеризация усиливает остеогенез; Cyto D-деполимеризация ингибирует — F-актин медиумирует нанотрубко-индуцированное остеобластическое дифференцирование МСК.

F-актин регулируется Rho GTPазами (семейство Ras). Rho индуцирует реорганизацию актина через эффекторы ROCK и Dia. ROCK активируется связыванием с Rho-GTP; субстрат ROCK — MLC (легкая цепь миозина) важна для сборки F-актина. ROCK ингибирует MLC фосфатазу → повышение фосфорилирования MLC → стимуляция АТФазы миозина II → сборка F-актина. ROCK также фосфорилирует LIMK → инактивация кофилина (в активном состоянии разбирает F-актин). Dia — член семейства формин-гомологии (FH) с двумя FH доменами, содержащими пролин-богатые мотивы, связывающие профилин (G-актин-связывающий белок) — способствует полимеризации и организации F-актина. Мы детектировали RhoA — его экспрессия согласована с уровнем F-актина. Но не можем четко описать, как нанотрубки регулируют RhoA, так как регуляторов много: интегриновый сигнализация, другие адгезионные рецепторы, GPCR, растворимые факторы (LPA), рецепторные тирозинкиназы и др.

Зная, что F-актин регулируется RhoA, изучали роль фокальной адгезии. Фокальные адгезионные комплексы (интегрины, талин, винкулин, паксиллин, FAK) формируются и созревают при адгезии клеток к нанотрубкам. Интегрины — трансмембранные гетеродимеры, связывающие ECM с другими фокальными адгезионными белками для адгезии. Они не просто «крючки», но передают клетке критические сигналы об окружении, которые с EGFR заставляют клетку принимать решения о биологическом поведении. Сигналы дальше идут к F-актину, прямо связанному с фокальными адгезионными комплексами. С одной стороны, наноморфология вызывает сборку и созревание фокальных адгезионных комплексов. С другой — киназы (FAK, Src) рекрутируют молекулы (CRK) для авторегуляции сборки/созревания. Наши результаты: формирование и созревание фокальных адгезионных комплексов нарушается при деполимеризации F-актина — существует обратная связь от фокальных адгезий к актиновой сборке, согласуется с литературой.

Нельзя игнорировать, что белки фокальных адгезий выполняют функцию сигнального трансляции. Нанотрубки могут напрямую регулировать геновую экспрессию через сигнальные каскады, а F-актин лишь участвует или влияется этим процессом. Например, дуальный киназный комплекс FAK/Src регулирует Rho GTPазы (RhoA) — нанотрубки могут регулировать RhoA через интегрины и FAK/Src. Src (нерецепторная тирозинкиназа) активирует Ras фосфорилируя FAK в тирозин-925. Ras активирует биохимические пути: MAPK и PI3K/AKT/mTOR. В MAPK: Ras → c-Raf → MAP2K → MAPK1/2 (ERK). ERK активирует транскрипционные факторы SRF и c-Myc (рост и дифференцирование). Runx2 — ключевой транскрипционный фактор остеогенного дифференцирования — также регулируется ERK. Наше предыдущее исследование: механическое напряжение стимулирует остеогенез BMSC через FAK-Erk1/2-Runx2. Нельзя исключить роль ERK в нанотрубко-индуцированном остеогенезе — нужны дальнейшие исследования.

Какая именно роль F-актина в индукции дифференцирования нанотрубками? Возможность: изменение сборки F-актина обратно регулирует уровень FAK → остеогенез через FAK-Erk1/2-Runx2, так как фокальные адгезии и актиновая полимеризация показывают одни тренды — действуют как единое целое в ответе на внеклеточную среду. Другие возможности: MKL1 и YAP/TAZ действуют ниже по течению актиновой динамики. Оба шаттлят между цитоплазмой и ядром, могут транслировать сигналы от цитоскелета к ядру.

MKL1 (миокардин-сродственный транскрипционный фактор А) чувствителен к изменениям уровня G-актина. При повышении цитоплазматического G-актина мономерный G-актин связывает MKL1, предотвращая связывание с SRF и трансактивацию. Гены-мишени SRF включают актины (гладкомышечный актин SMA) и другие актин-связывающие белки (immediate early genes: c-fos, egr1). Недавние работы: изменение активности SRF регулирует адрогенез через PPARγ и костообразование через IGF-1 и Runx2.

YAP и TAZ — транскрипционные коактиваторы в пути Hippo, важный регуляторный путь, ограничивающий пролиферацию, контролирующий размер органов и морфогенез. LATS1/2 фосфорилируют их, создавая сайт связывания 14-3-3 белков, предотвращающий ядерный импорт. Фосфорилированные YAP/TAZ удерживаются в цитоплазме, блокируя экспрессию генов (Ctgf, Areg). Показано: YAP/TAZ взаимодействуют с TBX5, RUNX2, p73 для регуляции генов. Адгезия клетки к матриксу вызывает ядерную локализацию YAP через ось интегрины/FAK/Src. В нашем исследовании результаты предполагают участие этого пути в нанотрубко-индуцированном дифференцировании. Нужны дальнейшие исследования нисходящих медиаторов интегрины/FAK/Src.

С другой стороны, все больше работ показывают взаимодействие F-актина с Hippo сигнализацией, ингибирующей фосфорилирование YAP — согласуется с нашими данными: продвижение полимеризации F-актина снижает экспрессию фосфо-YAP. Гипотеза: АТФ, участвующий в превращении G-актин ⇄ F-актин, может играть роль в фосфорилировании YAP — требует изучения.

Объяснение экспериментальных феноменов. Результаты: чем больше диаметр нанотрубок, тем сильнее остеогенная индукция. Согласуется с предыдущими работами. Причина: больший диаметр — меньше сайтов адгезии — большее собрание и созревание фокальных адгезионных комплексов. Вместе с этим стресс-фибры из F-актина получают большую силу и стабильность. Эти структуры усиливают сигнализацию, продвигающую остеогенез. Предсказуемо, эффект снижается при слишком большом диаметре, когда клеткам трудно адгерироваться. Аналогично, неравномерная высота нанотрубок меняет сайты адгезии и перестраивает цитоскелет, влияя на дифференцирование. Даже плоские поверхности без нанотрубок могут индуцировать изменения дифференцирования. Множество работ: формирование фокальных адгезий и организация стресс-фибер регулируются жесткостью подложки; YAP/TAZ играет важную роль. Очевидно, ось интегрины–ФА–F-актин участвует в трансляции физических сигналов в внутриклеточные химические.

Итог: F-актин регулирует остеобластическое дифференцирование МСК на TiO₂ нанотрубках через MKL1 и YAP/TAZ, чьи мишенные гены частично объясняют пролиферацию и дифференцирование МСК. Никакое изменение в сигнальной сети не изолировано — регулируется множеством молекул и белков. Один вид биологического поведения — результат регуляции серии сигнальных путей. Нанотрубки индуцируют дифференцирование, запуская сложную сеть: интегрины, белки фокальных адгезий, FAK, Src, Rho GTPаза, MAPK, Hippo и другие пути. Важно: в сети много обратных циклов — нисходящий сигнал может регулировать восходящий через обратную связь. Мы нашли, что винкулин и FAK могут регулироваться обратно сборкой F-актина, увеличивая неопределенность молекулярных функций. Детали молекулярного механизма ждут дальнейших исследований.

Заключение

Результаты: TiO₂ нанотрубки стимулируют остеогенное дифференцирование МСК, способность усиливается с ростом диаметра в диапазоне 30–70 В. F-актин медиумирует нанотрубко-индуцированное клеточное дифференцирование через MKL1 и YAP/TAZ, давая новый взгляд на изучение клеточного дифференцирования.