Наночастицы гидроксиапатита усиливают остеогенез мезенхимальных стволовых клеток через взаимодействие с эндотелиальными клетками

Аннотация

Нано-гидроксиапатит (нано-HA) привлек значительное внимание в регенеративной медицине. Взаимодействие эндотелиальных клеток (ЭК) и мезенхимальных стволовых клеток (МСК) необходимо для регенерации кости, но механизм участия нано-HA в этом процессе остается неизвестным. В данном исследовании изучались цитотоксичность и остеоиндуктивные эффекты наночастиц гидроксиапатита (HANPs) на МСК с использованием косвенной ко-культуры, медиатированной ЭК, и выявлялись базовые механизмы. Обнаружено, что при субцитотоксической дозе HANPs повышают жизнеспособность и экспрессию остеобластных генов, а также минерализованные нодулы и производство щелочной фосфатазы МСК. Эти феномены зависят от HIF-1α, секретируемого ЭК, который запускает каскад сигнального пути ERK1/2. Кроме того, разработана двухстадийная математическая модель клеточной линии для количественного анализа влияния HIF-1α на остеогенное дифференцирование МСК. Она показала, что HIF-1α оказывает дозозависимый стимулирующий эффект на скорость остеогенного дифференцирования МСК до 1500 пг/мл, что согласуется с экспериментальными данными. Наши данные указывают на то, что кооперативные взаимодействия между HANPs, ЭК и МСК, вероятно, стимулируют регенерацию кости. Кроме того, двухстадийная модель клеточной линии полезна как in vitro система для оценки потенциального влияния эффекторных молекул в инженерии костной ткани.

Введение

Реконструкция дефектов кости, вызванных травмами, врожденными аномалиями или хирургической ресекцией, представляет серьезную проблему для ортопедической хирургии. Гидроксиапатит (HA), представительный биоактивный керамический материал, использовался как костная замена. Однако нежелательные механические и остеоиндуктивные свойства ограничивают его клиническое применение. В последние годы нано-HA продемонстрировал более оптимальную биоактивность и улучшенные механические характеристики благодаря уникальным бионическим свойствам и завоевал значительный интерес в биомедицинских областях, связанных с регенеративной медициной. При имплантации нано-HA в дефекты кости множество клеток, участвующих в репарации кости, контактируют с ним. Следовательно, необходимо оценить биологическое поведение нано-HA. Несколько исследований напрямую показали, что наночастицы HA (HANPs) могут поглощаться человеческими мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из 젤ли Уортона пуповины (hWJ-MSCs), и остеобластами, что приводит к усилению остеогенного дифференцирования. Dua et al. сообщали о способности HANPs способствовать интеграции инжинирированного хряща в де novo хрящ; напротив, HANPs ингибируют ангиогенную способность эндотелиальных клеток пуповины (HUVECs). Для человеческого здоровья необходимо более полное понимание влияния HANPs на регенерацию кости, и текущие применения нано-базированных искусственных костей добавляют срочности таким исследованиям.

Регенерация кости неизбежно сопровождается инвазией неососудов. ЭК — внутреннее клеточное покрытие сосудистой системы, которые пассивно доставляют кровь, но также индуцируют, специфицируют и направляют регенерацию органов, поддерживают гомеостаз и метаболизм. МСК являются частью периэндотелиальной ниши и обладают способностью к самовоспроизводству и мультидифференцировке под индукцией специфических физиологических и биохимических микросред в своих резидентных нишах. Tsai et al. обнаружили, что ЭК могут секретировать эндотелин-1, направляя МСК к остео- и хондродифференцировке. Saleh et al. с помощью микроаррейного анализа выявили белки, секретируемые HUVECs, и связанные кросстолк сигнальные пути, взаимодействующие с мембранными рецепторами МСК для усиления пролиферации и остеогенного дифференцирования. В инженерии костной ткани HANPs могут контактировать с неососудами и эндоцитозироваться ЭК, что меняет их физиологическую функцию. Это также может влиять на окружающие остеопрогениторные клетки и влиять на репарацию кости, изменяя паракринную сигнализацию. Однако, хотя прямое влияние HANPs на МСК изучено, все еще неясно, могут ли HANPs косвенно индуцировать остеогенное дифференцирование МСК через ЭК, что необходимо для понимания эффекта HANPs в репарации кости.

В данном исследовании, чтобы получить более глубокое понимание биологических эффектов HANPs на взаимодействие ЭК и МСК, была установлена модель косвенной ко-культуры с использованием HUVECs и hWJ-MSCs. С помощью этой системы оценивались цитотоксичность и остеоиндуктивные эффекты HANPs на hWJ-MSCs через паракринную сигнализацию, медиатированную HUVECs. Для выявления ключевых факторов, влияющих на HANP-индуцированные взаимодействия ЭК-МСК, растворимые факторы в супернатанте от HUVECs, стимулированных HANPs, оценивались с акцентом на связанные механизмы на генетическом и белковом уровнях. Результаты показали, что гипоксия-индуцируемый фактор (HIF)-1α играет критическую роль в этих взаимодействиях.

Для количественного наблюдения и прогнозирования влияния HIF-1α на процесс остеогенеза была разработана математическая модель, объединяющая двухстадийную клеточную линию с HIF-1α. Анализируя экспериментальные данные, модель использовалась для предсказания числа МСК и степени дифференцирования в любой момент времени, основанной на заданной начальной плотности посева и концентрации HIF-1α, что может дать рекомендации по начальным условиям культивирования и времени инкубации. Результаты помогут прояснить взаимодействия между нано-базированными костными заменами и биологическими системами, способствуя разработке инновационных биоматериалов для регенеративной медицины.

Материалы и методы

Подготовка и характеристика частиц

HANPs размером 20 нм (np20), 20×80 нм (np80) и микрочастицы HA (m-HAP) с чистотой ≥99,0% приобретены у Nanjing Emperor Nano Material Company Ltd (Нанкин, Китай). Размер и форма частиц изучали TEM (FEI Tecnai G2 Spirit Bio-Twin) и SEM (LEO1530VP, Германия). Гидродинамический размер и дзета-потенциал определяли Zetasizer Nano ZS90 и Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, Великобритания).

Подготовка и культивирование клеток

Все протоколы одобрены Этический комитетом Нанкинского медицинского университета. HUVECs и hWJ-MSCs извлекали из свежих человеческих пуповин после получения письменного информированного согласия доноров. Пуповина и пуповинная вена промывали фосфатно-буферным солевым раствором (PBS) с 1% пенициллина и стрептомицина (PS). Затем пуповинную вену заполняли 0,1% коллагеназой I и инкубировали 15 мин при 37 °C. После сбора HUVECs культивировали в среде для ЭК (ECM) (Sciencell, США).

После удаления сосудов 젤ли Уортона резали на куски 1 мм² и размещали в флаконах 25 см². Клетки инкубировали в L-DMEM (GIBCO) с 10% фетальной говячьей сывороткой (GIBCO) и 1% PS.

Фенотип hWJ-MSCs подтверждали монохлональными антителами к CD13, CD29, CD34, CD44, CD45, CD51, CD105 (BD Biosciences). HUVECs оценивали фактором фон Вильбранда (vWF; Shanghai ChangDao Biotech). HUVECs пассажей 3–7 и hWJ-MSCs пассажей 3–5 использовали в экспериментах.

Суспензии частиц 1 мг/мл в PBS разводили в L-DMEM до конечной концентрации. Как показано на рис. 1, HUVECs инкубировали с указанной концентрацией HAPs 18 ч. Культурная среда центрифугировали 15000 об/мин при 4 °C 15 мин, супернатант с 10% ФСС использовали как обусловленную среду (CM) для hWJ-MSCs. CM состояла из остеогенной среды с остеогенным индукционным раствором (10 мМ β-глицерофосфат, 50 мкг/мл L-аскорбиновая кислота-2-фосфат, 0,1 мкМ дексаметазон). Дополнительно использовали 2-метоксиэстрадиол (2-MeOE2) как специфический ингибитор HIF-1α. В группе 2-MeOE2(+) hWJ-MSCs культивировали с CM от HUVECs, предварительно обработанных 5 мкМ 2-MeOE2 40 мин до добавления HAP. PD98059 использовали как специфический ингибитор MEK. В группе PD98059 hWJ-MSCs культивировали с CM, содержащим 5 мкМ PD98059.

Определение жизнеспособности и числа клеток

Жизнеспособность оценивали MTS-тестом (Bestbio, Beyotime Biotechnology). hWJ-MSCs прикрепляли 24 ч, затем культивировали с CM 24 и 72 ч. Абсорбцию формазана измеряли при 490 нм микроплатночным фотометром (SpectraMax M2). Абсорбцию также конвертировали в число клеток по калибровочным кривым при тех же условиях.

Количественный РТ-ПЦР в реальном времени

TRIzol (Invitrogen) использовали для изоляции общего РНК из hWJ-MSCs, инкубированных в CM. Комплементарная ДНК синтезировали из 1,0 мкг РНК набором PrimeScript First Strand cDNA Synthesis (TaKaRa) в термоциклере T3 (Mastercycler 5333, Eppendorf). Уровни экспрессии генов анализировали набором FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (Roche) на системе квантитативного ПЦР в реальном времени (7900HT Fast, Applied Biosystems). Относительная мРНК экспрессия нормализовывали к GAPDH методом 2^(-ΔΔCt). Праймеры в таблице 1.

Окраска Алицариновым красным S (ARS) и количественный анализ

hWJ-MSCs культивировали в 12-колбовых пластинках с остеогенной средой до 14 дней, затем внеклеточная минерализация наблюдалась ARS окраской (Leagene). Образцы фиксировали абсолютным этанолом 15 мин, окрашивали 1% (м/об) ARS (pH 4,2) при комнатной температуре 5 мин. Промывали дважды бидистиллированной водой и фотографировали. Для количественного анализа минерализации добавляли 300 мкл 10% (м/об) хлорида цетилпиридиниевого моногидрата (BOMEI), инкубировали 30 мин. 90 мкл из каждого образца переносили в 96-колбовую пластинку, абсорбцию измеряли при 405 нм в триplicates.

Окраска щелочной фосфатазой (ALP) и количественный анализ

После культивирования hWJ-MSCs в остеогенной среде до 14 дней проводили ALP окраску набором BCIP/NBT (Beyotime). Клетки фиксировали 4% параформальдегидом. Окрашивали смесью нитросинего тетразолия и 5-бромо-4-хлоро-3-индотил-фосфата 4 ч и фотографировали. Для количественного анализа синтеза ALP клетки лизировали в ледяном RIPA буфере (Beyotime) 30 мин. Лизаты центрифугировали 12000 об/мин при 4 °C 10 мин, супернатанты анализировали набором ALP Assay (Beyotime). Абсорбцию измеряли в триplicates при 405 нм и конвертировали в активность ALP по стандартной кривой.

Иммуноферментный анализ (ELISA)

HUVECs посеяли 2×10⁵ клеток/колба. CM собирали от HUVECs, культивированных с HAPs 18 ч (дополнительный файл 1), супернатант подвергали ELISA (рис. 1). Набор human HIF-1α ELISA (Anhui Joyee Biotechnics) использовали по инструкции производителя.

Иммунофлуоресценция

HUVECs посеяли на стеклах в 12-колбовых пластинках (7,6×10⁴ клеток/колба). После воздействия CM 18 ч клетки фиксировали 4% параформальдегидом, пермеабилизировали 0,1% Triton X-100 в PBS перед инкубацией с 1% анти-HIF-1α антителом [EPR16897] (ab179483, Abcam) overnight при 4 °C. Затем инкубировали с 1% CoraLite594-конъюгированным Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) (Proteintech) в темноте 1 ч. Ядра окрашивали DAPI (Beyotime) 30 с. Исследовали лазерным конфокальным микроскопом (Olympus). Интенсивность флуоресценции kvantифицировали ImageJ v.1.4.

Вестерн-блот анализ

hWJ-MSCs инкубировали в CM 24 ч (ERK1/2, p-ERK1/2) или в остеогенной среде 7 дней (RUNX-2, COL I). Клетки лизировали в RIPA буфере 30 мин. Лизаты центрифугировали, супернатанты хранили при −20 °C. После 12% SDS-PAGE белки переносили на ПВДФ мембрану. Первичные антитела: anti-p-ERK1/2, anti-ERK1/2, anti-RUNX-2, anti-COL I, GAPDH (1:1000, кроличьи поликлональные; Cell Signaling Technology). После удаления несвязанных антител инкубировали со вторичными антителами 1 ч. Сигнал детектировали хэмилюминесцентной системой (LAS4000M, GE Healthcare). Соотношение p-ERK/ERK и RUNX-2/COL I к GAPDH kvantифицировали ImageJ v.1.4.

Оценка апоптоза клеток

hWJ-MSCs посеяли плотностью 10⁵ клеток/колба в 6-колбовых пластинках. Прикрепленные клетки обрабатывали указанными концентрациями HIF-1α на указанное время. Клетки собирали, маркировали FITC-Annexin V и PI (Fcmacs) 15 мин в темноте. Анализировали потоковым цитометром FACScan (BD Bioscience). Данные обрабатывали FlowJo v10.

Двухстадийная модель клеточной линии

Учитывая огромный потенциал HAPs и сложность анализа ко-культуры, требовалась математическая модель для количественного анализа и надежного прогнозирования роли HIF-1α в остеогенном дифференцировании hWJ-MSCs.

hWJ-MSCs культивировали с 0, 300, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 пг/мл HIF-1α и остеогенным индукционным раствором. После подгонки данных при этих концентрациях использовали концентрации HIF-1α (производимого HUVECs) в контрольной группе, m-HAP, np80, np20 (240, 300, 325, 375 пг/мл) для проверки уравнений подгонки в MATLAB. Для упрощения модели считали их схожие паттерны роста при разных концентрациях HIF-1α идентичными. Среднюю степень дифференцирования использовали для подгонки уравнения степени дифференцирования-времени. Скорость пролиферации, апоптоза и остеогенной дифференцировки hWJ-MSCs в разных группах измеряли в определенные моменты времени.

Упрощенная двухстадийная модель клеточной линии, похожая на многостадийную [18, 19], была установлена на основе экспериментальных данных. C₀ и C₁ представляют число hWJ-MSCs и терминальных клеток. Они управляются системой уравнений:

dC₀/dt = [(K - C₀ - C₁)/K · p - (p - 1)] · v₀ · C₀
dC₁/dt = (2 - (K - C₀ - C₁)/K · p - p) · v₀ · C₀ - A · C₁

Здесь p, зависящий от HIF-1α и времени, представляет вероятность репликации hWJ-MSCs. Соответственно, d = 1 - p — скорость дифференцирования, получаемая подгонкой экспериментальных данных числа клеток. Параметр v₀ определяет скорость деления клеток на каждой стадии линии (v = ln2/c, где c — длительность клеточного цикла). Скорость апоптоза терминальных клеток обозначена A. Для простоты пренебрегали незначительным изменением A во времени, A = 4,5% — константа. K — емкость среды, так как клетки не могут пролиферировать неограниченно. HIF-1α увеличивает скорость дифференцирования hWJ-MSCs, моделируемую как:

d = d₀ / (1 + (r·H)ᵐ)
p = 1 - d

Здесь H — концентрация HIF-1α; d₀ — скорость дифференцирования при 0 пг/мл HIF-1α; r — интенсивность регуляции (интенсивность регуляции HIF-1α на МСК); m — коэффициент Хилла (отношение между скоростью дифференцирования МСК и концентрацией HIF-1α).

Статистический анализ

Все данные, удовлетворяющие нормальности и гомоскедастичности, представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD) из трех и более независимых экспериментов. SPSS 24.0 использовали для статистического анализа через однофакторный или двухфакторный ANOVA. P < 0,05 считалось статистически значимым. Графики строили в GraphPad Prism 5.

Результаты

Характеристика HAPs

Рис. 2: HAPs подготовлены с определенным размером и формой. Диаметры np20 (сферические) в среднем 20 нм, np80 (стержневидные) — длина 80 нм, ширина 20 нм. m-HAP — сферические, ~12 мкм. Все частицы имели отрицательный заряд в L-DMEM. Отрицательные значения дзета-потенциала благоприятствуют адгезии и пролиферации костных клеток, прямому сцеплению с костью и формированию новой кости. Частицы в L-DMEM склонны к агрегации в водных системах. Гидродинамический размер также тестировали как важный фактор, влияющий на биологическое поведение.

Косвенная токсичность HAPs по отношению к hWJ-MSCs

Для оценки косвенной токсичности HAPs на hWJ-MSCs жизнеспособность измеряли MTS-тестом. CM с 50 мкг/мл HANPs значимо стимулировала жизнеспособность hWJ-MSCs после 24 и 72 ч, особенно в 24 ч. Однако CM с 100 мкг/мл HANPs снизила жизнеспособность на 15–20% по сравнению с контролем после 72 ч. Более того, CM с 25 мкг/мл np20, но не np80, стимулировала жизнеспособность после 24 ч. Эти феномены подтвердили, что 50 мкг/мл HANPs — субцитотоксическая концентрация, использованная во всех последующих экспериментах (рис. 3).

Косвенный остеоиндуктивный эффект HAPs на hWJ-MSCs

Для выявления косвенных остеоиндуктивных эффектов HANPs на hWJ-MSCs экспрессию остеогенных генов оценивали количественным RT-PCR. Транскрипт RUNX-2 в группах HANPs, особенно np20, заметно увеличивался с 7 по 21 день (рис. 4a). Экспрессия гена Col I в группе np20 усиливалась с 7 по 21 день, в группе np80 — устойчивый рост с 7 по 14 день (рис. 4b). мРНК OCN четко урегулировалась в группах HANPs на 14 день, указывая на ускоренную остеогенез (рис. 4c). Уровни мРНК ALP очевидно увеличивались в группах HANPs (рис. 4d), указывая на остеогенное дифференцирование hWJ-MSCs. Группа m-HAP показывала ограниченные изменения по сравнению с контролем (рис. 4). Кроме того, экспрессия маркеров плюрипотентности NANOG, OCT3/4, SOX2 снижалась в группах HANPs по сравнению с контролем (рис. 4e–g), подразумевая, что hWJ-MSCs в группах HANPs дифференцировались, особенно в группе np20. Подобные результаты получены вестерн-блотом (рис. 5c, d), подтверждая, что группа np20 косвенно усиливает экспрессию RUNX-2 и COL I в hWJ-MSCs.

Для визуального наблюдения косвенного остеоиндуктивного эффекта клетки инкубировали в остеогенной среде 14 дней, затем проводили ARS и ALP окраску. Рис. 5a, b: увеличенное число минерализованных нодулов и более высокая активность ALP hWJ-MSCs наблюдались в группах HANPs по сравнению с m-HAP и контролем. m-HAP, как и контроль, демонстрировал ограниченный эффект на остеогенное дифференцирование.

HANPs активируют сигнальный путь ERK1/2 в hWJ-MSCs в косвенной ко-культуре с HUVECs

Для исследования влияния на паракринную функцию HUVECs иммунофлуоресценцией и ELISA определяли возможные белки, способствующие остеогенному дифференцированию hWJ-MSCs. Рис. 6a–c: внутриклеточная и внеклеточная продукция HIF-1α значимо усиливалась HANPs (особенно np20), в то время как m-HAP имел ограниченный эффект.

Для точного понимания пути дифференцировки hWJ-MSCs, активированного HIF-1α, изучали ключевые регуляторы пути ERK1/2 вестерн-блотом. Рис. 6d, e: уровни общего ERK1/2 оставались неизменными, p-ERK1/2 выраженно увеличивались в hWJ-MSCs, культивированных с HANPs, особенно в группе np20. m-HAP мало влиял на p-ERK1/2, как и на продукцию HIF-1α в HUVECs. Важно, что повышенные уровни p-ERK1/2 в hWJ-MSCs, активированные HIF-1α, блокировались 2-MeOE2, специфическим ингибитором HIF-1α, указывая, что HIF-1α функционирует восходяще по отношению к пути ERK1/2 в hWJ-MSCs.

HIF-1α способствует остеогенному дифференцированию hWJ-MSCs через путь ERK1/2

Для определения необходимости HIF-1α для наблюдаемой стимуляции остеогенного дифференцирования hWJ-MSCs применяли специфический ингибитор HIF-1α (2-MeOE2). Рис. 7: минерализованная матрица и активность ALP в группе 2-MeOE2(+) ослаблялись, указывая, что HIF-1α незаменим для остеогенного дифференцирования hWJ-MSCs. Далее исследовали роль пути ERK1/2 в остеогенном дифференцировании, активированном HIF-1α. Минерализация и активность ALP в hWJ-MSCs подавлялись при введении PD98059, специфического ингибитора MEK.

Двухстадийные модели клеточной линии

Для количественного раскрытия внутренней связи между концентрацией HIF и остеогенным дифференцированием hWJ-MSCs использовали 0–4000 пг/мл HIF-1α для обработки восьми групп hWJ-MSCs. Двухстадийная математическая модель анализировала скорости пролиферации, апоптоза и остеогенного дифференцирования hWJ-MSCs при разных концентрациях HIF-1α. Рис. 8a: подгоночные данные дали симулированную формулу (d/d₀ = 1/(0,14H² - 0,43H + 1)) и кривую (синяя), показывающая, что скорость дифференцирования сначала возрастает, затем убывает с ростом концентрации HIF. Пик достигается при 1500 пг/мл HIF-1α.

Согласно исследованию, концентрации HIF-1α, производимого HUVECs в контрольной, m-HAP, np80, np20 группах, составляли 240, 300, 325, 375 пг/мл. Черные квадраты представляют скорость дифференцирования, стимулированную этими концентрациями, и хорошо совпадают с симулированной кривой. Кроме того, степени дифференцирования hWJ-MSCs (относительная активность ALP) при разных концентрациях HIF-1α аналогично возрастали во времени. Поэтому для упрощения модели считали их паттерны роста похожими или идентичными. Обнаружили, что увеличение активности ALP с 0 по 7 день пропорционально числу остеобластов, а число остеобластов достигает плато. После подгонки активности ALP с кривой относительного числа остеобластов (число остеобластов / максимум) предсказывали максимум активности ALP и получали относительную активность ALP (активность ALP / максимум), представляющую степень дифференцирования (рис. 8b). Комбинируя эти исследования, получали трехмерную поверхность степени дифференцирования, эволюционирующей во времени и концентрации HIF-1α (рис. 8c).

Для оценки оптимального времени культуры необходимо было смоделировать числа клеток. После выяснения скорости дифференцирования при разных концентрациях HIF-1α смоделировали размеры каждой популяции. Симуляция использовала начальную плотность посева 1500 клеток/колба (96-колбовая пластинка) при разных концентрациях HIF-1α. Рис. 8d–f: экспериментальные данные (черные квадраты) хорошо совпадают с симулированными общими числами клеток (синие кривые), суммой чисел hWJ-MSCs и остеобластов, подтверждая способность модели предсказывать числа hWJ-MSCs и остеобластов в любой момент. Более того, число остеобластов достигало плато на 21, 18 и 15 дней при 0, 375 и 1500 пг/мл HIF-1α соответственно. Модель дает оптимальное время культуры для направления инженерии тканей и прямое доказательство того, что HIF-1α ускоряет остеогенное дифференцирование hWJ-MSCs.

Обсуждение

С недавними достижениями в нанобиоматериалах нано-базированные искусственные костные замены стали объектом интенсивного изучения. Накапливающиеся данные свидетельствуют о сложных взаимодействиях между клетками и нанобиоматериалами из-за их способности проникать через клеточные мембраны и увеличивать время внутриклеточного удержания. Предыдущее исследование показало, что коллаген/альгинат нано-пленки адсорбируются на мембрану МСК, активируя внутриклеточные сигнальные каскады и способствуя остеогенному дифференцированию. Wu et al. продемонстрировали, что TiO₂ нанотрубки улучшают васкуляризацию и остеогенез, облегчая паракринные эффекты и клеточные контакты через взаимодействия ЭК-МСК. Для разработки отличных кандидатов для инженерии костной ткани необходимо прояснить прямой кросстолк между нано-базированными костными заменами и клетками, вовлеченными в репарацию кости, а также их косвенные взаимодействия. Однако наше понимание все еще ограничено. В настоящем исследовании использовали модель косвенной ко-культуры для дальнейшего элucidения биологических эффектов HANPs на МСК в отношении косвенных взаимодействий, медиатированных ЭК.

Цитотоксичность — первичная проблема оценки биосовместимости нанобиоматериала. Хотя наше предыдущее исследование показало, что HANPs не напрямую влияют на жизнеспособность или апоптоз hWJ-MSCs, они могут оказывать разное влияние через медиацию других клеток. Таким образом, необходимо было оценить цитотоксические эффекты HANPs на hWJ-MSCs, медиатированные HUVECs. Интересно, что после инкубации в CM 24 и 72 ч жизнеспособность hWJ-MSCs сохранялась и даже повышалась в группах 0–50 мкг/мл HANPs, особенно np20, указывая на наличие эффекторных молекул в CM. При концентрации HANPs 100 мкг/мл они становились цитотоксичными для hWJ-MSCs. Однако 0–100 мкг/мл m-HAP не влияли на жизнеспособность (рис. 3). Jiang et al. показывали, что инженирированные наночастицы определенного размера могут иметь отличные эндоцитические пути и кинетику, связанные с измененными нисходящими сигнальными путями, регулирующими функции мишеневых клеток. В нашем предыдущем исследовании показали, что np20 и np80 эндоцитозируются HUVECs, за чем следуют морфологические изменения и появление больших вакуол, указывающие на активированное состояние HUVECs. Кроме того, np20 с более высокой скоростью поглощения и накоплением могут приводить к более сильной активации HUVECs, возможно, увеличивая жизнеспособность hWJ-MSCs через паракринную сигнализацию. Напротив, мало m-HAP эндоцитозируется HUVECs, что может объяснять их ограниченное влияние на метаболизм hWJ-MSCs.

Для дальнейшего изучения потенциального остеоиндуктивного эффекта активированных HUVECs использовали субцитотоксическую дозу 50 мкг/мл HAPs в последующих исследованиях. CM от активированных HUVECs способствовал внеклеточной кальциевой депозиции, активности ALP, экспрессии остеогенных белков в hWJ-MSCs, а также мРНК экспрессии остеогенных генов (рис. 4, 5). Runx2, ключевой транскрипционный фактор, специфицирующий остеобластную линию, показывал существенное усиление в группе np20, указывая на сильный остеоиндуктивный эффект (рис. 4a, 5c, d). Группа np20 демонстрировала 1,5-кратное улучшение экспрессии COLI на 7 день и двукратное на 14 день, подразумевая наличие дополнительных дифференцированных остеобластов в группах HANPs (рис. 4b). OCN — маркер зрелой стадии кости, показал значительный рост в группах HANPs на 14 день, указывая, что np20 и np80 ускоряют костную матурацию по сравнению с m-HAP (рис. 4c). ALP — ранний маркер остеобластного дифференцирования, очевидно увеличивался во времени в каждой группе, особенно np20, раскрывая дополнительную трансформацию МСК в остеобласты (рис. 4d). Маркеры плюрипотентности NANOG, OCT3/4, SOX2 подразумевают способность к дифференцировке. Снижение их экспрессии в группах HANPs означало, что большинство hWJ-MSCs в группах HAP трансформировались в остеобласты (рис. 4e–g).

Наши данные показали, что эндоцитоз HANPs HUVECs ассоциирован с улучшением остеогенного дифференцирования hWJ-MSCs. Однако причина этого результата неясна. В контексте паракринной функции HUVECs мы фокусировались на растворимых белках, индуцирующих дифференцировку, в супернатанте активированных HUVECs. Сигнальный путь HIF-1α важен для связи оссификации и ангиогенеза при регенерации кости. Heikal et al. сообщали, что поврежденные ЭК секретируют больше HIF-1α даже при нормоксии. Также показано, что воздействие HANPs ингибирует ангиогенную способность HUVECs. Мы измерили концентрации HIF-1α в CM, результаты показали увеличение HIF-1α в группах HANPs по сравнению с m-HAP и контролем (рис. 6a). Для выявления роли HIF-1α в остеогенном дифференцировании hWJ-MSCs использовали 2-MeOE2, специфический ингибитор HIF-1α. Снижение концентрации HIF-1α параллельно нарушало минерализованную матрицу и активность ALP в hWJ-MSCs, указывая, что HANPs способствуют продукции HIF-1α HUVECs для фасилитации остеогенеза hWJ-MSCs (рис. 7).

Для правильного применения HANPs в инженерии костной ткани необходимо глубже понять механизмы, которыми HANPs способствуют остеогенному дифференцированию hWJ-MSCs через HUVECs. Путь ERK1/2 находится нисходяще от HIF-1α и фундаментален для дифференцировки МСК. В этой работе концентрации HIF-1α в CM хорошо коррелировали с уровнями p-ERK1/2 в hWJ-MSCs (рис. 6b, c). При применении 2-MeOE2 экспрессия p-ERK1/2 в hWJ-MSCs не активировалась, подтверждая, что HIF-1α функционирует восходяще от ERK1/2. Для прямого адресирования роли ERK1/2 в остеогенном дифференцировании использовали PD98059, специфический ингибитор MEK. Подавление ERK1/2 привело к наименьшему остеогенному дифференцированию hWJ-MSCs. Возможная причина: ERK1/2 играет ключевую роль в сигнализации HIF-1α и в путях апоптоза и пролиферации, что может отвечать за наблюдаемые изменения. Также это может быть связано с фактором роста эндотелия (VEGF). VEGF — нисходящий эффектор сигнализации HIF-1α, и может способствовать остеогенному дифференцированию МСК через активацию ERK1/2. Наше предыдущее исследование показало, что np20 индуцирует продукцию VEGF в HUVECs; поэтому подавление ERK1/2 может ингибировать VEGF, ведущее к снижению остеогенного дифференцирования. Согласно экспериментальным результатам: HANPs способны более оптимально обеспечивать прямые и косвенные остеоиндуктивные эффекты, чем m-HAPs. По сравнению с аутоными и аллографтами кости, HANPs имеют обширный источник без вторичного ущерба и потенциальной иммуногенности. Однако по сравнению с m-HAPs, HANPs могут подавлять ангиогенную способность HUVECs и проявлять легкую цитотоксичность в время- и дозозависимом режиме.

Недавно нарастают доказательства важности HIF-1α в регенерации кости. Однако мало исследований смогли количественно предсказать скорость дифференцировки МСК при конкретных начальных условиях, таких как концентрация HIF-1α. Учитывая пролиферацию, апоптоз и остеогенное дифференцирование, мы представляем математическую модель, объединяющую двухстадийную клеточную линию с HIF-1α, высоко коррелирующую с экспериментальными данными. Подгоняя скорость дифференцировки hWJ-MSCs при 0–4000 пг/мл HIF-1α, получили уравнения для описания скорости дифференцировки, концентрации HIF-1α и времени. Как показано на рис. 8d, модель изображает карту числа клеток при разных концентрациях HIF-1α, позволяя исследовать внутреннюю динамику двухстадийной системы. Кроме того, модель математически валидирует эффект HIF-1α на остеогенное дифференцирование hWJ-MSCs. Более того, основанная на многостадийной модели клеточной линии и логистической модели, наша модель достаточно стабильна для долгосрочных прогнозов без ловушки неограниченного взрыва популяции.

Используя существующие экспериментальные данные, можно предсказать как число клеток, так и скорость дифференцировки при заданной начальной плотности посева и концентрации HIF-1α. Таким образом, получают оптимальное время инкубации. Следовательно, можно предсказать оптимальную концентрацию HIF-1α и определить наиболее оптимальное время для остеогенеза, что важно для эффективной инженерии тканей. Двухстадийная модель клеточной линии применима для предсказания пролиферации и дифференцировки стволовых клеток с двумя клеточными линиями. На этой основе модель, основанная на начальных условиях и экспериментальных данных, может быть установлена для идентификации оптимальных условий культуры in vitro, что поможет оптимизировать репарацию кости in vivo.

Заключение

В данном исследовании изучались специфические биологические эффекты HANPs на hWJ-MSCs, медиатированные HUVECs. По сравнению с m-HAPs, как np20, так и np80 показывали легкую цитотоксичность в время- и дозозависимом режиме. Важно, что размер HANPs не оказывал значимого влияния на эту цитотоксичность. Наши данные также показали, что HANPs, особенно np20, способны стимулировать HUVECs к секреции повышенных уровней HIF-1α, что прямо коррелировало с усиленным остеогенным дифференцированием hWJ-MSCs через активацию пути ERK1/2 (рис. 9). Более того, результаты двухстадийной модели клеточной линии указали, что HIF-1α оказывает дозозависимый стимулирующий эффект на скорость остеогенного дифференцирования hWJ-MSCs. Дополнительно, оптимальная концентрация HIF-1α и время инкубации были оценены на основе начальных условий с использованием in vitro модели, что может быть бесценно в будущем для приложений в инженерии тканей. Совокупно эти наблюдения дают доказательства того, что HANPs могут улучшить регенерацию кости путем модуляции клеточно-клеточных взаимодействий.