Влияние 15-нм золотых наночастиц на пролиферацию, апоптоз и формирование сфероидов в клетках колиточного карциномы HT29 и эмбриональных почечных клетках SPEV

Аннотация

Клеточно-культурные модели предоставляют надежную платформу для оценки потенциальной токсичности наноматериалов и разбора их механистического воздействия на биологию рака. Здесь мы оцениваем, как 15-нм цитрат-стабилизированные золотые наночастицы (AuNP) влияют на две эпителиальные клеточные линии различного происхождения: непрерывная пориная эмбриональная почечная линия SPEV и человеческая колиточная карцинома HT29. Экспозиция концентрациями AuNP от 1 до 12 мкг/мл позволила мониторить клеточную адгезию, пролиферацию, апоптоз/некроз и способность формировать многоклеточные сфероиды. Мы обнаружили, что 6–12 мкг/мл AuNP значительно снизили клеточную пролиферацию и увеличили ранние и поздние апоптотические/некротические популяции в обеих линиях. Наоборот, низкие дозы AuNP (1–3 мкг/мл) стимулировали формирование сфероидов, тогда как более высокие дозы оказывали цитотоксические и антикохезивные эффекты в суспензионной культуре. Эти результаты подчеркивают доза-зависимую двойную роль AuNP и поддерживают их дальнейшее изучение как таргетированной антираковой стратегии.

Введение

Золотые наночастицы (AuNP) ценятся за свою биосовместимость, оптические свойства и растущий терапевтический потенциал по спектру malignances, включая рак груди, печени, желудка, кишечника и легких [5–6]. Уникальные физико-химические черты AuNP — размер, форма, поверхностный заряд и концентрация — управляют их клеточным поглощением, распределением и биологическими эффектами [12–14]. Хотя многие исследования фокусируются на антираковой эффективности AuNP, комплексный токсикологический профилирование в клинически релевантных моделях остается необходимым для безопасной трансляции.

Таргетированная доставка AuNP в опухолевую ткань остается вызовом; дифференциальные скорости поглощения сообщались среди эпителиальных клеток различных происхождений [15–16]. Вариации в мембранном составе, гликопротеиновой экспрессии и эндоцитической способности, вероятно, лежат в основе этих различий, подчеркивая необходимость сравнительных исследований в нормальных и злокачественных эпителиальных линиях [17].

Клеточно-культурные анализы предлагают контролируемую среду для разбора клеточных ответов на AuNP, информируя как оценки безопасности, так и терапевтическую оптимизацию. В этом исследовании мы сравнили эффекты AuNP на нормальную эмбриональную почечную линию (SPEV) и колиточную карциному (HT29), используя адгезию, пролиферацию, апоптоз/некроз и формирование сфероидов как исходы.

Методы

Культура SPEV клеток

SPEV клетки поддерживали в DMEM (Sigma, США) с 5% FCS (HyClone, США), пенициллин/стрептомицин (PAA, Австрия) и амхотерицин B (5 мкг/мл). Клетки посевали при 0,5–2 × 10⁴ клеток/см² и культивировали в 5% CO₂ при 95% влажности. Среду обновляли каждые 48 ч, и пассажировку проводили при достижении конфлюенции, сохраняя монослойную морфологию через пассажи.

Культура HT29 клеток

HT29 клетки выращивали в RPMI-1640 (Sigma, США) с 10% FCS, 2 мМ L-глутамина и 40 мг/мл гентамицина (Sigma, США). Рабочая плотность была 0,5–4 × 10⁴ клеток/см². Клетки получены из Банка клеточных линий RE Кавецького института экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии, НАН Украины.

Манипуляции с AuNP

AuNP синтезировали цитратным методом редукции [22] и поставляли Институтом биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, РАН. Частицы в среднем 15 нм в диаметре, с запасной концентрацией 57 мкг/мл. Темновыдное электронное микроскопирование и экстинкционные спектры подтвердили распределение размера (Рис. 1). Клетки обрабатывали 1, 3, 6 или 12 мкг/мл AuNP на 24–48 ч; необработанные культуры служили контролями.

Адгезионные и пролиферативные анализы

Адгезия квантифицировалась подсчетом расплюснутых клеток через 30, 60, 120, 180 и 1440 мин после посева, используя инвертированный микроскоп. Пролиферация за 1–4 дня оценивалась трипсином-EDTA отachement и подсчетом в камере Горяева. Данные выражались как среднее ± SE.

Оценка апоптоза/некроза

После 4 дней экспозиции AuNP клетки окрашивали Annexin-V и 7-AAD и анализировали потоковой цитометрией (FACS Calibur, BD). Результаты обрабатывали WinMDI v2.8.

Формирование многоклеточных сфероидов

Для генерации сфероидов 5 × 10⁴ клеток/см² посевали в 24-колодчатые пластинки, покрытые 1% агаром, и культивировали в 0,24% карбоксиметилцеллюлозе (CMC) с 80 об/мин вращением. Сфероиды позволяли формироваться 24 ч, затем поддерживали дополнительные 48 ч в присутствии AuNP. Размер и количество сфероидов измеряли темновыдной микроскопией и анализировали Axio Vision 4.7, вычисляя объем через V = 0,4 × a × b² (a, b = диаметры). Агрегаты группировали по объему (1 × 10⁻⁴–1 × 10⁻² мм³) для определения медианных объемов и счетов.

Статистический анализ

Данные анализировали однофакторным ANOVA и Стьюдента t-тестом (Statistica 8). Значимость устанавливали при p ≤ 0,05, представленная как среднее ± SE.

Результаты

Адгезия SPEV и HT29 клеток

Рисунок 2 иллюстрирует влияние AuNP на адгезию SPEV. Через 1 ч 1, 3 и 6 мкг/мл AuNP снизили количество прикрепленных клеток относительно контроля, с 12 мкг/мл вызывая 1,8-кратное снижение, сохранявшееся 24 ч. HT29 клетки показали похожий тренд: низкие концентрации имели незначительные эффекты, тогда как 6 и 12 мкг/мл снизили адгезию на 1,16- и 1,28-кратно соответственно (Рис. 3).

Пролиферация SPEV и HT29 клеток

Рисунок 4 показывает, что 1–6 мкг/мл AuNP не меняли пролиферацию SPEV в течение дней 2–4, тогда как 12 мкг/мл снизило количество клеток до 1,5-кратно (Рис. 4). Пролиферация HT29 оставалась неизменной до 3 дня; на 4-й день 6 и 12 мкг/мл снизили счет клеток на 1,33- и 1,44-кратно соответственно (Рис. 5).

Индукция апоптоза/некроза

Низкие дозы AuNP (1–3 мкг/мл) не значительно меняли профили Annexin-V/7-AAD в любой линии (Таблицы 1–2). При 6–12 мкг/мл обе SPEV и HT29 показали увеличенные ранние и поздние апоптотические/некротические популяции. Для SPEV 12 мкг/мл поднял Annexin-V⁺/7-AAD⁺ клетки на 7,8% (p ≤ 0,05); для HT29 6 мкг/мл и 12 мкг/мл увеличили эту фракцию на 3,2% и 4,8% соответственно.

Формирование сфероидов

Рисунки 6 и 7 изображают, как AuNP модулируют количество и объем сфероидов. Контрольные HT29 сфероиды в среднем 5,19 × 10⁻³ мм³, тогда как SPEV сфероиды в среднем 0,79 × 10⁻⁵ мм³. 1–3 мкг/мл AuNP усилили объем SPEV сфероидов на 9,7- и 7,4-кратно, и HT29 объем на 1,4- и 1,2-кратно. Увеличение концентрации AuNP до 12 мкг/мл снизило объем сфероидов в обеих линиях (HT29: 7,18 → 4,24 × 10⁻³ мм³; SPEV: 7,69 → 4,58 × 10⁻⁵ мм³) в то время как увеличило количество HT29 сфероидов с 3 до 10 на поле зрения и уменьшило SPEV сфероиды с 32 до 19.

Обсуждение

Наши данные подтверждают доза-зависимый цитотоксический профиль 15-нм AuNP в обеих SPEV и HT29 клетках. Концентрации 6–12 мкг/мл ингибировали пролиферацию, усиливали апоптоз/некроз и разрушали клеточную коhezю в суспензии, как подтверждается измененным размером и количеством сфероидов. Повышенная чувствительность HT29 (6 мкг/мл) относительно SPEV (12 мкг/мл) согласуется с предыдущими отчетами о дифференциальном поглощении и цитоскелетном разрушении AuNP [27–30].

Механистически, AuNP могут вмешиваться в фокальные адгезионные комплексы, модулировать актиновую динамику и триггерить митохондриальный оксидативный стресс — пути, кульминирующие в аресте клеточного цикла и программируемой клеточной смерти [31–34]. Наблюдаемый антикохезивный эффект при более высоких дозах, вероятно, отражает разрушение клеточно-клеточных контактов, приводящий к увеличенной фрагментации сфероидов.

Хотя in vitro находки перспективны, in vivo валидация необходима для подтверждения терапевтической эффективности и безопасности. Тем не менее, наше исследование обеспечивает строгий бенчмарк для дизайна AuNP-базированных антираковых стратегий, эксплуатирующих их двойную способность ингибировать опухолевой рост и модулировать клеточные микросреды.

Заключение

15-нм AuNP демонстрируют четкие, концентрационно-зависимые эффекты на нормально-подобных SPEV и злокачественных HT29 клетках: сниженную пролиферацию, увеличенный апоптоз/некроз и измененную динамику сфероидов. Низкие дозы (1–3 мкг/мл) способствуют формированию сфероидов, тогда как более высокие дозы (6–12 мкг/мл) оказывают цитотоксические и антикохезивные действия. Эти находки поддерживают дальнейшее исследование AuNP как таргетированной антираковой модальности, с вниманием к оптимизации дозы для максимальной терапевтической выгоды и минимальной офф-таргет токсичности.