Синтез и эффективность in vitro покрытых полипирролом железо-платиновых наночастиц для фототермической терапии и фотоакустической визуализации

Фон

За последнее десятилетие для лечения рака было внедрено много новых терапевтических стратегий. В них фототермическая терапия (ФТТ) привлекла значительное внимание из-за ее преимуществ, включая высокую специфичность, точную пространственно-временную избирательность и ограниченные побочные эффекты [1, 2]. PTT использует фотопоглотители ближней инфракрасной области (NIR) для генерации тепла для термической абляции раковых клеток при облучении лазером NIR [2]. Используя преимущество использования лазерного излучения с той же длиной волны, фотоабсорберы NIR можно использовать для фототермической терапии рака под контролем фотоакустической визуализации (PAI) [3, 4].

Недавно железо-платиновые наночастицы (НЧ FePt) стали эффективными агентами для двойной модальности КТ / МРТ [5]. НЧ FePt демонстрируют более высокую фототермическую эффективность, чем наночастицы золота в ближней инфракрасной области [6]. Недавно также был продемонстрирован более сильный фотоакустический сигнал, генерируемый при использовании НЧ FePt, по сравнению с наночастицами золота [7]. Модификация поверхности полимером - это хорошо известный метод повышения биосовместимости и эффективности наночастиц при лечении рака. Несмотря на их многообещающие свойства, было предпринято несколько исследований по модификации поверхности НЧ FePt для биомедицинского применения [8, 9].

Высокая эффективность преобразования света в тепло наноразмерных агентов является наиболее важным фактором для PTT [10]. Таким образом, выбранный материал для модификации поверхности НЧ FePt не должен оказывать отрицательного влияния на преобразование света в тепло ядра НЧ FePt. Полипиррол (PPy), который имеет сильное возбуждение в ближней ИК-области, получил большое значение в биомедицинских приложениях благодаря своим превосходным свойствам, включая фототермическую стабильность, низкую стоимость и биосовместимость [11, 12]. В недавних исследованиях сообщалось, что PPy является высокоэффективным средством для лечения рака при ЧТВ [11, 13] и PAI в глубоких тканях [12]. В настоящей работе мы разработали НЧ FePt с покрытием из полипропилена (НЧ FePt @ PPy) в качестве новых агентов для сочетания PTT и PAI. Мы ожидаем, что при использовании полимера PPy для покрытия НЧ FePt улучшится фототермический эффект и биосовместимость НЧ FePt.

Полученные наночастицы показали отличную биосовместимость, фототермическую стабильность и сильный фототермический эффект. Исследование МТТ-анализа показало, что НЧ FePt @ PPy проявляют эффективную терапию рака. Кроме того, фантомный тест PAI в сочетании с НЧ FePt @ PPy показал сильный фотоакустический (PA) сигнал, который очень многообещает для дальнейшего применения PAI.

Методы

Материал

Ацетилацетонат платины (Pt (acac) ₂ , 97%) был приобретен у Acros Organics и использован в том виде, в каком он был получен. Пентакарбонил железа (Fe (CO) ₅ , 99%), гексадекан-1,2-диол (90%), олеиламин (80–90%), олеиновая кислота (70%), диоктиловый эфир (90%), 1-октадецен (90%), 3- меркаптопропионовая кислота (3-MPA, 97%), пиррол (Py, х.ч., 98%), поливиниловый спирт (PVA, Mw:9000–10 000), персульфат аммония ((NH ₄ ) ₂ S ₂ О ₈ 98%), додецилсульфат натрия (SDS), ферроцианид калия, соляная кислота и 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ) были приобретены у Sigma-Aldrich и использованы как получено в ходе экспериментов. Реагенты для окрашивания клеток, включая трипановый синий, йодид пропидия (PI) и Hoechst 33342, также были приобретены у Sigma-Aldrich. Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), фетальная бычья сыворотка (FBS), пенициллин, стрептомицин, 1 × трипсин и фосфатно-солевой буфер (PBS) были приобретены у HyClone (Южный Логан, Юта, США). Во всех экспериментах использовалась дистиллированная вода (ДИ).

Синтез наночастиц FePt @ PPy

Синтез наночастиц FePt @ PPy проводился в три этапа, которые описаны на схеме 1.

Схематическое изображение синтеза НЧ FePt @ PPy

Шаг 1. Синтез гидрофобных НЧ FePt

Синтез гидрофобных НЧ FePt проводили по изложенной схеме [5]. Короче говоря, 97 мг Pt (acac) ₂ , 4 мл диоктилового эфира, 66 мкл Fe (CO) ₅ 195 мг 1,2-гексадекандиола, 100 мкл олеиламина и 100 мкл олеиновой кислоты загружали в трехгорлую круглодонную колбу на 50 мл. Реакционную смесь нагревали до 240 ° C со скоростью нагрева 15 ° C / мин в атмосфере газообразного аргона. Через 30 мин продукт охлаждали до комнатной температуры. НЧ FePt собирали центрифугированием (15000 об / мин, 30 мин) и несколько раз промывали гексаном. Конечный раствор наночастиц хранили в гексане.

Шаг 2. Обмен лигандами

Лиганды на поверхности гидрофобных НЧ FePt были заменены 3-меркаптопропионовой кислотой (3-MPA), как сообщалось в статьях [14]. Кроме того, 1 мл 3-MPA и 1 мл циклогексанона загружали в центрифужную пробирку, а затем 0,5 мл гидрофобных НЧ FePt, диспергированных в гексане (~ 10 мг), добавляли к вышеуказанному раствору и встряхивали с помощью вортекса. Через 30 мин начали осаждаться НЧ FePt, и все наночастицы выпали через 1 час. Гидрофильные НЧ FePt собирали центрифугированием (3500 об / мин, 5 мин). Продукт промывали циклогексаноном, этанолом и ацетоном соответственно. Наконец, гидрофильные НЧ FePt разбавили DI с добавлением NaOH.

Шаг 3. Покрытие гидрофильных НЧ FePt полипропиленом

Пять миллиграммов гидрофильных НЧ FePt растворяли в 200-мл баркере, содержащем 60 мл ДИ, и непрерывно обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин. Затем к вышеуказанному раствору добавляли 6 мл 40-мМ SDS. Затем к вышеуказанному раствору добавляли 1 г ПВС, полностью растворенного в горячей воде. Полученную смесь затем перемешивали при 500 об / мин. Затем 10 мл 6-мМ (NH ₄ ) ₂ S ₂ О ₈ добавляли к перемешиваемому раствору. После 1 ч уравновешивания к вышеуказанному раствору добавляли 6 мл 100-мМ Py. Через несколько минут раствор постепенно стал черным. После 2 ч полимеризации полученные наночастицы отделили центрифугированием (12000 об / мин, 30 мин) и несколько раз промыли горячей водой для удаления примесей. Полученные НЧ FePt @ PPy ресуспендировали в PBS обработкой ультразвуком в течение 3 мин.

Характеристика

Морфологию наночастиц наблюдали с помощью автоэмиссионной просвечивающей электронной микроскопии (FETEM; JEM-2100F, JEOL, Япония). Атомный состав анализировали методом энергодисперсионной спектроскопии (EDS). Химические функциональные группы наночастиц анализировали с использованием спектрометра инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) (спектрофотометр Perkin Elmer 1320 FTIR). Диаметр наночастиц определяли методом динамического светорассеяния с использованием спектрофотометра электрофоретического светорассеяния (ELS-8000, OTSUKA Electronics Co. Ltd., Япония). Спектры UV-Vis-NIR измеряли с помощью спектроскопии UV-Vis-NIR (спектрофотометр Thermo Biomate 5). Лазерное облучение производилось с помощью перестраиваемого лазера с длиной волны 808 нм (непрерывная волна, максимальная мощность =5 Вт, Hi-TechOptoelectronics Co., Пекин, Китай).

Фототермический тест

Для измерения фототермических характеристик свежеприготовленных НЧ суспензия (1 мл), содержащая НЧ FePt @ PPy с определенными концентрациями (20, 30, 50, 70, 100 и 120 мкг / мл), была добавлена ​​в 12-луночный планшет. тарелка. Затем каждую лунку экспонировали лазером с длиной волны 808 нм при плотности мощности 1 Вт / см ² . на 5 мин. Кроме того, было зарегистрировано повышение температуры облученных НЧ FePt @ PPy при различных плотностях мощности лазера с длиной волны 808 нм. Вкратце, раствор 50 мкг / мл НЧ FePt @ PPy облучали NIR-лазером с желаемой плотностью мощности 0,5, 1 и 1,5 Вт / см ² . на 6 мин. Температуру регистрировали термометром (MASTECH, Калифорния, США) с помощью термоволокна.

Тест фотостабильности

НЧ FePt @ PPy с концентрацией 50 мкг / мл подвергали воздействию лазера с длиной волны 808 нм при плотности мощности 1 Вт / см ² . до достижения максимальной температуры, а затем давали возможность вернуться к комнатной температуре, выключив лазер. Циклы нагрева и охлаждения повторяли шесть раз. Спектр УФ-видимого излучения облученного образца был записан для сравнения с облученным образцом.

Тест длительного хранения

Водную суспензию НЧ FePt @ PPy при концентрации 120 мкг / мл хранили при 4 ° C в течение 30 дней для оценки ее стабильности при длительном хранении. Для сравнения наблюдали спектры поглощения в УФ-видимой области и размер частиц НЧ FePt @ PPy для 1-го и последнего дня. Кроме того, НЧ FePt @ PPy на различных средах, включая DI, среду DMEM плюс FBS и PBS, хранили при 4 ° C в течение 30 дней для оценки стабильности полученных НЧ FePt @ PPy.

Анализ цитотоксичности НЧ FePt-PPy

Стандартный анализ МТТ [15] был использован для количественной оценки цитотоксичности клеток. Клетки рака молочной железы MDA-MB-231 использовали в качестве модельных раковых клеток для тестирования биосовместимости НЧ FePt @ PPy. Раковые клетки, обработанные FePt NP, использовали в качестве контроля. Клеточная линия MDA-MB-231 культивировалась в среде DMEM с добавлением 10% FBS и 1% антибиотиков в увлажненной атмосфере при 37 ° C и 5% CO ₂ . Клетки MDA-MB-231 высевали в 96-луночный микропланшет с плотностью 1 × 10 ⁴ . ячеек / лунка. Через 24 ч среду DMEM, содержащую НЧ FePt @ PPy (или НЧ FePt) с различными концентрациями (0, 20, 30, 50, 70, 100 и 120 мкг / мл), добавляли в планшеты с клетками, и обработанные клетки подвергали обработке. затем инкубировали в течение 48 часов. Обратите внимание, что количество FePt одинаково для двух тестируемых наночастиц, включая НЧ FePt и НЧ FePt-PPy. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл МТТ, растворенного в PBS при концентрации 0,5 мг / мл, и планшеты с клетками дополнительно инкубировали в течение 4 часов. Фермент дегидрогеназа, присутствующий в митохондриях живых клеток, превращал растворимый МТТ в нерастворимый пурпурный формазан. Затем добавляли 100 мкл ДМСО для растворения нерастворимого пурпурного формазана. Впоследствии поглощение пурпурного формазана регистрировали при 570 нм с использованием спектрофотометра для чтения планшетов для количественного определения процента жизнеспособности клеток.

Использование сотовой связи

Окрашивание берлинской лазурью использовали для проверки клеточного поглощения НЧ FePt @ PPy клетками MDA-MB-231 [16]. Клетки засевали плотностью 1 × 10 ⁵ . клеток / мл в 12-луночных планшетах и ​​инкубировали в течение 24 часов. Затем в планшеты с клетками добавляли 200 мкг / мл НЧ FePt @ PPy и инкубировали еще 24 часа. После этого клетки фиксировали холодным формальдегидом в течение 15 мин. А затем 10% ферроцианид калия и 20% водный раствор соляной кислоты (50:50 v / v ) добавляли в планшеты с клетками и инкубировали в течение 1 ч. Результат наблюдали с помощью оптической микроскопии.

Фототермальная терапия in vitro

МТТ-анализ проводили для количественной оценки эффективности НЧ FePt @ PPy в отношении убивающей способности клеток рака молочной железы MDA-MB-231. Вкратце, клетки MDA-MB-231 культивировали в 96-луночном микропланшете при плотности 1 × 10 ⁴ ячеек / лунка. На следующий день в планшеты с клетками добавляли растворы НЧ FePt @ PPy с определенной концентрацией (0, 10, 20, 30, 50, 70 и 100 мкг / мл), и обработанные клетки инкубировали еще 24 часа. . Затем для промывки несвязавшихся наночастиц использовали PBS. Впоследствии микропланшеты подвергались воздействию NIR-лазера с плотностью мощности 1 Вт / см ² . на 4 и 6 мин соответственно. Для получения результатов были проведены следующие шаги в соответствии с анализом цитотоксичности клеток в разделе «Анализ цитотоксичности НЧ FePt-PPy».

Двойное окрашивание Hoechst 33342 и PI также использовали для обнаружения поврежденных и мертвых клеток в результате фототермической обработки с использованием НЧ FePt @ PPy. Конкретно, клетки MDA-MB-231 высевали в 12-луночный планшет с плотностью 1 × 10 ⁵ . ячеек / лунка. Через 24 часа клетки обрабатывали НЧ FePt @ PPy (0, 50, 70 и 100 мкг / мл) и непрерывно инкубировали еще 24 часа при 37 ° C. Затем несвязанные наночастицы удаляли осторожной промывкой PBS. Впоследствии ячеистые пластинки подвергались воздействию NIR-лазера с плотностью мощности 1 Вт / см ² . на 6 мин. Затем планшеты с культурами клеток выдерживали в инкубаторе в течение 24 часов, а затем облученные клетки окрашивали Hoechst 33342 и PI. Обратите внимание, что 1,5 мл Hoechst 33342 (10 мкг / мл) добавляли в планшет для культивирования клеток и затем выдерживали в инкубаторе в течение 20 мин. Затем клетки промывали трехкратным PBS для удаления избытка красителя. Затем клетки непрерывно окрашивали 1,5 мл PI (10 мкг / мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Наконец, клетки снова промывали PBS, и флуоресцентные изображения регистрировали с помощью флуоресцентного микроскопа (Leica Microsystems GmbH, Вецлар, Германия).

Эксперимент на животных

Для проведения in vivo теста фототермических свойств НЧ FePt @ PPy 6-недельной самке голой мыши BALB / c подкожно вводили 100 мкл 100 мкг / мл НЧ FePt @ PPy в PBS. Еще одну голую мышь без инъекции использовали в качестве контроля. После этого область инъекции мышей облучали лазером с длиной волны 808 нм при мощности 1 Вт / см ² . на 6 мин. Экспериментальные процедуры с животными были одобрены комитетом по уходу и использованию животных Национального университета Пукён и выполнялись в соответствии с руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных.

Фотоакустическая визуализация in vitro

Настройка PAI

PAI на фантоме выполняли для оценки сигнала PA НЧ FePt @ PPy. Наша группа разработала неинвазивную систему PAI, как сообщалось в предыдущем исследовании [17]. Принципиальная схема установки PAI показана на рис. 11. Использовалась оптическая система со встроенным импульсным лазером Nd-YAD с модуляцией добротности (Surelite III, Калифорния, США). Лазер был настроен на длину волны 808 нм и частоту 10 Гц с длительностью импульса 5 нс. Входное оптическое волокно с фокусным расстоянием 50 мм (Thorlabs, Newton, NJ, USA) соединялось с плосковыпуклой линзой. Выходное оптическое волокно было подключено к сфокусированному преобразователю (Olympus NDT, США) и настроено по центру освещенной зоны. Для записи сигналов PA данные были оцифрованы и сохранены с помощью системы сбора данных (DAQ), интегрированной с лазерной системой. Впоследствии записанные данные были использованы для восстановления двухмерных изображений фантома с помощью программы LabVIEW.

Подготовка образца

Фантом ПВС был приготовлен с 8% ПВС для имитации ткани. Предварительно засеянные раковые клетки MBA-MD-231 обрабатывали различными концентрациями НЧ FePt @ PPy (50, 100 и 200 мкг / мл) в течение 24 часов, а затем клетки собирали и смешивали с 4% желатином на фантоме. (Рис. 12а). Затем фантом покрывали небольшим слоем 4% желатина и давали ему затвердеть. Наконец, фантом был закреплен на резервуаре для воды для обработки PAI.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика НЧ FePt @ PPy

Процесс синтеза наночастиц FePt проиллюстрирован на схеме 1. Анализ EDS этих наночастиц показал, что окончательный атомный состав Fe и Pt составляет 20 и 80% соответственно (дополнительный файл 1:Рисунок S1). Гидрофобные НЧ FePt были модифицированы 3-МПА; таким образом, они становятся гидрофильными НЧ FePt со средним размером 8,3 нм. Гидрофобные НЧ FePt диспергируются в гексане из-за присутствия на поверхности олеиновой кислоты и олеиламина. Однако после обмена лиганда частицы становятся растворимыми в воде. FTIR-спектры гидрофобных НЧ FePt и гидрофильных НЧ FePt выявили характерные полосы от лигандов поглощения олеиновой кислоты, олеиламина и 3-МПА на поверхности (рис. 3; схема 2) [14, 18]. Данные FTIR (рис. 2) вместе с хорошей растворимостью гидрофильных НЧ FePt в воде (схема 1, этап 2) подтвердили успешный процесс обмена лиганда.

Схематическое изображение синтеза и применения НЧ FePt @ PPy в фототермической терапии и фотоакустической визуализации

НЧ FePt были покрыты полипропиленом посредством химической окислительной полимеризации с использованием (NH ₄ ) S ₂ О ₈ как окислитель и ПВС как стабилизатор. Слой PPy отчетливо наблюдался с помощью ПЭМ-изображения (рис. 1c) с толщиной около 10 нм, а средний размер наночастиц FePt @ PPy составляет 42 нм (рис. 1d). FTIR наночастиц FePt @ PPy также был реализован для подтверждения покрытия наночастиц PPy путем изучения изменений частоты FTIR (рис. 3c). Характерные пики PPy хорошо проанализированы в предыдущем отчете [19]. Полосы колебаний FTIR при 1620 и 1446 см ⁻¹ были отнесены к валентным колебаниям C – C и C =C кольца PPy. Полоса на 1236 см ⁻¹ была отнесена к валентному колебанию C – N, а полоса при 1076 см ⁻¹ указывает на наличие плоской моды деформации C – N. Кроме того, полосы на 798 и 600 см ⁻¹ были отнесены к продольным деформационным колебаниям C – H и N – H и внешним изгибным колебаниям C – H соответственно. FTIR вместе с TEM обеспечивает успешное нанесение покрытия на внешние наночастицы FePt из полипропилена.

а ТЕА и б соответствующие распределения размеров чистых НЧ FePt. c ТЕА и d соответствующие распределения размеров НЧ FePt @ PPy

FTIR-спектры (а) гидрофобных НЧ FePt, (б) гидрофильных НЧ FePt и (в) НЧ FePt @ PPy

Спектры UV-Vis-NIR чистых НЧ FePt, PPy и FePt @ PPy

Кривая фототермического нагрева чистых НЧ FePt и НЧ FePt @ PPy с одинаковым количеством FePt. Все растворы облучали мощностью 1 Вт / см ² Лазер 808 нм на 6 мин

а Спектры UV-Vis-NIR различных концентраций НЧ FePt @ PPy. б Фототермический распад НЧ FePt @ PPy различной концентрации. c Соответствующие БИК-термографические изображения облученных образцов. Все растворы облучали мощностью 1 Вт / см ² Лазер 808 нм на 5 мин

а Фототермическое поведение 50 мкг / мл НЧ FePt @ PPy под действием лазера с длиной волны 808 нм и различной плотностью мощности в течение 6 мин. б Запись температуры в реальном времени шести циклов нагрева / охлаждения 50 мкг / мл НЧ FePt @ PPy в рамках лазерного эксперимента включения / выключения (1 Вт / см ² ). c UV-Vis-NIR спектры НЧ FePt @ PPy до и после облучения

Жизнеспособность клеток (с помощью анализа МТТ) клеток MDA-MB-231, инкубированных с НЧ FePt и FePt @ PPy с различными концентрациями в течение 48 часов

Процент живых клеток из клеток, обработанных НЧ FePt @ PPy при различной плотности мощности лазера и разном времени облучения. а Облучение проводили в течение 4 мин. б Облучение проводилось в течение 6 мин.

Светлопольные и флуоресцентные изображения клеток MDA-MB-231 в различных условиях. а Контроль. б Только лазер. c 50 мкг / мл FePt @ PPy НЧ + лазер. г 70 мкг / мл FePt @ PPy НЧ + лазер. е 100 мкг / мл FePt @ PPy НЧ + лазер. Все растворы облучали мощностью 1 Вт / см ² Лазер 808 нм на 6 мин

а Оптическое изображение и соответствующие термографические изображения NIR голой мыши перед инъекцией НЧ FePt @ PPy. б Слева:оптическое изображение голой мыши с подкожной инъекцией. Пунктирный красный кружок указывает место инъекции. Справа:термографическое изображение голой мыши в ближнем ИК-диапазоне после 6 мин при облучении лазером с длиной волны 808 нм (1 Вт / см ² ). Учтите, что максимальный нагрев соответствует месту укола. c Изменение температуры поверхности кожи в месте инъекции и у мышей при облучении лазером 808 нм (1 Вт / см ² ) в течение 6 мин.

Экспериментальная установка системы PAI

Оценка реакции ПА НЧ FePt @ PPy при различных концентрациях: a фантом и б соответствующие изображения PA

Спектры поглощения чистых наночастиц FePt, PPy и FePt @ PPy в УФ-видимой-ближней ИК-области представлены на рис. 3. Сильное поглощение в ближней ИК-области наблюдалось для композитных наночастиц. Спектры поглощения FePt и PPy вместе могут вносить вклад в спектры поглощения НЧ FePt @ PPy. Оптические свойства водных дисперсий НЧ FePt @ PPy с различными концентрациями (от 20 до 120 мкг / мл) также регистрировали с помощью спектроскопии UV-Vis-NIR. Как показано на рис. 4а, с увеличением концентрации НЧ FePt @ PPy интенсивность фотопоглощения во всей УФ-видимой-ближней ИК-области увеличивалась.

Фототермические характеристики НЧ FePt @ PPy

Фототермическое поведение чистых НЧ FePt и FePt @ PPy сравнивалось на рис. 4. Чистые НЧ FePt и FePt @ PPy с фиксированным количеством FePt облучались лазером с длиной волны 808 нм при плотности мощности 1 Вт / см ² . НЧ FePt @ PPy показали превосходные фототермические свойства по сравнению с чистыми НЧ FePt. Эти данные указывают на то, что слой PPy увеличивает фототермическую эффективность всей системы.

Как показано на фиг. 5а, при тех же условиях лазера ближнего ИК-диапазона (5 мин, 1 Вт / см ² ), температура раствора, содержащего 20 мкг / мл НЧ FePt @ PPy, увеличилась с 25 до 39,3 ° C, тогда как раствор, содержащий 120 мкг / мл НЧ FePt @ PPy, быстро достиг 71 ° C. Кроме того, термографические изображения (рис. 5c) показали фототермическое эффективное преобразование образца, содержащего облученные НЧ FePt @ PPy лазером с длиной волны 808 нм. НЧ FePt @ PPy (50 мкг / мл) подвергали облучению лазером в ближнем инфракрасном диапазоне при различных плотностях мощности лазера 0,5, 1,0 и 1,5 Вт / см ² в течение 6 мин, и результирующие температуры составили 41,1, 51,3 и 59,4 ° C соответственно. Эти экспериментальные результаты показали, что время экспозиции, концентрация наночастиц и интенсивность лазерной мощности являются важными параметрами, которые существенно влияют на фототермические характеристики НЧ FePt @ PPy.

Тесты фототермической стабильности НЧ FePt @ PPy

Помимо сильного фототермического преобразования, в PTT важна фотостабильность наночастиц. Раствор FePt @ PPy NP с концентрацией 50 мкг / мл облучали 808-нм NIR-лазером при мощности 1,0 Вт / см ² . до тех пор, пока раствор не достигнет максимальной температуры, затем естественным образом охладится до комнатной температуры, выключив лазер. После шести циклов нагрева и охлаждения тепловая кривая НЧ FePt @ PPy оставалась практически одинаковой для каждого цикла (рис. 4г). Спектры UV-Vis-NIR до и после лазерного воздействия показаны на рис. 6c. Для всего спектра существенных изменений не наблюдалось. Приведенные выше результаты указывают на хорошую фототермическую стабильность НЧ FePt @ PPy в течение длительного периода облучения лазером в ближнем инфракрасном диапазоне.

Тест длительного хранения

Размер частиц и спектры поглощения UV-Vis-NIR приготовленных наночастиц контролировали в течение 30 дней хранения. Во-первых, во всех растворах, содержащих НЧ FePt @ PPy, агрегации не наблюдалось (дополнительный файл 1:рисунок S3a). Во-вторых, НЧ FePt @ PPy в среде для культивирования клеток при концентрации 120 мкг / мл не показали каких-либо значительных изменений в своих спектрах УФ-Вид-БИК (дополнительный файл 1:Рисунок S3b) после 30 дней хранения. Кроме того, средний размер частиц НЧ FePt @ PPy почти не изменился во время длительного хранения (Дополнительный файл 1:Рисунок S3c). Все приведенные выше результаты наглядно подтверждают стабильность полученных наночастиц.

Анализ цитотоксичности клеток in vitro

Для лечения рака наночастицы должны обладать отличной биосовместимостью. Как показано на фиг. 7, клетки рака молочной железы MDA-MB-231 обрабатывали чистыми НЧ FePt и FePt @ PPy с различной концентрацией и инкубировали в течение 48 часов. Никакой значительной цитотоксичности НЧ FePt @ PPy не наблюдалось даже при наивысшей протестированной концентрации (120 мкг / мл), а жизнеспособность клеток рака молочной железы MDA-MB-231 была все еще выше 95%. Что касается чистых НЧ FePt, то облученные наночастицы 120 мкг / мл убили 20% раковых клеток. Этот результат показал, что покрытие из слоя PPy улучшило биосовместимость НЧ FePt, и НЧ FePt @ PPy можно рассматривать как нетоксичный материал.

Использование сотовой связи

Окрашивание берлинской лазурью, основанное на реакции ферроцианида железа и калия в растворе кислоты, было выполнено для обнаружения клеточного поглощения НЧ FePt @ PPy. Как показано в Дополнительном файле 1:Рисунок S2, большинство клеток было окрашено синими пятнами внутри клеток, что указывает на поглощение клетками НЧ FePt @ PPy.

Фототермальная терапия in vitro

Стандартный анализ МТТ проводили для оценки эффективности облученных НЧ FePt @ PPy на убивающую способность клеток рака молочной железы MDA-MB-231. Сначала раковые клетки инкубировали с различной концентрацией НЧ FePt @ PPy в течение 24 часов, а затем подвергали воздействию лазера с длиной волны 808 нм при 1 Вт / см ² в течение 4 мин. Как показано на фиг. 8, процент жизнеспособности клеток постепенно снижался, когда концентрация обработанных наночастиц увеличивалась. Приблизительно 50% клеток погибли при концентрации облученных НЧ FePt @ PPy 100 мкг / мл. Чтобы убить больше раковых клеток, время облучения было увеличено до 6 мин. При концентрации 100 мкг / мл наблюдали примерно 70% мертвых клеток. A comparison of the photothermal therapy performance between the proposed system and some reported nanoparticles was conducted in Additional file 1:Table S1. It is found that the proposed system shows comparable capability in killing cancer cells (i.e., 70% cell death) with quite low nanoparticle concentration (i.e., 100 μg/mL) under relatively weak power density condition (i.e., 1 W/cm ² ) and short irradiation time (i.e., 6 min).

In addition, by using the fluorescence imaging technique of five groups, we conducted experiments on the cancer cells to consider the killing capability of the prepared nanoparticles:the control groups (only cells), the laser-only group (cells were exposed to the 808-nm laser), the 50-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser), the 70-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser), and the 100-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser).

Double staining of Hoechst 33342 and PI was used to explore the damaged and dead cells. Hoechst 33342 is a DNA dye, which can be permeable in both dead and viable cells [20]. The changes in the size and shape of nuclei of the Hoechst 33342 stained cells can be observed under fluorescence microscopy. With the apoptosis cells, Hoechst 33342 will make the condensed chromatin brighter than that in a normal cell. PI dye also binds to DNA, but it only permeates through the membrane of damaged and dead cells [21]. Thus, double staining can differentiate between dead cells and live cells by each treatment method.

As shown in Fig. 9, the cancer cells exposed to the NIR laser in the presence of the FePt@PPy NPs emit strong fluorescence, whereas the slight fluorescence is emitted by cancer cells in the absence of the nanoparticles. Only a few dead cells with the red nuclei were observed in the control and laser-only group (Fig. 9a, b). In contrast, many cells in the FePt@PPy NPs + 808-nm laser groups died and displayed red nuclei, as observed in Fig. 9c–e. After incubation for 24 h, some dead cells lost the binding ability and were washed out of the cell disk. Therefore, the intensity of cancer cells in the 100-μg/mL of FePt@PPy NPs + 808-nm laser group was less than the others. Conclusively, almost cancer cells which were treated with 100-μg/mL of FePt@PPy NPs was destructed after being exposed to the 808-nm NIR laser at a power density of 1.0 W/cm ² .

In Vivo Laser Heating Experiment

The potential ability of FePt@PPy NPs for laser-induced heating was finally tested in an animal model. The nude mouse was subcutaneously injected with 100 μL of an aqueous FePt@PPy (100 μg/mL) NPs in PBS. Figure 10a presents the optical and NIR thermographic images of the nude mouse before injection, pointing out the temperature of mouse surface’s skin is about 36 °C. Fig. 10b (left side) shows an optical image of the mouse in which the injection site is indicated by a dashed red circle. The injected area was irradiated with the 808-nm laser at 1 W/cm ² for 6 min, and the NIR thermographic image of this mouse is shown in Fig. 10b (right side). The temperature of the skin’s surface was continuously monitored with an NIR thermographic camera. The time evolution of the surface temperature during the 6 min irradiation is shown in Fig. 10c, figuring out a temperature increment of the skin about 19 °C. From that, we can see clearly that the injected FePt@PPy NP area with laser irradiation produced a high temperature, as required for tumor ablation. Moreover, the heating area was found to be well localized at the injection site as shown in the NIR thermographic image (Fig. 10b, right side). Conclusively, with the excellent laser-induced heating properties, FePt@PPy could be a novel promising agent for photothermal therapy.

In Vitro Photoacoustic Imaging

The top-view image of the phantom filled with pretreated cancer cells is shown in Fig. 12a. The corresponding PAI acquired at the 808-nm laser from the sample in Fig. 12a is illustrated in Fig. 12b.

PAI is an emerging imaging modality and can be used to assist phototherapy [22]. All the samples containing pretreated cells were clearly visible, whereas the controlled samples with 4% gelatin did not produce any PA signal. The magnitude of the PA signal was increased when the concentration of nanoparticles increased. The ability to image FePt@PPy NPs inside phantom with the PAI system is very promising for image-guided photo-induced cancer therapy. The laser system for PAI, which was used in conjunction with FePt@PPy NPs, also showed the potential for future implementations.

Conclusions

In this study, we developed the photoabsorber FePt@PPy NPs and evaluated their efficiency on in vitro PTT and PAI (Scheme 2). The prepared FePt@PPy NPs showed many good properties for PTT and PAI including excellent biocompatibility, photothermal stability, and high NIR absorbance. Moreover, in vitro investigation confirmed the effectiveness of the FePt@PPy NPs in killing the cancer cells under the NIR laser. So far, the phantom test of PAI used in conjunction with FePt@PPy NPs showed a strong PA signal. Owing to their good properties, the novel FePt@PPy NPs could be considered as promising multifunctional nanoparticles for further applications in PTT and PAI.