Высоконагруженные 5-аминоレвулиновая кислота-сквален наночастицы: усиленная фотоопределение и терапия опухолей в клеточных моделях

Аннотация

Протопорфирин IX (PpIX), эндогенный фотосенсибизатор, образующийся после введения 5-аминоレвулиновой кислоты (5-АЛК), является краеугольным камнем фотодиагностики (ФД) и фотодинамической терапии (ФДТ) для нескольких злокачественностей. Однакозвитеррионная природа 5-АЛК ограничивает ее проникновение через биологические барьеры, ограничивая системную клиническую пользу. Здесь мы описываем новый скваленилированный 5-АЛК (5-АЛК-SQ), который самособирается в наноассамблеи (НА) со средним диаметром 70 нм, низким индексом полидисперсности (0,12), дзета-потенциалом +36 мВ и замечательной загрузкой препарата 26%. В человеческих простатических (PC3) и глиобластомных (U87MG) клеточных линиях 5-АЛК-SQ НА генерировали PpIX флуоресценцию, сравнимую или превосходящую коммерческий гексиловый эфир (5-АЛК-Hex) при сравнимых концентрациях, в то время как демонстрировали превосходную производительность на ранних временных точках (≤4 ч). Эти результаты подчеркивают 5-АЛК-SQ НА как перспективную платформу для системной доставки 5-АЛК в ФД и ФДТ приложениях.

Введение

Нанотехнологии предлагают биокомпатибильные, биоразлагаемые носители, которые могут улучшить химическую стабильность, фармакокинетику и мишеневую доставку терапевтических агентов. Однако многие наночастичные (НЧ) системы страдают от низкой загрузки препарата (<5%) и эффекта взрывного высвобождения, который компрометирует эффективность и безопасность. Сквален, натуральный тритерпен и предшественник холестерина, стал универсальным скелетом для «скваленилирования» — ковалентного конъюгирования препаратов со скваленом, которое движет спонтанную самосборку в высоконагруженные, стабильные НА. Скваленилированные НА успешно применяли для химиотерапевтиков, таких как гемицитабин, паклитаксел, цисплатин и доксорубицин, часто давая превосходную фармакологическую активность и в некоторых случаях позволяя тераностические функциональности.

5-АЛК, предшественник PpIX, уже используется клинически для ФД, ФДТ и флуоресцентно-направленной ресекции глиом. Его терапевтическое окно ограничено заряженной структурой, которая ограничивает системное всасывание и накопление в опухоли. В то время как этерифицированные производные как 5-АЛК-Hex улучшили биодоступность, их использование остается в основном топикальным или ограниченным специфическими раками, такими как рак мочевого пузыря. Недавние исследования исследовали инкапсуляцию 5-АЛК в полимерные НА, липосомы, дендримеры и золотые наночастицы, но ни одна не перевелась в клинически жизнеспособные системные формулировки.

Наша цель была спроектировать 5-АЛК-сквален конъюгат, который самособирается в НА с высокой загрузкой препарата, надежной стабильностью и эффективным опухолевым захватом, тем самым расширяя клиническую достижимость 5-АЛК для ФД и ФДТ в солидных опухолях за пределами текущих показаний.

Результаты и обсуждение

Синтез 5-АЛК-SQ строительного блока

Конъюгат собирали за четыре конвергентных этапа. Boc-защищенный 5-АЛК соединяли с гидроксилированным скваленовым производным через EDC/DMAP-медированное этерифицирование, за чем следовала мягкая кислотная дезактивация и финальная очистка обратной фазой HPLC. Общий выход был высоким, и продукт полностью характеризован НМР и масс-спектрометрией.

Рисунок 2. Синтез 5-АЛК-SQ строительного блока за четыре этапа.

Характеристика 5-АЛК-SQ наноассамблеев

Самосборка индуцировали нанопреципитацией: конъюгат растворяли в 1:1 ацетон/этанол смеси и инъецировали капельно в Milli-Q воду под перемешиванием, за чем следовало удаление растворителей. Динамическое световое рассеяние (ДСР) и крио-ТЭМ раскрыли монодисперсные частицы со средним гидродинамическим диаметром 70 нм и индексом полидисперсности 0,12. Дзета-потенциал +36 мВ указывает на сильную коллоидную стабильность и благоприятные взаимодействия с негативно заряженными клеточными мембранами. Важно, 26% загрузка препарата представляет существенное улучшение по сравнению с большинством 5-АЛК наночастичных формулировок, которые обычно демонстрируют <5% загрузку.

Рисунок 3. (а) Крио-ТЭМ изображения и (б) ДСР анализ 5-АЛК-SQ НА. (в) Стабильность размера частиц при 4 °C в течение нескольких недель.

In vitro кинетика PpIX флуоресценции в раковых клетках

Клетки PC3 и U87MG инкубировали с переменными концентрациями 5-АЛК-SQ НА или коммерческим 5-АЛК-Hex. Флуоресценцию мониторили в течение 24 ч используя пластинчатый ридер (возбуждение 405 нм, эмиссия 630 нм). При 1,0–2,0 мМ 5-АЛК-SQ НА производили стабильный рост PpIX флуоресценции, достигая плато после ~8 ч. В противовес, 5-АЛК-Hex пиковал при 0,10–0,30 мМ, но демонстрировал цитотоксичность выше 1 мМ, снижая общую флуоресценцию.

Рисунок 4. Кинетическая PpIX флуоресценция в клетках PC3 после воздействия 5-АЛК-SQ НА (синий) или 5-АЛК-Hex (красный).

Доза-зависимые кривые при 4 ч и 24 ч раскрыли, что 5-АЛК-SQ НА сравнялись или превзошли 5-АЛК-Hex в интенсивности флуоресценции по обеим клеточным линиям. Максимальная флуоресценция при 4 ч достигалась с 1–2 мМ 5-АЛК-SQ, в то время как 24-часовая экспозиция требовала более высоких концентраций (до 3,3 мМ) для приближения к тем же уровням. Стоит отметить, 5-АЛК-SQ поддерживал более устойчивый флуоресцентный профиль, с постепенным снижением только при наивысших концентрациях и самых длинных инкубациях.

Рисунок 5. Доза-зависимые кривые PpIX накопления с 5-АЛК-SQ НА (синий) и 5-АЛК-Hex (красный) в PC3 (а,б) и U87MG (в,г) клетках после 4 ч (слева) и 24 ч (справа).

При сравнении с коммерческой 5-АЛК формулировкой, 5-АЛК-SQ НА производили значительно более высокую флуоресценцию после 4 ч в клетках U87MG, критическое окно для внутриоперационной визуализации. При 24 ч флуоресценция 5-АЛК-SQ выровнялась с 5-АЛК при оптимальных концентрациях, указывая на сравнимое общее PpIX производство со временем.

Рисунок 6. Доза-зависимые кривые PpIX накопления в U87MG клетках после 4 ч (а) и 24 ч (б) с 5-АЛК-SQ НА (синий) и 5-АЛК (зеленый).

Усиленный клеточный захват 5-АЛК-SQ, вероятно, движим альбумин-медированным транспортом мономерного конъюгата, как ранее демонстрировалось для сквален-гемицитабин НА. Положительно заряженная аминогруппа 5-АЛК может ориентироваться к водной фазе, в то время как гидрофобное скваленовое ядро собирается в интерьер частицы, объясняя уменьшенный размер частицы относительно других скваленовых НА.

Заключение

Мы спроектировали 5-АЛК-сквален конъюгат, который спонтанно формирует высокостабильные, высоконагруженные (26%) НА с благоприятным размером и поверхностным зарядом. In vitro исследования в простатических и глиобластомных клетках демонстрируют, что эти НА эффективно доставляют 5-АЛК, генерируют PpIX флуоресценцию, соперничающую или превосходящую коммерческие формулировки, и сохраняют надежную производительность при длительной инкубации. Эти находки поддерживают дальнейшую in vivo оценку 5-АЛК-SQ НА как системной платформы для опухолевой фотодиагностики и фотодинамической терапии.

Методы/Экспериментальная часть

Все реактивы получены от коммерческих поставщиков и использованы без дальнейшей очистки. 5-АЛК был Boc-защищен, соединен с гидроксилированным скваленовым производным (3) используя EDC/DMAP, затем дезактивирован при мягких кислотных условиях. Финальный продукт (5) очищен обратной фазой HPLC и характеризован НМР и HRMS.

Наноассамблеи готовили нанопреципитацией: 1,2 мг строительного блока (5) растворяли в 50/50 ацетон/этанол смеси (500 мкл) и добавляли капельно в 1,25 мл Milli-Q воды при 100 мкл/мин. После 5 мин перемешивания растворители удаляли ротационным испарением при 30 °C, давая 2,00 мМ НА раствор.

Размер частиц, полидисперсность и дзета-потенциал измеряли ДСР (Malvern Nano ZS) при 25 °C. Крио-ТЭМ выполняли на витрифицированных образцах, подготовленных с Virtobot плунжером. Стабильность оценивали ДСР за 1 месяц при 4 °C.

PC3 (12 000 клеток/колодку) и U87MG (10 000 клеток/колодку) засевали в 96-колодочные пластины, инкубировали с серийными разбавлениями 5-АЛК-SQ НА, 5-АЛК-Hex или 5-АЛК (сыворотко-свободные среды) до 24 ч. PpIX флуоресценция записывалась на Safire пластинчатом ридере (возбуждение 405 нм, эмиссия 630 нм). Данные нормализовывали к необработанным контролям и строились как среднее ± SD. Статистическая значимость устанавливали при p < 0,05 (GraphPad Prism 6).