Наносборки 5-аминолевулиновой кислоты и сквалена для фотодетекции и терапии опухолей:исследования in vitro

Фон

Медицинские нанотехнологии представили новые многообещающие платформы доставки лекарств. Они состоят из биосовместимых и биоразлагаемых наноматериалов, которые помогают улучшить химическую стабильность и фармакокинетический профиль фармакологически активных соединений, обеспечивая при этом контролируемую доставку к месту действия [1,2,3]. Однако до сих пор на рынке появилось лишь несколько систем наночастиц. Основными недостатками существующих наночастиц (НЧ) являются, в основном, их низкая загрузка лекарственным средством (обычно менее 5%) и «эффект мгновенного высвобождения», который вызывает преждевременное высвобождение значительной части лекарственного средства до достижения целевого участка. Это вызывает неблагоприятные побочные эффекты и может привести к токсичности и потере фармакологической активности [4].

Сквален (SQ) представляет собой линейный тритерпен с химической формулой C ₃₀ H ₅₀ и предшественник холестерина и других стероидов [5]. В организме человека сквален синтезируется в печени и коже и переносится липопротеинами низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинами очень низкой плотности (ЛПОНП) в крови [6]. В контексте терапии опухолей сквален проявлял сильное потенцирующее действие на некоторые химиотерапевтические агенты [7]. Поскольку он широко встречается в природе и безопасен, сквален нашел свое применение в фармацевтической технологии в качестве вспомогательного вещества при приготовлении липидных эмульсий для доставки вакцин, различных активных соединений и генов [6, 8, 9]. Было обнаружено, что сквален подходит для ковалентной конъюгации с различными лекарственными средствами. Созданные таким образом передовые наносистемы включают сквален, конъюгированный с химиотерапевтическими агентами, такими как гемцитабин [10,11,12], паклитаксел [13], цисплатин [14] или доксорубицин [15]. Этот подход называется «скваленоилирование» и включает стратегию пролекарства с образованием наноколлоидных систем, в которых активное начало ковалентно связано [16, 17]. Наносборки (НА) на основе сквалена образуются путем самосборки функциональных компонентов в водных средах и характеризуются высокой загрузкой лекарственного средства [18]. Было обнаружено, что скваленоилирование повышает стабильность лекарственного средства и увеличивает растворимость плохо растворимых в воде лекарств, тем самым улучшая биодоступность и продлевая период полужизни лекарственного средства в большом круге кровообращения [14, 16]. В большинстве случаев такие самоорганизующиеся НА проявляют лучшую фармакологическую активность, чем исходный препарат [16, 19]. Кроме того, скваленоилирование обеспечивает средство для создания НА, содержащих как терапевтический, так и визуализирующий метод [20]. Об аналогичных тераностических НА были сообщены Couvreur и соавторами при включении агента МРТ в наноузлы скваленоил-гемцитабина (SQgem) [14]. Эти типы многофункциональных систем могут иметь большое значение при разработке новых тераностических средств для персонализированной медицины.

В контексте тераностики рака введение небольшой молекулы 5-аминолевулиновой кислоты (5-ALA) (рис. 1) привело к клиническому использованию 5-ALA для фотодинамической терапии (PDT) [21,22,23] , фотодиагностика (ФД) [24] и резекция опухоли под контролем флуоресценции у пациентов с глиомой рака мозга [25,26,27]. Тераностика достигается за счет метаболизма 5-ALA и избирательного накопления протопорфирина IX (PpIX) в раковой ткани в результате подавления гемового цикла в обход обратной связи [22]. Однако эффективности 5-ALA PD и PDT серьезно препятствует их цвиттерионная природа при нейтральном pH, обнаруженном в кровотоке. Были предприняты различные попытки улучшить стабильность и фармакокинетический профиль 5-ALA. Как амино-, так и карбоксильный конец 5-ALA были модифицированы различными подходами [28]. Этерификация карбоксильной группы 5-ALA привела к образованию метилового эфира 5-ALA (Metvix®) [29], который используется для местного лечения актинического кератоза, базальноклеточного рака и острых угрей. Гексиловый эфир 5-ALA (5-ALA-Hex) (Hexvix®) получил разрешение на продажу для фотодиагностики (PD) рака мочевого пузыря [30, 31] и экспериментально используется для лечения рака шейки матки и тяжелых угрей [32 , 33,34].

Химические структуры элементов строительных блоков НА. 5-ALA ( а ), 5-ALA-Hex ( b ), сквален ( c ) и 5-ALA-SQ ( d )

Однако, за исключением Gliolan ™, клиническое использование 5-ALA и его производных в основном ограничивается местным применением. Это ограничивает их использование при более важных типах рака, таких как рак груди, колоректального рака, легких и простаты. Попытки расширить использование 5-ALA привели к модифицированным по амино-концам чувствительным к фосфатазе производным 5-ALA, которые недавно показали очень многообещающую активность [35, 36]. Кроме того, были предприняты попытки инкапсулировать 5-ALA в различные наносистемы, включая полимерные НА [37,38,39] или липосомы [40,41,42,43], и ее конъюгацию в дендримеры [44, 45] или НЧ золота [46]. , 47]. Хотя некоторые из этих растворов помогли улучшить стабильность 5-ALA и ее фармакокинетический профиль, ни одна из вышеупомянутых попыток не привела к успешному клиническому кандидату в области наномедицины рака.

Целью данной работы было создание и синтез строительного блока конъюгата 5-ALA-сквален (5-ALA-SQ) (рис. 1d), который самособирается в водной среде и содержит высокую лекарственную нагрузку 5-ALA, что является необходимым условием. для фармакологической активности при раке. НК были протестированы на двух различных линиях раковых клеток на предмет их флуоресцентной способности к PD. В сочетании с недавними сообщениями о НА на основе сквалена, использующих липопротеины плазмы для достижения непрямого нацеливания на рак [48], этот нанотехнологический подход с 5-ALA расширяет использование 5-ALA для PD и PDT различных видов рака, таких как рак простаты, используемых в этом исследовании. .

Результаты и обсуждение

Синтез стандартных блоков 5-ALA-SQ

Эффективная конвергентная химическая стратегия была использована для синтеза строительного блока 5-ALA-SQ из сквалена и 5-ALA (рис. 2). 5-ALA сначала была защищена на амино-конце с помощью N -Boc защитная группа при стандартных условиях. Спирт сквалена, индуцирующий наносборку ( 3 ) был синтезирован из сквалена в четыре стадии синтеза по методикам, описанным в литературе [49]. Boc-5-ALA ( 2 ) и скваленовый спирт ( 3 ) были затем связаны в присутствии EDC и DMAP с получением защищенного сложноэфирного производного ( 4 ) с хорошей урожайностью. Окончательное снятие защиты с Boc необходимо было проводить в умеренно кислых условиях, чтобы избежать электрофильного добавления на скваленовый каркас. Конечный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ, чтобы получить строительный блок NA с хорошим выходом.

Синтез строительного блока 5-ALA-SQ. 5-ALA-SQ был синтезирован в четыре этапа синтеза с использованием конвергентного синтеза из 5-ALA и SQ

Наносборки 5-ALA-SQ

Для достижения эффективной доставки активного соединения наночастицами (НЧ) к месту его действия такие параметры, как размер, форма и поверхностный заряд наночастиц, играют важную роль и регулируют фармакокинетику систем наночастиц в организме [ 50]. В частности, размер частиц определяет несколько фармакокинетических явлений, таких как период полужизни NP в системном кровотоке, секвестрация макрофагами и экстравазация через протекающую сосудистую сеть в место действия [51]. Форма и размер наночастиц регулируют их способность экстравазировать через отверстия в сосудистой сети [50, 51]. Размер и форма также очень важны для активного нацеливания и поглощения клетками, поскольку более мелкие НЧ и сферические формы имеют меньшую площадь поверхности, что значительно ограничивает точки контакта по сравнению с более крупными несферическими системами наночастиц [51].

Самосборка строительного блока 5-ALA-SQ происходила спонтанно в водной среде. НК были сформированы методом наносаждения. Конъюгат 5-ALA-SQ растворяли в органических растворителях и по каплям добавляли в воду. После полного испарения органических растворителей получали водный раствор НА. НК 5-ALA-SQ были монодисперсными с индексом низкой полидисперсности, равным 0,12. Измерения электрофоретической подвижности дали ζ-потенциал 36 мВ, а динамическое рассеяние света (ДРС) выявило монодисперсное распределение НА со средним размером 70 нм (рис. 3). Диапазон размеров NA предлагает хороший потенциал для длительного кровообращения [50]. Тем не менее, НА 5-ALA-SQ значительно меньше, чем описанные ранее композиты SQ, диапазон которых составляет от 100 до 300 нм, что указывает на другое надмолекулярное расположение [19].

Характеристика НА 5-ALA-SQ. Низкий ( a ) и высокий ( b ) крио-ПЭМ-изображения с увеличением, DLS-анализ ( c ) и стабильность при 4 ° C ( d )

Меньший размер может быть связан с положительно заряженными аминогруппами и относительно небольшой молекулой 5-ALA по сравнению с фрагментом SQ. Было продемонстрировано, что изменение малых молекул, прикрепленных к сквалену, вносит изменения в самосборку и упаковку конъюгатов соединение-сквален, что приводит к изменению формы и размера НА [16]. Возможно, что высоко положительно заряженная аминогруппа 5-ALA ориентируется на объем воды, в то время как липофильные цепи занимают внутреннюю часть этих NA; однако точная надмолекулярная структура еще предстоит выяснить. Несмотря на значительно меньший размер по сравнению с другими нанокомпозитами сквалена, НА демонстрируют отличную стабильность при хранении, при этом размер и PDI остаются постоянными в течение нескольких недель.

Другим важным аспектом новых НА 5-ALA-SQ является то, что они достигают 26% -ной загрузки лекарственного средства, что является высоким показателем по сравнению с другими известными системами наночастиц 5-ALA, где загрузка была намного менее эффективной [37, 38, 41]. Нагрузка лекарством очень важна для доставки НЧ, поскольку в НЧ с плохой загрузкой лекарственного средства вводимая доза может быть недостаточной для достижения фармакологически активной концентрации в тканях-мишенях [4]. Нагрузку можно определить простым расчетом с учетом молекулярных масс 5-ALA и 5-ALA-SQ, поскольку 5-ALA ковалентно связана со скваленовым каркасом в молярном соотношении 1:1.

Измерения кинетики флуоресценции PpIX в раковых клетках

Зависимое от времени образование PpIX оценивали в клетках рака предстательной железы человека PC3 и глиобластоме U87MG, инкубированных с 5-ALA-SQ NA и 5-ALA-Hex в качестве эталона. На рисунке 4 показано образование PpIX в клетках рака предстательной железы человека PC3, подвергшихся воздействию возрастающих концентраций NAs 5-ALA-SQ или 5-ALA-Hex в течение 24 часов.

Кинетические измерения флуоресценции накопления PpIX в клетках PC3. Клетки инкубировали с возрастающими концентрациями НА 5-ALA-SQ ( a ) или 5-ALA-Hex ( b )

Зависимые от концентрации профили флуоресценции PpIX наблюдали для НА 5-ALA-SQ. При 1,0 и 2,0 мМ флуоресценция PpIX стабильно увеличивалась в течение 24 часов, достигая плато после 8 часов инкубации для более низких концентраций. С другой стороны, 5-ALA-Hex индуцировал наибольшее накопление PpIX в диапазоне более низких концентраций от 0,10 до 0,30 мМ, как сообщалось ранее [35, 52]. Однако было обнаружено, что 5-ALA-Hex в концентрациях выше 1 мМ токсичен для клеток, что снижает общую наблюдаемую флуоресценцию и препятствует его использованию [36].

Затем было выполнено дозозависимое накопление PpIX в раковых клетках глиобластомы человека PC3 и U87MG с целью оценки оптимальной дозировки NA. Интенсивность флуоресценции через 4 и 24 часа инкубации с НА 5-ALA-SQ и 5-ALA-Hex показана на фиг. 5. Очень важно, что НА 5-ALA-SQ индуцировали продукцию PpIX в обеих клеточных линиях. Кроме того, максимальные уровни флуоресценции сопоставимы с контролем ALA-Hex в обеих клеточных линиях. Также можно отметить, что в клетках PC3 1,0 и 2,0 мМ концентрации НА 5-ALA-SQ были оптимальными для индукции максимального накопления PpIX. В клетках U87MG не было значительных различий между различными концентрациями НА 5-ALA-SQ в течение короткого времени инкубации (фиг. 5c). Было обнаружено, что через 24 часа накопление PpIX зависит от концентрации NAs 5-ALA-SQ или 5-ALA-Hex, как в клетках PC3. Уменьшение индукции PpIX, в чем-то похожее на ALA-Hex, было обнаружено после более длительного периода инкубации при более высоких концентрациях НА 5-ALA-SQ, которые были более чувствительны к присутствию НА.

Кривые доза-реакция. Зависимое от концентрации накопление PpIX с 5-ALA-SQ NA (синий) и 5-ALA-Hex (красный) в PC3 ( a , b ) и U87MG ( c , d ) клеток через 4 часа (слева) и 24 часа (справа) инкубации

Рисунок 5 демонстрирует, что через 24 часа кривые продукции PpIX имеют колоколообразную форму как в клетках PC3, так и в клетках U87MG. В то время как 1 мМ концентрация НА 5-ALA-SQ вызывала наибольшее накопление PpIX в клетках PC3, клетки U87MG переносили более высокие концентрации, и увеличение флуоресценции PpIX наблюдалось до 2 мМ 5-ALA-SQ NA. В общем, более высокие концентрации НА 5-ALA-SQ были необходимы для эффективного индуцирования биосинтеза PpIX по сравнению с 5-ALA-Hex, предположительно из-за различных скоростей расщепления сложноэфирных связей в раковых клетках. Снижение продукции PpIX наблюдалось при использовании концентраций более 1 мМ 5-ALA-Hex из-за неспецифической токсичности 5-ALA-Hex. Этот эффект был гораздо менее выражен для 5-ALA-SQ, где флуоресценция уровни начали падать только при наивысшей протестированной концентрации (3,3 мМ) и при увеличении времени инкубации (рис. 5b, d). Однако уровни флуоресценции были одинаковыми для обоих соединений без какой-либо задержки флуоресценции, наблюдаемой для НА.

NA также анализировали в глиобластоме U87MG по сравнению с контролем 5-ALA, который продается для PD глиобластомы во время хирургической резекции. На рис. 6 представлена ​​флуоресценция клетки U87MG через 4 и 24 часа. НА 5-ALA-SQ вызывали значительно более высокую флуоресценцию через 4 часа по сравнению с 5-ALA, что очень важно в клинических условиях. Через 24 часа профиль флуоресценции смещается в пользу 5-ALA при более низких концентрациях, поскольку медленное активное поглощение 5-ALA обеспечивает достаточное количество 5-ALA в клетках. НА по-прежнему демонстрируют те же уровни флуоресценции, что и 5-ALA при оптимальных концентрациях НА 1,0 и 2,0 мМ (рис. 6b).

Кривые доза-реакция. Зависимое от концентрации накопление PpIX в клетках U87MG через 4 ч ( a ) и 24 часа ( b ) инкубация с 5-ALA-SQ NA (синий) и 5-ALA (зеленый)

В клинической практике 5-ALA вводят либо местно, либо перорально, но из-за своей заряженной природы только небольшая часть начальной дозы попадает в клетки-мишени через эндогенные переносчики пептидов, такие как транспортеры PEPT1, PEPT2 или BETA, в зависимости от типа клеток. [40, 53]. Недавние исследования NA из производного SQgem показывают, что проникновение в клетку регулируется усиленной альбумином диффузией единичных молекулярных строительных блоков, и было обнаружено, что это сильно зависит от присутствия внеклеточных белков [54, 55]. Кроме того, дально-красные флуоресцентные НА, о которых мы недавно сообщили, также продемонстрировали быструю интернализацию, а кинетические эксперименты по флуоресценции 5-ALA-SQ и кривые доза-ответ подтверждают интернализацию строительного блока одной молекулы и эффективный последующий метаболизм с образованием флуоресцентного PpIX.

Выводы

В этом исследовании, подтверждающем концепцию in vitro, была использована конвергентная химическая стратегия для синтеза строительного блока 5-ALA-SQ из сквалена и 5-ALA. НК 5-ALA-SQ были получены методом спонтанного нанопреципитации в воде. НА были монодисперсными и стабильными со средним размером 70 нм, индексом полидисперсности 0,12, положительным ζ-потенциалом 36 мВ и высокой нагрузкой 5-ALA, 26%. Продукция PpIX оценивалась in vitro в двух линиях раковых клеток путем измерения увеличения флуоресценции с течением времени и по сравнению с 5-ALA и 5-ALA-Hex. Результаты показали, что НА SQ-ALA очень эффективны в индукции продукции PpIX в раковых клетках типов PC3 и U87MG. Они превосходят 5-ALA-Hex по индукции флуоресценции при более высоких концентрациях при 4 и 24 часах инкубации in vitro; однако по сравнению с 5-ALA они показывают лучшую индукцию флуоресценции при более коротком времени инкубации. В рамках этих результатов мы можем сделать вывод, что НА 5-ALA-SQ представляют собой привлекательное нанотехнологическое решение для преодоления фармакокинетических недостатков 5-ALA. Кроме того, в экспериментах in vivo будет оценен их потенциал для системной доставки 5-ALA для флуоресцентной ФД и ФДТ терапии опухолей.

Методы / экспериментальные

Реагенты были приобретены у коммерческих поставщиков Sigma-Aldrich (Бакс, Швейцария) и Acros Organics (Базель, Швейцария) и использованы без дополнительной очистки. Дейтерированные растворители для ЯМР были получены от Cambridge Isotope Laboratories (Тьюксбери, США). Тетрагидрофуран (THF) и дихлорметан (CH ₂ Cl ₂ ) были получены из системы сушки на основе колонны из оксида алюминия безводного технического производства. Все остальные использованные растворители были чистыми для ВЭЖХ. N, N-диметилформамид (ДМФ), метанол (CH ₃ ОН), диэтиловый эфир (Et ₂ O) и ацетон были приобретены у Sigma-Aldrich (Buchs, Швейцария). Этилацетат (AcOEt) был приобретен в Biosolve (Dieuze, Франция); ацетонитрил (CH ₃ CN) был предоставлен компанией Carlo Erba Reagents (Балерна, Швейцария). Гексан ≥ 95% н-гексана был приобретен у Fisher Chemical (Базель, Швейцария). Вода, используемая для препаратов, была деионизирована лабораторной системой водоснабжения Milli-Q (Millipore, Molsheim, Франция). Химические реакции проводили с использованием стандартных шприцев-перегородок с избыточным давлением аргона для обеспечения безводных условий.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) выполняли с пластинами из диоксида кремния с алюминиевой подложкой (Merck-Keiselgel 60 F254) с подходящей подвижной фазой и визуализировали с помощью УФ-флуоресцентной лампы (254 и 366 нм) и / или проявляли с помощью нингидрина, 20% серной кислоты. кислота, или фосфорномолибденовая кислота (ФМА). Флэш-хроматографию выполняли на автоматизированном аппарате PuriFlash® 4100 от Interchim (Montlucon, Франция) с использованием колонок с силикагелем Interchim puriFlash® HP 30 мкм, оснащенных детектором PDA (200–800 нм) и автоматическим сборщиком фракций. Профиль элюции контролировали с помощью программного обеспечения Flash Interchim версии 5.0x. Полупрепаративную колонку ВЭЖХ проводили на Waters Symmetry 300TM - 5 мкм (19 × 150 мм), колонка C8 (Baden-Dättwil, Швейцария). Аналитический UPLC проводили с использованием колонки Macherey-Nagel EC50 / 2 Nucleodur Gravity 1,8 мкм (50 × 2,1 мм), установленной на водной системе, оборудованной детектором Waters PDA (Baden-Dättwil, Швейцария). Буфер A =CH ₃ CN + 0,1% муравьиной кислоты) и буфер B =H ₂ O + 0,1% Муравьиная кислота. Скорость потока =400,0 мкл / мин при 25 ° C. ¹ H и ¹³ Спектры ЯМР 13С записывали на спектрометрах Varian Gemini 300 МГц, Varian Innova 500 МГц или Bruker Avance III Cryo 600 МГц при 298 К. Химические сдвиги (δ) указаны в миллионных долях (м.д.), а константы взаимодействия (J) указаны в герц (Гц). s для синглета, d для дублета, dd для дублета дублетов, t для триплета, q для квартета и m для мультиплета. Пики остаточного растворителя использовали в качестве внутреннего стандарта для химических сдвигов протонов и углерода. Спектры ЯМР обрабатывали с помощью пакета программ Mnova version 10.0.2. Масс-спектрометрию низкого разрешения (LRMS) проводили на приборе HTS PAL-LC10A - API 150Ex в ESI (положительный режим). Масс-спектрометрию высокого разрешения (HRMS) проводили на приборе QSTAR Pulsar (AB / MDS Sciex) в ESI (положительный режим). Химические структуры были нарисованы и названы в соответствии с номенклатурой IUPAC с использованием программного пакета ChemBioDraw Ultra версии 14.0.0.117. PH измеряли на pH-метре Metrohm 691 с использованием острия (Zofingue, Швейцария), калиброванного буферами Metrohm. Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 6, 2016 (GraphPad Software). P значение <0,05 считалось статистически значимым.

Синтез стандартного блока SQ-ALA

5- (трет-Бутоксикарбониламино) -4-оксопентановая кислота (2)

Boc-5-ALA синтезировали согласно опубликованной методике. Спектроскопические данные совпадают с литературными [56]. ¹ H ЯМР (600 МГц, ДМСО-d6) δ 12,12 (с, 1H), 7,06 (т, J =5,9 Гц, 1H), 3,76 (д, J =5,9 Гц, 2H), 2,61 (т, J =6,6 Гц. , 2H), 2,40 (т, J =6,5 Гц, 2H), 1,38 (с, 9H). ¹³ C ЯМР (151 МГц, ДМСО) δ 206,62, 174,07, 156,21, 78,54, 49,97, 40,38, 40,24, 40,11, 39,97, 39,83, 39,69, 39,55, 34,22, 28,64. [M + H] ⁺ 232,1, обнаружено 232,7.

(4E, 8E, 12E, 16E) -4,8,13,17,21-пентаметилдокоса-4,8 , 12,16,20-пентаен-1-ол (3)

Скваленовый спирт 3 был синтезирован из сквалена в четыре стадии синтеза с выходом 23,7% в виде бесцветного масла согласно описанным методикам [49]. ¹ H ЯМР (300 МГц, CDCl ₃ ) δ 5,17-5,06 (м, 5H, CH), 3,62 (кв, Дж =6,3 Гц, 2H, CH ₂ -ОН), 2,17 - 1,92 (м, 18H, CH ₂ ), 1,67 (с, 3H, CH ₃ ), 1,59 (м, 17 H, CH ₃ и CH ₂ ). ¹³ C ЯМР (75 МГц, CDCl ₃ ) δ 135,35, 135,17, 135,14, 134,81, 131,49, 125,05, 124,64, 124,60, 124,47, 63,07, 39,98, 39,95, 39,89, 36,24, 30,92, 28,48, 26,98, 26,88, 26,78, 25,94, 17,92, 16,28, 16,23, 16.08. LRMS (ESI):m / z рассчитано для [M + NH ₄ ] ⁺ 404,4, обнаружено 404,8.

(4E, 8E, 12E, 16E) -4,8,13,17,21-пентаметилдокоза-4,8 , 12,16,20-пентаен-1-ил 5 - ((трет-бутоксикарбонил) амино) -4-оксопентаноат (4)

Скваленовый спирт ( 3 ) (100 мг, 0,26 ммоль), EDC (74 мг, 0,38 ммоль) и DMAP (94 мг, 0,78 ммоль) и 5- (трет-бутоксикарбониламино) -4-оксопентановая кислота (2) (77 мг, 0,34 ммоль) растворяли в DCM (15 мл). После перемешивания в течение ночи при температуре окружающей среды растворитель выпаривали при пониженном давлении и сырой продукт очищали флэш-хроматографией с использованием градиента DCM / этилацетат (EA), получая бесцветное масло (108 мг, 0,18 ммоль, 70%). ¹ H ЯМР (300 МГц, CDCl ₃ ) δ 5,31 - 5,20 (шир. с, 1H), 5,13 - 5,07 (м, 5H), 4,09 - 3,95 (м, 4H), 2,75 - 2,53 (м, 4H), 2,02 - 1,95 (м, 20H), 1,64 ( с, 3H), 1,63 - 1,50 (м, 19H), 1,41 (с, 9H). ¹³ C ЯМР (75 МГц, CDCl3) δ 204,46, 172,65, 135,30, 135,16, 135,09, 133,75, 131,43, 125,34, 124,60, 124,57, 124,48, 124,45, 64,81, 50,53, 39,96, 39,93, 39,87, 35,92, 34,56, 28,52, 28,47 , 28,43, 28,24, 28,02, 26,97, 26,86, 25,92, 23,11, 17,90, 16,25, 16,21, 16,06. LRMS (ESI):m / z рассчитано для [M + NH ₄ ] ⁺ 617,5, обнаружено 617,8.

Соль трифторуксусной кислоты и 5-амино - (((4E, 8E, 12E, 16E) -4,8,13 , 17,21-пентаметилдокоса-4,8,12,16,20-пентаен-1-ил) окси) -4-оксопентаноат (5)

Соединение 4 (34 мг, 57 ммоль) растворяли в DCM (2,0 мл). Добавляли трифторуксусную кислоту (TFA) (200 мкл) и реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды. Через 10 мин растворители выпаривали в вакууме при низкой температуре и следы TFA удаляли совместным выпариванием с EA (3 × 10 мл). Неочищенный продукт очищали ОФ-ВЭЖХ с использованием полного H ₂ . Градиент O / AcN (0,025% TFA) с получением бесцветного масла (25 мг, 74%). %). ¹ H ЯМР (300 МГц, CDCl ₃ ) δ 5,31 - 5,20 (шир. с, 1H), 5,13 - 5,07 (м, 5H), 4,09 - 3,95 (м, 4H), 2,75 - 2,53 (м, 4H), 2,02 - 1,95 (м, 20H), 1,64 ( с, 3H), 1,63 - 1,50 (м, 19H). LRMS (ESI):m / z рассчитано для [M + H] ⁺ 500,4, обнаружено 500,6.

Подготовка наноассембл

НК были получены методом нанопреципитации, подробно описанном в [20]. Вкратце, строительный блок 5 (1,2 мг, 2,0 мкмоль) растворяли в 50/50 V / V смесь ацетон / этанол (500 мкл). Затем органическую фазу добавляли по каплям, используя микрошприц, в воду MilliQ (1,25 мл) со скоростью 100 мкл / мин при магнитной мешалке. Через 5 мин перемешивания удаляли стержень магнитной мешалки и удаляли органические растворители и избыток воды с помощью роторного испарителя при 30 ° C. Конечная концентрация наноузлов составила 2,00 мМ.

Характеристика НА 5-ALA-SQ

Загрузка 5-ALA 5-ALA.SQ NA рассчитывалась из соответствующих вкладов молекулярных масс 5-ALA и конъюгата 5-ALA-SQ следующим образом [19]:

Гидродинамический диаметр НА измеряли методом динамического рассеяния света (DLS) с использованием прибора NANO ZS от Malvern (Вустершир, Великобритания) с программным обеспечением ZetaSizer 7.01. Анализы проводили с помощью гелий-неонового лазера мощностью 4 мВт (633 нм) при угле рассеяния 173 ° при 25 ° C в микрокювете из полистирола (PS) от Brand (Wertheim, Германия). Дзета-потенциал (ZP) определяли с использованием того же прибора Nano ZS от Malvern в свернутых капиллярных клетках DTS 1070 от Malvern. Распределение по размерам и средний диаметр по размеру были рассчитаны на основе данных. Стабильность НА, хранящихся при 4 ° C, проверяли с помощью DLS через регулярные промежутки времени в течение 1 месяца.

Морфологию НА оценивали с помощью криогенного просвечивающего электронного микроскопа (крио-ТЕМ) с использованием TECNAI® G ² Микроскоп Sphera (FEI, Thermo Fisher Scientific), оснащенный цифровой камерой высокого разрешения 2000 на 2000 пикселей TCL (Gräfelfing, Германия). Образцы застеклованного льда готовили с использованием криоплунжера Virtobot (FEI, Thermo Fisher Scientific). НА (2,0 мкл, 2,0 мМ) наносили на сетки Quantifoil Cu / Rh 200 меш R3,5 / 1 (SPI, West Chester, USA) и застекловывали с использованием жидкого этана.

Культура клеток

Клетки рака предстательной железы человека PC3 (ATTC® CRL-1435 ™) и клетки глиобластомы человека U87MG (ATTC® HTB-14 ™) выращивали и поддерживали серийным пассажем в смеси питательных веществ F-12K (21127-022, Thermo Fisher Scientific) или минимум Essential Media (31095-029, Thermo Fisher Scientific) соответственно. В клеточную среду добавляли фетальную телячью сыворотку (10%, CVFSVF00-01, Eurobio), стрептомицин (100 мкл / мл) и пенициллин (100 МЕ / мл, 15140-122, Thermo Fisher Scientific). Клетки культивировали при 37 ° C в увлажненной атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% CO ₂ .

Измерения кинетики флуоресценции PpIX in vitro

Клетки рака предстательной железы человека PC3 (12000 клеток / лунку) и клетки глиобластомы U87MG (10000 клеток / лунку) высевали в 96-луночные планшеты (черный планшет с прозрачным дном, 3603, Corning). На следующий день клетки подвергали воздействию возрастающих концентраций NAs 5-ALA-SQ, 5-ALA-Hex и 5-ALA в бессывороточной среде. Флуоресценцию PpIX регистрировали с помощью планшет-ридера (Safire, Tecan, Switzerland) в разные моменты времени. Длину волны возбуждения устанавливали равной 405 нм, а длину волны излучения - 630 нм. Средние значения и стандартное отклонение. для каждой концентрации в каждый момент времени на планшете вычитали контрольное значение (без обработки) и наносили на график для каждой клеточной линии.