Моноклональное антитело к гепараназе, меченное магнитными золотыми наночастицами, и его последующее применение для магнитно-резонансной томографии опухолей

Фон

Метастазирование опухоли - это злокачественное заболевание, которое является основной причиной смерти пациентов с опухолями. В настоящее время не существует эффективных стратегий для обнаружения метастазов опухоли на ранней стадии. Ультразвук типа B, компьютерная томография (КТ) и магнитно-резонансная томография (МРТ) в настоящее время являются стандартными инструментами для диагностики метастазов опухоли, но они могут отличить метастатические опухоли определенных размеров только тогда, когда у большинства пациентов уже имеются отдаленные метастазы [1 , 2]. Таким образом, крайне необходимо разработать новые стратегии для обнаружения метастазов опухоли на ранней стадии.

В последние годы молекулярная визуализация, такая как молекулярная магнитно-резонансная томография, стала новым вариантом для ранней диагностики и лечения опухолей благодаря хорошему пространственному разрешению и средней чувствительности к контрастному веществу [3, 4]. Разработка новых контрастных веществ, которые обеспечивают больше, чем просто улучшение изображения, является одним из основных мотивов в развитии МРТ. В последнее время использование суперпарамагнитных молекулярных зондов в качестве сильной системы усиления сигнала значительно увеличивает чувствительность контрастных агентов, нацеленных на МРТ. Комплексы парамагнитных ионов или моноклональные антитела, конъюгированные с магнитными частицами, используются для изменения времени релаксации опухоли [5]. Молекулярная визуализация с использованием комбинации магнитных наноматериалов и моноклональных антител против опухолевых антигенов (ТАА) является предметом недавних исследований. Большинство обнаруженных к настоящему времени TAA, таких как AFP, PSA и CEA, являются тканеспецифичными для опухоли [6]. Таким образом, комбинирование mAb против этих TAA с магнитными наноматериалами полезно для опухолей, экспрессирующих эти специфические антигены. Таким образом, идентификация общего опухолевого антигена, который подходит для ряда опухолей, и мечение mAb против такого антигена с помощью магнитных наноматериалов полезно при молекулярной визуализации опухолей.

Гепараназа (HPA) - это ген, связанный с метастазами опухоли, который был клонирован одновременно в четырех лабораториях в 1999 г. [7,8,9,10]. Только эндогенная эндогликозидаза может расщеплять гепарансульфат протеогликан (HSPG), основной протеогликановый компонент внеклеточного матрикса (ECM). HPA повсеместно экспрессируется в метастатических злокачественных опухолях, и уровень его экспрессии тесно связан с метастазированием опухоли. HPA может нарушать целостность ECM и базальной мембраны (BM) посредством расщепления HSPG в ECM и BM, что приводит к высвобождению и активации молекул, заякоренных в ECM, и затем способствует ангиогенезу и метастазированию опухоли [11, 12]. Наши предыдущие исследования показали, что HPA может использоваться в качестве TAA для иммунотерапии опухолей [13,14,15,16]. Здесь мы попытались оценить, доступен ли HPA как обычный TAA для молекулярной визуализации метастазов опухоли и его потенциальное применение в молекулярной визуализации опухолей.

В этом исследовании мы использовали магнитные наночастицы золота (30 нм) в качестве контрастного агента и моноклональные антитела против HPA в качестве нацеленных векторов для создания молекулярных зондов HPA и GoldMag, а также изучили возможность и значение этих зондов в МРТ молекулярной визуализации для ранней диагностики опухолей. метастаз. Были также оценены противоопухолевые биологические эффекты антител против HPA in vitro, чтобы предоставить экспериментальную основу для применения mAb против HPA при лечении опухолей.

Методы

Линии клеток и мыши

В этом исследовании использовали семь клеточных линий. Гепараназа-положительные линии клеток, включая линию клеток рака печени HepG2, линии клеток рака желудка человека MKN45 и SGC-7901, линию клеток рака толстой кишки SW480 и линию клеток остеосаркомы человека U2OS, были приобретены из Американской коллекции типовых культур. Гепараназа-отрицательные клеточные линии, клеточная линия рака молочной железы человека MCF-7 и клеточная линия первичных эмбриональных фибробластов человека HF были предоставлены доктором Ляном (Исследовательский институт ожогов, Третий военный медицинский университет, Чунцин, Китай). Клетки HepG2 культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Клетки SGC-7901, SW480, U2OS и HF культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Клетки MKN45 и MCF-7 культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 15% фетальной бычьей сыворотки. Все клетки культивировали в 5% CO ₂ инкубатор при 37 ° C и пропускали каждые 24–48 ч. Пятнадцать голых мышей BALB / c (возрастом от 4 до 5 недель) были приобретены в отделении животных Третьего военного медицинского университета. Исследования на животных проводились по согласованию с местным этическим комитетом Третьего военно-медицинского университета. Все голые мыши содержались в среде, свободной от патогенов.

Вестерн Блот

Вестерн-блоттинг проводился для определения экспрессии белка Hpa в соответствии с процедурой, описанной в нашем предыдущем исследовании [17]. Каждую клеточную линию лизировали экстракционным реагентом M-PER (Pierce Co.). Концентрации белка определяли с помощью анализа BCA (Bio-Rad, Калифорния, США). Тридцать микрограммов белков фракционировали с помощью 10% SDS-PAGE и затем переносили на поливинилидендифторидную (PVDF) мембрану (Roche, Rotkreuz, Швейцария). Мембрана была заблокирована 5% ( w / v ) обезжиренное молоко в TBST (20 мМ трис-HCl [pH 8,0], 150 мМ NaCl и 0,1% [ об / v ] Твин-20) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем мембрану зондировали разведением 1:200 антител против HPA (Insight, Израиль) в блокирующем буфере при 4 ° C в течение ночи. Мембрану промывали четыре раза TBST и инкубировали с антителом против мышиного IgG, конъюгированным с пероксидазой хрена, в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем мембрану промывали TBST, и полосы белка визуализировали с помощью реагентов для обнаружения вестерн-блоттинга ECL (GE Healthcare, Нью-Джерси, США). Изображения анализировали с помощью программного обеспечения Quantity One 4.1 (Bio-Rad). Эксперименты повторялись не менее трех раз.

Иммуногистохимическое окрашивание

Экспрессию Hpa в указанных выше клеточных линиях определяли иммуноцитохимическим методом. Вкратце, указанные выше клетки культивировали на стерильных покровных стеклах при 37 ° C в 5% CO ₂ инкубатор на 48 ч. После блокирования активности эндогенной пероксидазы обработкой 0,3% H ₂ О ₂ в растворе метанола в течение 20 мин, клетки инкубировали с первичным антителом Hpa (разведение антитела составляло 1:100) в течение ночи при 4 ° C. После тщательной промывки PBS, содержащим 0,1% Triton X-100, слайды инкубировали с вторичным антителом в течение 20 минут при 20 ° C. Наконец, слайды инкубировали в течение 15 минут с реагентом авидин-биотин-фермент. Затем предметные стекла погружали в раствор 3,3'-диаминобензидин / H2O2. PBS использовали в качестве отрицательного контроля.

Создание молекулярного зонда HPA и GoldMag и микрофотография атомной силы

Конструирование молекулярного зонда выполняли с использованием набора GoldMagTM-CS (компания Xi’an Gold, занимающаяся магнитной нанобиотехнологией, GNK0202, Сиань, Китай) в соответствии с инструкциями по эксплуатации. Концентрация антитела против HPA составляет 1 мг / мл. Микрофотография атомных сил (AFM) использовалась для оценки формы, размера и внешнего вида наночастиц. Немеченые магнитные наночастицы золота или меченые магнитные наночастицы золота помещали на покровное стекло и сушили на воздухе при комнатной температуре в течение 24 часов. Высушенные образцы анализировали с помощью атомно-силового микроскопа (AFM, Nanoscope, Digital Instruments, Санта-Барбара, Калифорния).

Иммунофлуоресценция

Вкратце, клетки культивировали на стерильных покровных стеклах при 37 ° C в 5% CO ₂ инкубатор на 48 ч. Затем клетки фиксировали 4% ( w / v ) формальдегид в PBS в течение 30 минут и проницаемость 0,2% ( v / v ) Тритон Х-100 в течение 5 мин при комнатной температуре. Клетки блокировали, инкубируя покровные стекла с 10% ( v / v ) козьей сыворотки в PBS в течение 30 мин. Затем клетки окрашивали молекулярными зондами HPA и GoldMag или зондами нормального мышиного IgG и GoldMag в разведении 1:50 с последующим окрашиванием меченным Cy3 козьим антимышиным IgG в разведении 1:100. Затем клетки окрашивали 0,4 мг / мл DAPI (Sigma-Aldrich) в течение 10 мин при комнатной температуре. Микроскопические изображения были получены с использованием лазерного конфокального микроскопа. Нормальные мышиные зонды IgG и GoldMag использовали в качестве отрицательного контроля.

Проточная цитометрия

Активность зонда HPA &GoldMag определяли методом проточной цитометрии. Клетки блокировали козьей сывороткой в ​​течение 1 ч. Затем клетки окрашивали пробой 10 мкг HPA и GoldMag или нормальным мышиным IgG и GoldMag при 4 ° C в течение ночи, промывали четыре раза PBS, а затем инкубировали с меченным FITC антителом против IgG мыши в течение 1 ч при 37 ° C. Клетки промывали PBS и измеряли интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитометра (Becton Dickinson).

Исследование магнитных наночастиц золота для магнитно-резонансной томографии in vitro

Раствор магнитных наночастиц золота (5 мг / мл) серийно разводили в два раза (1:20–1:1280) 1% -ным раствором агарозы. Отверждение растворов проводили в трубках EP. МР-сканирование выполняли с использованием 1% агарозного геля в качестве холостого контроля. Параметры сканирования:T1WI; TR600 мс / TE12 мс; толщина 2,0 мм; FOV, 150 мм; и T2WI; TR6000 мс / TE92 мс; толщина 2,0 мм; FOV, 150 мм. Молекулярные зонды HPA и GoldMag MR были сконструированы с использованием mAb HPA, меченных магнитными частицами золота 30 нм. Клетки обычно культивировали в 100-миллиметровых чашках для культивирования, затем к культурам клеток добавляли зонды HPA и GoldMag или отрицательные пробы IgG и GoldMag и инкубировали при 37 ° C в течение 90 мин. Несвязанные зонды блокировали добавлением соответствующего количества козьей сыворотки. После трехкратной промывки PBS клетки переваривали трипсином. Затем клетки собирали, смешивали с 1% раствором агарозы и переносили в пробирки ЕР объемом 1,5 мл. МРТ сканирование выполняли с использованием МРТ-сканера 3,0 Тл (параметры сканирования были такими же, как описано выше) с использованием специальной магнитно-резонансной катушки для животных. Перед сканированием мышей анестезировали 1% пентобарбиталом и помещали в планшет для сканирования.

Исследование магнитных наночастиц золота для магнитно-резонансной томографии in vivo

Самцам бестимусных мышей (26-30 г) в возрасте 4-6 недель вводили подкожно в бедро 200 мкл клеток MKN45. Каждой голой мыши вводили примерно 2,0 × 10 ⁶ клетки. Через 2 недели опухоли становятся видимыми и используются для МРТ. Перед инъекцией и через 2 ч после инъекции МРТ-сканирование проводилось с использованием МРТ-сканера 3,0 Тл. Параметры:T2WI, TR6000 мс / TE92 мс; толщина 1,5 мм; и FOV 120 мм. После этого были собраны ткани опухоли, селезенки, печени, почек, селезенки, сердца и легких для окрашивания берлинской синей Fe.

Статистический анализ

Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Анализ ANOVA проводили с использованием программного обеспечения SPSS13.0. А P значение <0,05 указывает на то, что разница была значительной.

Результаты

HPA по-разному экспрессируется в различных раковых клетках

Для проверки экспрессии Hpa в клетках HepG2, SGC-7901, MKN45, MCF-7, SW480 и U2OS использовали анализ вестерн-блоттинга и иммуногистохимического окрашивания. Результаты показали, что экспрессия Hpa была намного выше в клетках HepG2, SGC-7901, MKN45, SW480 и U2OS, тогда как гораздо более низкая экспрессия Hpa была обнаружена в клетках MCF-7 (рис. 1).

Экспрессия белков Hpa в различных клеточных линиях. а Вестерн-блоттинг использовали для определения экспрессии белка HPA (65 кДа) в различных линиях опухолевых клеток. Дорожка 1, HepG2; дорожка 2, SGC-7901; переулок 3, МКН45; полоса 4, MCF-7; дорожка 5, SW480; переулок 5, У2ОС. б Иммуногистохимический анализ экспрессии HPA в клеточных линиях HepG2, SGC-7901, MKN45, MCF-7, SW480 и U2OS

Создание и обнаружение молекулярного зонда HPA и GoldMag

Молекулярный зонд HPA и GoldMag был приготовлен путем связывания mAb HPA с магнитными наночастицами золота с использованием реакции связывания между поверхностями магнитных наночастиц золота. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) использовалась для непосредственного наблюдения за структурой поверхности зонда. Мы показали, что средний диаметр магнитных наночастиц золота составлял 13,78 нм без мечения моноклональными антителами HPA (рис. 2а); размеры частиц были однородными. После метки mAb HPA средний диаметр составлял приблизительно 24,80 нм (фиг. 2b). Эти результаты свидетельствуют о том, что магнитные наночастицы золота подходят для связывания с моноклональными антителами HPA.

а Модель связывания магнитных наночастиц золота с моноклональными антителами HPA. б Атомно-силовое сканирование магнитных наночастиц золота

Молекулярные зонды HPA и GoldMag могут специфически связываться с HPA

Сначала с помощью иммунофлуоресценции оценивали специфичность связывания молекулярного зонда и HPA. Результаты показали, что большое количество красной флуоресценции было обнаружено в цитоплазме клеток HepG2, MKN45, SW480 и U2OS, тогда как только небольшое количество красной флуоресценции было обнаружено в клетках MCF-7, а флуоресценция не была обнаружена в клетках HF. . Однако отрицательные мышиные IgG и GoldMag не показали взаимодействия с HPA ни в одной клеточной линии (рис. 3). Мы также использовали проточную цитометрию для проверки специфичности молекулярного зонда HPA и GoldMag. Мы показали отрицательный ответ в клетках HF и наблюдали 40% положительных показателей в клетках MCF-7 и 95% положительных показателей в клетках HepG2, SW480, U2OS и MKN45. Эти результаты показывают, что зонды могут специфически связываться с HPA, экспрессируемым в опухолевых клетках.

Специфичность и связывающая активность зонда определяют методами иммунофлуоресценции и проточной цитометрии. а Иммунофлуоресценцию проводили с использованием указанных зондов. б Проточная цитометрия использовалась для проверки специфичности молекулярного зонда HPA и GoldMag

МРТ датчиков HPA и GoldMag In Vitro

После серийного разбавления с использованием 1% агарозы МРТ наночастиц магнитного золота с использованием последовательности T2WI показала различное снижение сигнала. Сигнал T2WI при разведении 1:640 был намного ниже, чем у контрольного 1% агарозного геля ( P <0,05) (рис. 4а, б). Результаты показали, что магнитные наночастицы золота могут эффективно снижать МР-сигнал даже при низкой концентрации, что позволяет предположить, что магнитные наночастицы золота могут быть подходящими для молекулярной визуализации. Затем использовали молекулярные зонды HPA и GoldMag для мечения клеток HepG2, SGC7901, MKN45, SW480, U2OS, HF и MCF-7, которые затем смешивали с 1% агарозой и помещали в магнитный резонанс 3,0 Тл (рис. 4c). МР-сканирование с использованием последовательности T1WI (рис. 4c, d) или T2WI (рис. 4c, e) для осевого и коронарного сканирования. Результаты показали, что по сравнению с последовательностью T1WI, сигнал с использованием последовательности T2WI МР-сканирования был значительно снижен ( P <0,05), в то время как сигнал в клетках HF после мечения существенно не изменился ( P > 0,05), а сигнал в клетках MCF-7 после мечения был минимально снижен ( P <0,05).

а МРТ магнитных наночастиц золота после двух серийных разведений. б Диаграмма статистических результатов силы сигнала МР-визуализации двух серийно разведенных магнитных наночастиц золота. c МРТ всех клеток после мечения зондами. Дорожка 1, ВЧ; переулок 2, MCF-7; дорожка 3, HepG2; дорожка 4, SGC-7901; переулок 5, МКН45; дорожка 5, SW480; переулок 6, У2ОС. г Статистические результаты сравнения уровней сигнала от МРТ с использованием последовательности T1WI на клетках, помеченных зондами HPA и GoldMag. е Статистические результаты для уровней сигналов, обнаруженных с помощью МРТ с использованием последовательности T2WI на клетках, помеченных зондами HPA и GoldMag

МРТ датчиков HPA и GoldMag у голых мышей

Всех голых мышей анестезировали пентобарбиталом натрия в дозе 50 мг / кг. Молекулярный зонд вводили в хвостовую вену голых мышей, и МРТ проводили до и через 2 часа после введения. Поскольку зонд мог поглощаться макрофагами в легких и печени и выводиться почками, результаты сканирования показали, что после инъекции опухоль, печень, почка и легкие ткани у голых мышей имели значительно меньшие сигналы по сравнению с сигналами. которые были обнаружены перед инъекцией ( P < 0,05) (рис. 5).

а МРТ-изображение голых мышей до и через 2 часа после инъекции контрольных зондов или зондов HPA и GoldMag. Стрелкой указаны опухоли у мышей. б Сравнение уровней сигнала с МР-изображений с использованием T2WI до и после инъекции контрольных зондов или зондов HPA и GoldMag голым мышам. ^* P <0,01

Обсуждение

Инвазия и метастазирование опухоли - сложный биологический процесс, который приводит к плохому прогнозу опухолей. Таким образом, ранняя диагностика метастазов опухоли является важной стратегией при выборе стратегии клинического лечения. МРТ - полезный неинвазивный метод обнаружения опухолей; он обеспечивает многомерное высококонтрастное изображение тканей. Однако МРТ не может обнаружить опухоли небольшого размера, и для улучшения визуализации опухоли следует использовать высококонтрастные агенты, такие как металлические наночастицы (железо, золото и т. Д.) [18,19,20]. Разработка новых контрастных агентов на основе новых наноматериалов полезна для улучшения методов МРТ для раннего выявления рака. Среди средств визуализации суперпарамагнитная частица оксида железа (SPIO) используется в качестве обычного контрастного агента в МР-визуализации молекул, в которой магнитные наночастицы золота представляют собой суперпарамагнитные нанокомпозитные материалы с Fe ₃ О ₄ (ядра) / Au (оболочка) структура [21,22,23,24]. Суперпарамагнитные свойства неорганических наночастиц полезны для магнитно-резонансной томографии (МРТ) [25]. Комбинация этих наночастиц с тканеспецифическими агентами (антителами или низкомолекулярными веществами) позволяет точно обнаруживать и диагностировать опухоли. Многочисленные исследования показали, что HPA экспрессируется во многих опухолях, и уровень его экспрессии тесно связан с метастатическим потенциалом опухолей [26]. HPA может разрушить целостность ECM и BM через деградацию HSPG, который высвобождает активные молекулы, такие как bFGF, HGF и VEGF, заякоренные в ECM, тем самым способствуя прогрессированию опухоли [27,28,29,30]. Поскольку HPA в основном экспрессируется в опухолях средней и поздней стадии, наши предыдущие исследования показали, что HPA может использоваться в качестве обычного TAA для терапии опухолей [13,14,15]. Следовательно, HPA может быть потенциально полезной мишенью для молекулярной визуализации опухолей и терапии.

Магнитные наночастицы золота представляют собой суперпарамагнитные композитные наноматериалы с Fe ₃ О ₄ (ядро) / Au (оболочка), которые образуются при восстановлении Au ³⁺ гидрохлоридом гидроксиламина из суперпарамагнитного Fe ₃ О ₄ частицы [31, 32]. Поскольку метод маркировки довольно прост, их можно использовать для биологических применений, таких как селекция клеток, очистка белков, разделение нуклеиновых кислот и иммуноанализы. Следовательно, следуя установленной процедуре, мы смогли успешно приготовить и охарактеризовать покрытые золотом наночастицы оксида железа, связанные с антителами против HPA. В этом исследовании использовались частицы магнитного золота размером 30 нм, поскольку они намного более стабильны, чем частицы магнитного золота размером 50 нм. Один миллиграмм магнитных золотых частиц размером 30 нм может связываться примерно с 200 мкг mAb HPA. Наши данные показали, что использование магнитных наночастиц золота в разведении 1:640 (приблизительно 10 мкг) приводило к снижению передачи сигналов по сравнению с контрольной группой при 3,0 Тл МРТ-сканировании ( P < 0,05). Таким образом, можно рассчитать критическое значение для визуализации in vivo с использованием магнитных частиц золота.

Активность и специфичность зондов HPA mAb, связанных с магнитными золотыми наночастицами, впоследствии была обнаружена с помощью лазерной конфокальной микроскопии, проточной цитометрии и атомно-силовой микроскопии. Вкратце, зонд тестировали in vitro путем инкубации зонда-мишени и зонда отрицательного контроля с клетками HPA (+) и (-). Здесь клетки рака груди человека MCF-7 показали слабую экспрессию HPA, тогда как клетки MKN45, SW480, U2OS, HepG2 и SGC-7901 имели более высокую экспрессию HPA. Кроме того, нормальный мышиный IgG использовался в качестве контроля для моноклональных антител HPA, чтобы дополнительно подтвердить специфичность наночастиц.

После тестирования специфичности зонда in vitro , целевой и контрольный зонды вводили голым мышам подкожно, которым вводили клетки рака желудка MKN45 человека. Когда диаметр опухолевых тканей достигал 1 см, МРТ-сканирование проводилось с использованием камеры МРТ 3,0 Тл для обнаружения изменений сигнала в опухолях до и после инъекции зондами. Результаты сканирования показали, что сигналы опухоли были значительно уменьшены через 2 часа после введения зонда по сравнению с сигналами до введения зонда. Эти результаты продемонстрировали, что зонды HPA и GoldMag обладают превосходной иммунной активностью и лучшими эффектами у голых мышей, несущих клетки MKN45.

Выводы

Таким образом, мы продемонстрировали, что молекулярные зонды HPA и GoldMag, связанные с mAb HPA, обладают превосходными физическими и химическими свойствами. Зонд может специфически нацеливаться на многие опухолевые клетки, экспрессирующие высокий уровень HPA как in vitro, так и in vivo. Использование 3,0 Тл МРТ-сканирования показало, что зонды значительно снижают сигнал T2WI в опухолевых тканях; это может обеспечить экспериментальную основу для молекулярной визуализации метастазов опухоли.

Сокращения

AFM:

Микрофотография атомной силы

BM:

Базальная мембрана

CT:

Компьютерная томография

ECM:

Внеклеточный матрикс

HPA:

Гепараназа

HSPG:

Гепарансульфат протеогликан

МРТ:

Магнитно-резонансная томография

PVDF:

Поливинилидендифторид

TAA:

Опухолевый антиген