Функционализированные гиалуроновой кислотой Gd₂O₃ наночастицы: улучшение МРТ-направленной радиотерапии опухолей

Аннотация

Неточная локализация и внутренняя радиоустойчивость твердых опухолей серьезно препятствуют клинической реализации радиотерапии. В этом исследовании мы изготовили гиалуроновой кислотой функционализированные наночастицы оксида гадолиния (HA-Gd₂O₃ НЧ) через однокамерный гидротермальный процесс для эффективной магнитно-резонансной (МР) визуализации и радиосенсибилизации опухолей. Благодаря функционализации HA, полученные HA-Gd₂O₃ НЧ с диаметром 105 нм показали благоприятную диспергируемость в воде, низкую цитотоксичность и отличную биосовместимость и легко проникали в цитоплазму раковых клеток посредством HA-рецептор-опосредованного эндоцитоза. Важно, HA-Gd₂O₃ НЧ демонстрировали высокую продольную релаксативность (r₁) 6.0 мМ⁻¹с⁻¹ как МР контрастные агенты и радиосенсибилизацию в дозависящем режиме. Эти находки демонстрировали, что синтезированные HA-Gd₂O₃ НЧ как бифункциональные тераностические агенты имеют большой потенциал в диагностике и радиотерапии опухолей.

Введение

Радиотерапия широко применяется в онкологии, включающая высокоэнергетические рентгеновские лучи и депозицию доз облучения в местах опухолей путем вызова свободно-радикального повреждения или повреждения ДНК [1,2,3,4]. Однако низкая радиосенсибильность, неточность локализации опухоли и плохая дискриминация между поражениями и нормальными тканями, вызывающие побочные эффекты облучения, ограничивают клиническую реализацию радиотерапии [5]. Поэтому важно разработать методы для повышения радиочувствительности опухолей при минимизации системных побочных эффектов. Сочетание нанотехнологий и радиотерапии является устоявшимся приоритетом для радиосенсибилизации.

В последние годы нанотехнологии рассматривались как привлекательная стратегия для диагностики и терапии рака [6,7,8,9,10,11]. Одной из основных функций наночастиц (НЧ) является точная таргетированная доставка в опухоль на основе селективного накопления НЧ в опухолевых тканях через пассивную таргетизацию, эффект усиленного проникновения и удержания (EPR), активную таргетизацию и удлиненное время циркуляции [12,13,14]. Наша предыдущая работа демонстрировала, что легирование углеродных НЧ гетероатомами эффективно настраивает их внутренние свойства и вводит выгодные особенности [15,16,17]. Интересно, что НЧ могут использоваться как радиосенсибилизаторы [18]. Наночастицы тяжелых металлов (с высокими Z-элементами) (например, Au, Bi, Gd) как многообещающие радиосенсибилизаторы могут использоваться в радиосенсибилизирующей терапии из-за их высокого сечения захвата рентгеновских фотонов и эффекта Комптона [19]. Когда рентгеновские лучи взаимодействуют с высоко-Z наночастицами, выделяются Оже-электроны и фотоэлектроны, высвобождение вторичных электронов повреждает раковые клетки, обеспечивая усиление дозы во время радиотерапии [20]. На сегодняшний день гадолиний-базированные НЧ (GdНЧ) показаны как эффективные МР контрастные агенты (CA) [21, 22] и дифференцируют нормальные ткани от больных тканей и поражений неинвазивным способом и в реальном времени. Эти агенты сокращают продольное время релаксации, влияя на продольную релаксативность r₁ [23], и их неточная таргетизация часто приводит к побочным эффектам. Известно, что гиалуроновая кислота (HA) является основным лигандом и носителем доставки лекарств к местам с HA-рецепторами, такими как кластер дифференциации 44 (CD44) [24,25,26].

Основываясь на результатах предыдущих исследований, мы использовали HA как таргетирующий лиганд для функционализации Gd₂O₃ НЧ с двойной функцией: эффективные МР контрастные агенты таргетирования опухоли и радиосенсибилизаторы для преодоления врожденной радиоустойчивости и неточности локализации опухоли. Кроме того, HA-Gd₂O₃ НЧ демонстрируют высокую продольную релаксативность (r₁) как многообещающие МР образовывающие агенты с лучшим качеством МР изображения. По сравнению с доступными в настоящее время CA [27, 28], полученные HA-Gd₂O₃ НЧ показывают три значительных преимущества: во-первых, HA-Gd₂O₃ НЧ демонстрируют благоприятную биосовместимость благодаря использованию естественной внеклеточной матрицы как предшественников. Во-вторых, функционализация HA значительно улучшает таргетирование опухоли и снижает побочные эффекты. В-третьих, HA-Gd₂O₃ НЧ обладают бифункциональной способностью в диагностике и терапии. Для проверки эффективности и изучения механизма усиления радиосенсибилизации мы оценили радиосенсибилизирующий эффект HA-Gd₂O₃ НЧ на живучесть опухолевых клеток, клеточный цикл и апоптоз.

Результаты и обсуждение

Подготовка и характеристика HA-Gd₂O₃ НЧ

В этом исследовании HA-Gd₂O₃ НЧ успешно приготовлены с использованием простого гидротермального процесса, как показано на схеме 1. Размеры частиц анализировались динамическим световым рассеянием, в то время как морфологическое исследование проводилось передаточной электронной микроскопией. Как показано на рис. 1a, HA-Gd₂O₃ НЧ демонстрировали равномерную дисперсию и дискретные квазисферические формы без видимой агрегации. Средние диаметры HA-Gd₂O₃ НЧ составляли 105 нм. По сравнению с нормальными тканями, капиллярная эндотелиальная проницаемость опухолевых тканей была увеличена, а эндотелиальный зазор составлял 100–600 нм [29]. Следовательно, НЧ с желаемыми размерами легко проникали в опухолевые ткани и могут драматически увеличить эффективность пассивной таргетированной доставки лекарств.

Схематический синтез HA-Gd₂O₃ НЧ гидротермальным методом (A) и следующие биомедицинские применения (B).

Характеристика HA-Gd₂O₃ НЧ. Низкое (a) и высокое (b) увеличение ТЭМ изображений. Распределение диаметра (c) и XRD образы (d) HA-Gd₂O₃ НЧ.

Фазовая структура HA-Gd₂O₃ НЧ изучалась XRD с использованием графитового оксида (GO) порошка в качестве контроля. Как показано на рис. 1d, одна главная дифракционная пика (2θ = 12.04°) и две второстепенные пики (2θ = 29.6°, 42.1°) наблюдались в дифракционном образце HA-Gd₂O₃ НЧ, которые соответствовали характеристическим пикам GO (плоскость 100) и графита (плоскость 002) соответственно. Главное решетное расстояние HA-Gd₂O₃ НЧ показывало меньшее расстояние (0.73 нм, рассчитанное по формуле Брегга) чем расстояние GO d₀₀₁ = 0.85 нм, где восходящий сдвиг позиции пика может быть отнесен к уменьшению расстояния между sp³ слоями. Все широкие дифракционные пики демонстрировали, что HA-Gd₂O₃ НЧ имели аморфную структуру, что может быть отнесено к высоко неупорядоченному углероду и уменьшению sp² (C-C) слоевого расстояния в процессе карбонизации. Результат дополнительно указывал, что HA-Gd₂O₃ НЧ с плохой кристаллической природой обладали гетерогенной многослойной структурой, что согласуется с нашими предыдущими отчетами относительно углеродных точек [30, 31].

Химическая структура и поверхностный состав HA-Gd₂O₃ НЧ

Поверхностные функциональные группы и состав HA-Gd₂O₃ НЧ изучались с помощью фурье-преобразования инфракрасного спектра и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии. Как показано на рис. 2a, XPS спектр показывал четыре типичные пики при 284.0, 400.0, 530.6 и 1188.5 эВ, указывающие на то, что HA-Gd₂O₃ НЧ в основном состоят из гадолиния, углерода, кислорода и водорода. Высокое разрешение спектра Gd₃d (рис. 2b) раскрыло присутствие двух сильных пиков при 1187.5 эВ и 1221 эВ, соответствующих спин-орбитальному расщеплению 32 эВ, соответствующим соответственно 3d₅/₂ и 3d₃/₂ энергетическим уровням Gd. Эти наблюдения хорошо согласовывались с предыдущими отчетами HA-Gd₂O₃ НЧ. O (1s) спектр, показанный на рис. 2c, доминировал одной главной пикой, позиционированной при 531.4 эВ, которая соответствовала связи между O²⁻ и Gd³⁺. FTIR спектроскопия проводилась для голых и HA-Gd₂O₃ НЧ образцов (рис. 2d). Для голых образцов, как показано на рис. 2a, характерные поглотительные полосы ν_as O-C-O при 1580 и 1380 см⁻¹ раскрыли присутствие карбонатной группы. Широкие пики при 3340 и 2900 см⁻¹ отнесены к растягивающим вибрациям O-H и C-H соответственно, которые соответствовали поверхностно адсорбированной воде. Для HA-Gd₂O₃ НЧ растягивающие вибрации COO⁻ при 1580 и 1380 см⁻¹ были усилены, указывая на введение карбоксильной группы гиалуроновой кислоты. Эти результаты раскрыли, что функциональные группы HA-Gd₂O₃ НЧ в основном содержали определенные многочисленные карбонил, карбоксилат и гидроксил группы. Наличие этих функциональных групп, локализованных на поверхности, наделило HA-Gd₂O₃ НЧ отличной диспергируемостью в воде. Важно, что Gd ион, встроенный в поверхность НЧ, может быть полезен для МР визуализации и радиосенсибилизации, что драматически предотвратило утечку Gd иона в окружающую среду.

Химическая структура и состав HA-Gd₂O₃ НЧ. a Полный XPS спектр HA-Gd₂O₃ НЧ. b Gd₃d спектр. c O₁s спектр. d FTIR спектр HA-Gd₂O₃ НЧ.

Биосовместимость HA-Gd₂O₃ НЧ

Биосовместимость HA-Gd₂O₃ НЧ, как потенциальных биомедицинских агентов, критична для их биомедицинского применения. Во-первых, внутренняя цитотоксичность HA-Gd₂O₃ НЧ оценивалась в клетках HepG2 и VSMC с использованием CCK-8 анализа. Как показано на рис. 3a и Доп. рис. 1, HA-Gd₂O₃ НЧ не демонстрировали очевидной цитотоксичности до 3 дней. Даже при концентрации 200 мкг/мл после 24-часового воздействия живучесть клеток составляла примерно 90%. Во-вторых, гемокомпатибельность HA-Gd₂O₃ НЧ in vivo оценивалась с помощью гемолитического анализа. Как показано на рис. 3b, мы наблюдали гемолиз эритроцитов в воде (положительный контроль). Напротив, никакой очевидной гемолиз не наблюдался после инкубации HA-Gd₂O₃ НЧ при различных концентрациях от 0 до 200 мкг/мл в течение 2 часов, что было похоже на результаты для раствора ФСБ (отрицательный контроль). По сравнению с отрицательным контролем, процент гемолиза при различных концентрациях HA-Gd₂O₃ НЧ был слегка оценен на основе абсорбции супернатанта при 541 нм. Результаты показали, что проценты гемолиза HA-Gd₂O₃ НЧ были все менее 3% в изученном диапазоне концентраций, подтверждая их благоприятную гемокомпатибельность. Для изучения потенциальной токсичности HA-Gd₂O₃ НЧ внутривенно вводили бальб/с мышам (как видно в Доп. рис. 2). Через 1 неделю эти мыши были эвтаназированы, и мочевой пузырь, почки и селезенка собирались для патологоанатомического анализа. Как показано в Доп. рис. 2, результат патологоанатомических срезов показал, что не наблюдалось видимых поражений или воспалительного отклика в органах мышей, обработанных HA-Gd₂O₃ НЧ. Эти результаты четко указывали на то, что синтезированные HA-Gd₂O₃ НЧ имели благоприятную цитокомпатибельность и хорошую гемокомпатибельность.

a Влияние HA-Gd₂O₃ НЧ на живучесть клеток HepG2 и VSMC с использованием CCK-8 анализа. b Гемолитическая активность HA-Gd₂O₃ НЧ при различных концентрациях (50, 100, 200, 300 и 400 мкг/мл). ФСБ и вода использовались как отрицательный и положительный контроль соответственно.

МРТ фантомное исследование

Продольные (T₁) времена релаксации HA-Gd₂O₃ НЧ изучались in vitro вместе с коммерческим контрастом Magnevist (Gd-DTPA) в качестве контроля с использованием фосфатно-буферного раствора (pH = 7.4, 0.2 M). С увеличением концентраций Gd интенсивность сигнала T₁-взвешенных фантомных изображений четко увеличивалась, указывая на то, что все образцы могли генерировать МР контрастное усиление на T₁-взвешенных последовательностях (рис. 4a). Более того, графики интенсивности сигнала против времени инверсии давали T₁-времена релаксации каждого контрастного агента при специфических концентрациях. Как показано на рис. 4b, значение r₁ HA-Gd₂O₃ НЧ измерялось как 6.0 мМ⁻¹с⁻¹, что было значительно выше, чем у Magnevist (3.86 мМ⁻¹с⁻¹) при тех же условиях. Усиленное r₁ может быть отнесено к гораздо большему гидродинамическому радиусу и площади поверхности HA-Gd₂O₃ НЧ; следовательно, больше атомов Gd, залегированных в решетке НЧ, становились доступны для молекул воды, сокращая продольную релаксацию и усиливающее значение r₁.

a T₁ фантомные изображения HA-Gd₂O₃ НЧ с различными концентрациями общих ионов Gd. b Соответствующие графики 1/T₁ против концентраций общих ионов Gd. c In vivo T₁ МР визуализация и анализ мышей после внутривенного введения HA-Gd₂O₃ НЧ как контрастных агентов. d Квантификация изменений сигнала (SNR отношение) в мочевом пузыре и почках в различные временные точки после администрирования (n = 3). *p < 0.05.

МР визуализация In Vivo

Для определения потенциальных применений in vivo, производительность МР визуализации и судьба циркуляции HA-Gd₂O₃ НЧ (10 мг/кг) изучались с использованием МРТ сканера с нормальными мышами BALB/c в качестве модели. По сравнению с пред-инъекционными изображениями (рис. 4c), более яркие области почки и мочевого пузыря, обозначенные пунктирными кругами, четко наблюдались через 10 мин после инъекции, демонстрируя, что HA-Gd₂O₃ НЧ могли использоваться как CA усиления T₁ релаксации в этих основных органах in vivo. Важно, что контрастное усиление HA-Gd₂O₃ НЧ сохранялось до 60 мин после инъекции, что было намного дольше, чем у комплексов Gd малых молекул (период полураспада около нескольких минут у малых животных) [27], указывая на то, что HA-Gd₂O₃ НЧ обладали более длительным временем удержания in vivo, чем коммерческий контраст. Для количественного анализа МР контрастного эффекта мы рассчитали отношение сигнал/шум (SNR) тонким анализом областей интереса МР изображений и рассчитали значения SNR_post/SNR_pre для представления относительного усиления сигнала (RSE) (рис. 4d). Значения RSE HA-Gd₂O₃ НЧ в почке составляли 1.35, 1.99 и 1.86. Аналогично, значения RSE HA-Gd₂O₃ НЧ в мочевом пузыре были выше, чем в почке (1.29, 3.59 и 2.26). HA-Gd₂O₃ НЧ с большим размером (более 100 нм) демонстрировали длительное время циркуляции, затем могут быть элиминированы билиарно-кишечным путем согласно предыдущим результатам [32]. Более того, удлиненное время циркуляции in vivo могло повысить пассивную таргетизацию в опухолях за счет усиления EPR эффекта.

Визуализация опухоли

HA-Gd₂O₃ НЧ с отличной производительностью МР визуализации и длительным временем циркуляции предоставляют отличную возможность для визуализации опухолей через EPR эффект. Мы таким образом установили подкожные модели печеночной опухоли для изучения того, могут ли гепатоцеллюлярные карциномы (HCC) быть детектированы HA-Gd₂O₃ НЧ-усиленным МРТ. После внутривенного введения HA-Gd₂O₃ НЧ мы наблюдали, что подкожная область опухоли становится ярче окружающей ткани, как видно по корональным и трансверсальным сканированием (рис. 5a). RSE подкожной опухоли драматически достиг 1.54 и 1.83 с трансверсальным и корональным сканированием соответственно, указывая на эффективное накопление HA-Gd₂O₃ НЧ в области опухоли через EPR эффект. Эти находки демонстрируют, что HA-Gd₂O₃ НЧ высокочувствительны для МРТ визуализации опухолей. Многие исследования показывали, что длительное время циркуляции может повысить эффективность пассивной таргетизации через текучую васкулатуру твердых опухолей [33].

T₁-взвешенное МР изображение (a) и соответствующий количественный анализ (b) ксеногреффов печеночного рака мышей Heps после внутривенного введения HA-Gd₂O₃ НЧ.

Радиосенсибилизация HA-Gd₂O₃ НЧ

Отличная производительность HA-Gd₂O₃ НЧ как T₁ контрастного агента побудила нас определить его локализацию в радиосенсибилизации опухолей точно. Во-первых, происходило ли усиление дозы с этой комбинированной терапией изучалось с использованием CCK-8 анализа. Как изображено на рис. 6a, одиночные HA-Gd₂O₃ НЧ (концентрация 0–200 мкг/мл) не существенно влияли на живучесть HepG-2, но рентгеновское облучение (диапазон 0–9 Гр) снизило живучесть HepG-2 клеток до менее 70% при 9 Гр. Важно, комбинация рентгеновского облучения с HA-Gd₂O₃ НЧ драматически снизила живучесть HepG-2 клеток до менее 50%, особенно при концентрации 200 мкг/мл при 9 Гр. Далее, клоногенический анализ проводился для оценки живучести клеток в HepG-2 клетках после комбинации рентгеновского облучения и HA-Gd₂O₃ НЧ. Как показано на рис. 6b, одиночные HA-Gd₂O₃ НЧ не имели драматического влияния на формирование колоний HepG-2 клеток, но рентгеновское облучение снизило формирование колоний HepG-2 клеток до 46.7%. Однако лечение рентгеновским облучением и HA-Gd₂O₃ НЧ заметно ингибировало живучесть формирования колоний до 29.8%. Соответствующие изображения дополнительно подтвердили радиосенсибилизацию HA-Gd₂O₃ НЧ против HepG-2 клеток.

Радиосенсибилизирующий эффект HA-Gd₂O₃ НЧ in vitro. a Синергетический эффект HA-Gd₂O₃ НЧ (0 мкг/мл, 12.5 мкг/мл, 25 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл и 200 мкг/мл) и рентгеновского облучения (0 Гр, 3 Гр, 6 Гр и 9 Гр) на живучести HepG2 клеток с использованием CCK-8 анализа. *p < 0.05, **p < 0.01, разница была статистически значимой. b Анализ выживания колоний HepG2 клеток, обработанных HA-Gd₂O₃ НЧ и рентгеновским облучением и c соответствующий количественный анализ клоногенических способностей. d Кривые роста объема опухоли разных групп мышей после разных лечений. Группы: a контроль, b облучение, c HA-Gd₂O₃ НЧ, и d облучение + HA-Gd₂O₃ НЧ. e Фотографии опухолей, собранных из разных групп мышей в конце лечения.

Эффективность радиотерапии in vitro поощрила нас применить HA-Gd₂O₃ НЧ в комбинации с облучением для контроля роста опухолей у мышей-носителей опухолей. Объемы опухолей в контрольной и одиночной HA-Gd₂O₃ НЧ группах быстро росли и обе увеличились на 180%. По сравнению с одиночными облучающими лечениями 58%, HA-Gd₂O₃ НЧ в комбинации с облучением показали эффективное подавление опухоли на 38% после 10 дней облучения (рис. 6d). Опухоль фотографировалась, и средние объемы опухолей в каждой группе показали, что средний объем опухоли в группе (a) был наивысшим, в то время как в группе (d) был наименьшим среди всех групп (рис. 6e). Эти результаты раскрывают, что приготовленные HA-Gd₂O₃ НЧ многообещающи для ингибирования роста опухолей под рентгеновским облучением.

Анализ потоковой цитометрии и анализ живой/мертвой окраски проводились для дальнейшего понимания механизма радиосенсибилизации в комбинированном лечении HA-Gd₂O₃ НЧ и рентгеновского облучения. Как показано на рис. 7a, интенсивная зеленая флуоресценция без красной наблюдалась в HepG-2 клетках, обработанных одиночными HA-Gd₂O₃ НЧ, что подтвердило высокую живучесть клеток. Небольшое количество красной флуоресценции наблюдалось после лечения рентгеновским облучением, указывая на низкий уровень апоптоза клеток. Однако сильная красная флуоресценция наблюдалась после комбинированного лечения HA-Gd₂O₃ НЧ (200 мкг/мл) и облучения, демонстрируя, что HA-Gd₂O₃ НЧ могли драматически усилить апоптоз клеток, индуцированный рентгеновским облучением. Механизм радиосенсибилизации HA-Gd₂O₃ НЧ дополнительно изучался с помощью потоковой цитометрии. Как изображено на рис. 7b, одиночное облучение и HA-Gd₂O₃ НЧ индуцировали 27.55% и 19.12% ареста в фазе G2/M соответственно. Однако комбинированное лечение HA-Gd₂O₃ НЧ и облучения заметно увеличило арест в фазе G2/M, варьируя от 30.89 до 33.27% в дозависящем режиме. В то же время комбинированное лечение индуцировало апоптотическую гибель клеток от 10.63 до 22.67%, как отражено пропорциями sub-G1, когда одиночные HA-Gd₂O₃ НЧ и облучение индуцировали 3.02% и 13.87%. Для дальнейшего изучения возможного механизма гибели клеток метод Annexin V-EGFP/PI проводился потоковой цитометрией. Сигнал излучения Annexin V-EGFP наносился на ось x, в то время как сигнал излучения PI наносился на ось y (рис. 8). Количества некротических клеток, ранних апоптотических клеток, поздних апоптотических клеток и живых клеток определялись процентом Annexin V⁻/PI⁺ (Q3), Annexin V⁺/PI⁺ (Q2) и Annexin V⁻/PI⁻ (Q4) соответственно. Апоптотический процент клеток в контрольной группе и одиночной HA-Gd₂O₃ НЧ (100 мкг/мл) группе был менее 5%, что приводило к тонкому влиянию. По сравнению с одиночными группами облучения (8.8%), уровень апоптоза комбинации HA-Gd₂O₃ НЧ и облучения увеличивался с увеличением концентрации в диапазоне 50 до 200 мкг/мл. Особенно, уровень раннего апоптоза клеток очевидно увеличился до 33.2%, а ранний и поздний апоптоз достиг 44.3% при концентрации 200 мкг/мл. В целом, комбинация HA-Gd₂O₃ НЧ и рентгеновского облучения имела синергетический эффект на формирование колоний клеток, живучесть клеток в дозависящем режиме и эффект усиления радиосенсибилизации. Основываясь на этих результатах, HA-Gd₂O₃ НЧ могут быть эффективной альтернативой для усиления радиосенсибилизации для радиотерапии.

Усиление дозы облучения HA-Gd₂O₃ НЧ. a Окраска живых/мертвых клеток HepG2. Зеленый (флуоресцеин диацетат окраска) = живые клетки, красный (пропидиум иодид окраска) = мертвые клетки. Масштаб = 200 мкм. b Распределение клеточного цикла после разных лечений анализировалось путем квантования ДНК содержания с использованием анализа потоковой цитометрии.

Анализ апоптоза HA-Gd₂O₃ НЧ. a Уровни апоптоза HepG-2 клеток через 24 ч после лечения рентгеновским облучением. b Соответствующий количественный анализ.

Заключение

В заключении, мы разработали бифункциональные HA-Gd₂O₃ НЧ для эффективной МР визуализации и радиосенсибилизации опухолей в однокамерном гидротермальном процессе. После покрытия HA, синтезированные HA-Gd₂O₃ НЧ демонстрировали благоприятную диспергируемость в воде, отличную биосовместимость. Полученные HA-Gd₂O₃ НЧ, инкапсулирующие атомы Gd, не только эффективно демонстрировали высокую продольную релаксативность (r₁) для МРТ как T₁ контрастный агент, но и усивили радиочувствительность опухолей, индуцируя апоптоз клеток и блокируя клеточный цикл как радиосенсибилизатор. Таким образом, новые HA-Gd₂O₃ НЧ показывают многообещающий потенциал для диагностики и радиотерапии опухолей.

Материалы и методы

Материалы

Флуоресцеин диацетат (FDA) и пропидиум иодид (PI) приобретены у Sigma (Нью-Йорк, США). GdCl₃·6H₂O, этиленгликоль (99%) приобретены у Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (Ляньюньган, Цзянсу, Китай). Набор для подсчета клеток CCK-8 (CCK-8) куплен у Dojindo (Кумамото, Япония). NaH₂PO₄, Na₂HPO₄ и H₂SO₄ получены от Guangfu Fine Chemical Research Institute (Нанкай, Тяньцзинь, Китай). Фетальная телячья сыворотка и среда Дюльбекко минимального необходимого milieu (DMEM) приобретены у Invitrogen China Limited (Шанхай, Китай). Все химикаты были аналитического чистоты и использовались без дополнительной очистки.

Синтез HA-Gd₂O₃ НЧ

HA-Gd₂O₃ НЧ приготовлены однокамерным гидротермальным подходом следующим образом: Сначала 0.1 г HA растворяли в 20 мл воды под интенсивным перемешиванием при комнатной температуре на ночь. Затем 0.1 г GdCl₃·6H₂O и 0.5 мл NaOH (1 M) добавлялись соответственно. После этого смесь агитировалась еще 5 мин для формирования однородного прозрачного раствора и переносилась в 50-мл автоклав, герметизировался и гидротермально обрабатывался при 120 °C в течение 6 часов. После естественного охлаждения до комнатной температуры прозрачная суспензия фильтровалась через 0.22-мм мембрану для удаления любых крупных агломератов. Приготовленный раствор затем диализировался против воды в течение 3 дней в диализационном мешке с 14-кДа молекулярным отсечением. Диализационный раствор собирался и сублимировался с использованием вакуумного сублиматора. Порошки HA-Gd₂O₃ НЧ таким образом получались и сохранялись для дальнейшей характеристики.

Инструментация и характеристики

Морфологии HA-Gd₂O₃ НЧ изучались высокогоразрешающей передаточной электронной микроскопией на микроскопе JEM-2100 (JEOL, Токио, Япония) под ускоряющим напряжением 200 кВ. Элементный состав HA-Gd₂O₃ НЧ определялся XPS измерениями в MK II фотоэлектронном спектрометре, используя Al-Kα (1486.6 эВ) как рентгеновский источник и Фурье-преобразования инфракрасной (FTIR) спектрометром (Nicolet Nexus 470, GMI, Рамзи, MN, США). Кристаллическая структура HA-Gd₂O₃ НЧ характеризовалась через рентгеновскую дифракцию (XRD) образы на дифрактометре Rigaku-D/MAX2500 (Rigaku, Япония) с Cu Kα (λ = 0.15405 нм) излучением при скорости сканирования 4°/мин в диапазоне от 5 до 80°.

Анализ живучести клеток

Влияние HA-Gd₂O₃ НЧ на живучесть клеток изучалось через набор для подсчета клеток CCK-8 анализ (CCK-8 анализ). Клетки HepG2 (человечный гепатоцеллюлярный карцинома, ATCC номер: HB-8065) и VSMC (сосудистые гладкомышечные клетки) посеивались в 96-колодчатую пластинку при плотности 3 × 10³ клеток/колодца и культивировались при 37 °C в 5% CO₂ инкубаторе 24 ч, затем с использованием DMEM, содержащего различные концентрации HA-Gd₂O₃ НЧ (0 мкг/мл, 25 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл и 200 мкг/мл) заменяли среду роста. После инкубации еще 4 ч, добавляли 10 мкл CCK-8 раствора в каждый колодец, клетки инкубировали 4 ч в темном месте. Абсорбция измерялась при 490 нм с использованием Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader (Bio Tek, Винуски, VT, США). Необработанные клетки (в DMEM) использовались как контроль, и относительная живучесть клеток (среднее SD, n = 5) выражалась как Abs_образец/Abs_контроль × 100%.

Гемолитический анализ

Кратко, 19–21 г, возраста 6-недельных самок мышей BALB/c были любезно подготовлены по Правилам управления животными Министерства здравоохранения КНР. Три миллилитра крови, стабилизированной гепарином натрием, получали удалением глазных яблок. Затем она центрифугировалась для удаления супернатанта при 1200 об/мин, 15 мин согласно литературе. После этого осадок промывали ФСБ пять раз для получения эритроцитов мыши (MRBCs), затем забирали около 3 мл крови удалением глазного яблока, стабилизированной гепарином натрием, центрифугировали (1200 об/мин, 15 мин) для удаления супернатанта согласно литературе [27], промывали ФСБ пять раз для получения MRBCs. Разреждали десять раз с ФСБ, 0.1 мл MRBCs переносили в 1.5 мл пробирки, предзаполненные 0.9 мл ФСБ, содержащие различные концентрации частиц (50–200 мкг/мл) HA-Gd₂O₃ НЧ, 0.9 мл воды (как положительный контроль) и 0.9 мл ФСБ (как отрицательный контроль) соответственно. Смесь инкубировалась 2 ч при комнатной температуре после легкого перемешивания, затем центрифугировалась на 12 000 об/мин 1 мин. Наконец, фотографии всех образцов делались и абсорбция супернатанта (гемоглобина) измерялась UV-2450 UV-Vis спектрофотометром. Проценты гемолиза различных образцов рассчитывались делением разницы в абсорбции между образцом, положительным и отрицательным контролем при 541 нм.

МР фантомное исследование In Vitro и In Vivo

In vitro и in vivo МР изображения получались на 3 Тесла МРТ сканере (Magnetom Trio Tim, Siemens, Германия). Для изучения T₁ фантомных изображений in vitro, раствор HA-Gd₂O₃ НЧ с различными концентрациями от 0 до 16 мМ добавлялся в 96-колодчатую культуральную пластинку, используя Magnevist (коммерческий МР контрастный агент, Gd-DTPA) как контроль. Для МР визуализации in vivo мы выбирали нормальных мышей BALB/c как модель (n = 4). Животноводческие эксперименты строго соответствовали Правилам управления животными Министерства здравоохранения КНР. Десять миллиграмм на килограмм HA-Gd₂O₃ НЧ, фильтрованные через стерильные мембранные фильтры (размер поры 0.22 мкм), внутривенно вводились животным, затем немедленно исследовались с МРТ сканером. Эти образцы для МР визуализации in vitro и животные in vivo изображались со следующими параметрами: TR/TE = 300/10 мс, 256 × 256 матриц, срезы = 5, толщина = 2 мм, усреднения = 2, FOV = 80 × 80.

Радиосенсибилизация In Vitro

CCK-8 анализ использовался для оценки радиосенсибилизирующей активности HA-Gd₂O₃ НЧ in vitro. Клетки посеивались в пять 96-колодчатых пластинок при плотности 3 × 10³ клеток/колодец, и каждая пластинка обрабатывалась в одинаковых условиях: культивировалась при 37 °C в 5% CO₂ инкубаторе 24 ч, затем с использованием DMEM, содержащего различные концентрации HA-Gd₂O₃ НЧ (0 мкг/мл, 12.5 мкг/мл, 25 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл и 200 мкг/мл) заменяли среду роста. После инкубации 4 ч, пять пластинок облучались при различных дозах рентгена (0 Гр, 3 Гр, 6 Гр и 9 Гр), 300 сГр/мин соответственно. После облучения все пластинки инкубировались 4 ч, затем измеряли абсорбцию под теми же параметрами.

Клоногенический выживаемости анализ также проводился для изучения радиосенсибилизации in vitro. Клетки HepG2 посеивались в шестиколодчатые пластинки при 4.0 × 10⁴ клеток/колодец и позволяли расти 16 ч. Клетки инкубировались с HA-Gd₂O₃ НЧ, разбавленными в клеточной культуре среды 6 ч. Клетки затем облучались при 6 Гр с использованием клинического линейного ускорителя (Oncor, Siemens, Германия) с 6 МэВ облучением используя 10 см × 10 см облучающее поле при расстоянии источник-кожа (SSD) 100 см для покрытия всех клеток. Затем эти облученные клетки позволяли расти 14 дней, фиксировались 4% параформальдегидом при комнатной температуре 40 мин, окрашивались 1% кристаллическим фиолетовым после промывки клеток.

Анализ живой/мертвой окраски и потоковая цитометрия

Для изучения радиосенсибилизирующего эффекта HA-Gd₂O₃ НЧ, клетки HepG2 посеивались в шестиколодчатые пластинки при плотности 4.0 × 10⁴ клеток/колодец и позволяли расти 12 ч и устанавливали шесть групп (контроль, HA-Gd₂O₃ НЧ, облучение, облучение + 50 мкг/мл HA-Gd₂O₃ НЧ, облучение + 100 мкг/мл HA-Gd₂O₃ НЧ и облучение + 200 мкг/мл HA-Gd₂O₃ НЧ). Когда клетки росли до 80% в пластинках, первая группа не имела лечения, вторая группа инкубировалась с 100 мкг/мл HA-Gd₂O₃ НЧ 24 ч, третья группа просто облучалась, а четвертая до шестой группы облучались и инкубировались с различными концентрациями HA-Gd₂O₃ НЧ (50, 100 и 200 мкг/мл) 24 ч соответственно. После этого рабочие буферы FDA и PI добавлялись для окраски клеток. Флуоресценция окрашенных клеток наблюдалась под флуоресцентным микроскопом (×20), живые клетки показывали зеленый цвет, мертвые — красный. Кроме того, клетки разными лечениями промывались три раза ФСБ, дигестировались, собирались и центрифугировались на скорости 2000 об/мин 5 мин, затем фиксировались 70% этанолом при −20 °C на ночь с последующей PI окраской. Фрагментация ДНК kvantифицировалась интенсивностью флуоресценции PI на потоковом цитометре (BD, Accuri, C6BD, Accuri, C6), анализировалась программным обеспечением (FLOWJO 7.6.2) для прояснения распределения клеточного цикла.

Радиосенсибилизация In Vivo

Самки мышей BALB/c с массой тела 19–21 г и возрастом 6 недель получены от Лабораторного животного центра Янчжоуского университета под стандартными условиями. Животноводческие эксперименты соответствовали Правилам управления животными Министерства здравоохранения КНР. Подкожная модель опухоли устанавливалась следующими процедурами: Сначала 1 × 10⁶ клеток HepS инокулировали в брюшную полость мышей, асцит собирали через 5 дней. Затем этот асцит инъецировали подкожно. Когда размеры опухоли достигали примерно 100 мм³, подкожные модели опухолей устанавливались и применялись к следующим экспериментам.

Восемь мышей с подкожными опухолями на группу лечались облучением 3 Гр на фракцию до общей дозы 9 Гр в течение 7 дней. Радиотерапия проводилась через 3 ч после внутривенного введения HA-Gd₂O₃ НЧ (10 мг/кг), на клиническом линейном ускорителе Siemens Primus (6 МэВ) используя самодельное устройство для покрытия всей опухоли. Эти мыши анестезировали 1% пентобарбиталем (50 мг/кг) для обеспечения неподвижности во время облучения. Объем измерялся и записывался каждый день, определялся измерениями штангенциркуля и рассчитывался формулой: V = 0.5 × a × b², где V (мм³) — объем опухоли, a (мм) и b (мм) — длина и ширина опухоли соответственно. Относительные объемы опухолей нормализовывались к их начальным размерам. Каждая группа проводилась на восьми мышах, где статистический анализ выполнялся двуххвостым t-тестом Стьюдента (*p < 0.05, **p < 0.001).

Доступность данных и материалов

Наборы данных, поддерживающие результаты этой статьи, включены в статью.