Пути апоптоза определяют цитотоксичность свежих и старых наночастиц оксида цинка

Аннотация

Наночастицы оксида цинка (ZnO NPs) используются в широком спектре приложений, включая промышленность, коммерческие продукты и медицину. Многочисленные механистические исследования токсичности ZnO NPs проводились на pristine (свежих) NPs. Однако цитотоксичность, индуцируемая трансформированными (старыми) ZnO NPs, и лежащие в основе механизмы остаются неясными. Здесь мы наблюдали физико-химическое преобразование ZnO NPs во времени, за которым последовала оценка цитотоксичности свежих и старых NPs. Мы обнаружили, что свежие ZnO NPs индуцируют более высокий уровень апоптоза, чем их старые аналоги. Соответственно, данные РНК-секвенирования от старых ZnO NP-обработанных человеко-хомячьих гибридных (A_L) клеток показали, что p53, PI3k-Akt, FoXO, Глутатион, ErbB, HIF-1, Окситоцин и Jak-STAT сигнальные пути были обогащены, но не апоптотический путь. Результаты количественного ПЦР раскрыли значительно более высокий уровень мРНК IL1B и CD69 в группах, обработанных свежими NPs, по сравнению со старыми ZnO NP- и хлоридом цинка-обработанными группами. Вышеуказанные результаты указывали на то, что более низкая цитотоксичность старых ZnO NPs частично обусловлена их сниженной способностью индуцировать апоптоз. Транскрипционная регуляция множественных сигнальных путей, активированных старыми NPs, может помочь в установлении клеточной гомеостаза. В совокупности наши находки подчеркивают влияние процесса старения (экологической трансформации) ZnO NPs на их токсичность и биологические последствия.

Введение

С быстрым развитием нанотехнологий за последние десятилетия наночастицы (NPs) применялись в различных областях, включая промышленность, повседневную жизнь людей и наномедицину [1, 2]. Инвентарь нанопродуктов для потребителей (CPI) показывает 30-кратный рост между 2005 и 2015 годами в количестве нанопродуктов, включая 762 продукта для здоровья (фитнеса), 72 продукта питания (напитков) и 23 детских продукта [2]. Растущее применение NPs в потребительских продуктах и различных сферах увеличило вероятность попадания NPs в окружающую среду, что вызывает опасения по поводу их потенциальных неблагоприятных воздействий. Наночастицы оксида цинка (ZnO) среди наиболее часто используемых NPs, и их глобальный годовой выпуск достиг почти 3400 тонн [3, 4]. Некоторые вещества, ранее считавшиеся биологически инертными, могут стать токсичными в наночастичном состоянии. Растущее число исследований прояснило, что ZnO NPs могут представлять значительные риски для млекопитающих клеток и животных, индуцируя значительную токсичность [5–7].

Различные стратегии, включая покрытие, поверхностную функционализацию и модификацию состояния окисления, использовались для ослабления потенциальной токсичности NPs путем модификации их физико-химических свойств (таких как растворение, агломерация и пертурбация клеточных мембран) [8–11]. Хотя эти модификации NPs ослабляют их токсические эффекты в определенной степени, использование NPs не всегда безопасно, особенно при определенных условиях воздействия и окружающей среде [12–14]. Фактически, многие виды NPs нестабильны и склонны подвергаться «старению» или «экологической трансформации» после намеренного или непреднамеренного выпуска в природную среду [14–17]. В последние годы много работ проводилось для изучения процесса экологической трансформации NPs; однако исследования токсических эффектов «трансформированных (старых)» NPs все еще очень ограничены, не говоря уже о их токсических механизмах.

Как типичный представитель неперсистентных NPs, ZnO NPs имеют очень высокую реактивность и склонны трансформироваться в физико-химических свойствах и состоянии возникновения после выпуска в окружающую среду или попадания в животных, что может значительно влиять на их токсикологические эффекты [17, 18]. Например, исследования показали, что процесс сульфидирования ZnO NPs меняет заряд, гидрофобность и состояние агломерации, приводя к адсорбции сульфидных NPs в человеческой слюне,поте и бронхоальвеолярном промывном жидкости. Более того, белок, адсорбированный ZnO NPs, формирует особую белковую корону, которая обычно влияет на его биологический эффект [19]. Фосфаты в физиологических растворах могут конвертировать ZnO NPs в метастабильные ZnHPO₄ и Zn₃(PO₄)₂ в течение примерно 5–10 ч [20]. Процесс полной трансформации ZnO NPs (≤ 3 мкг/мл) в in vitro системе воздействия на человеческие Т-лимфоциты (37 °C, культуральная среда RPMI1640 с 10% FBS 24 ч) изучался с использованием синхроtronного рентгеновского поглощения ближней к краю структуры (XANES) [21]. Вышеуказанные исследования указывают на недооценку экологических и рисков для здоровья ZnO NPs при исключительной оценке биологических эффектов pristine (свежих) ZnO NPs. В свете этой проблемы существует срочная необходимость комплексно понять процессы старения и экологической трансформации NPs [22].

Наше предыдущее исследование раскрыло, что ZnO NPs, старевшие 40–120 дней в ультрачистой воде, проходят физико-химическую трансформацию и превращаются в Zn₅(CO₃)₂(OH)₆, Zn(OH)₂ и Zn²⁺ [23]. Интересно, старые ZnO NPs демонстрировали более низкую цитотоксичность, чем их свежие аналоги [23], однако механизмы токсичности такого вариации остаются неясными. В настоящем исследовании мы вышли на исследование глубоких причин различных цитотоксичностей между свежими и старыми ZnO NPs. ZnO NPs с двумя разными размерами частиц (20 нм и 90–200 нм) применялись системно. Цитотоксические тесты продемонстрировали, что старые ZnO NPs индуцировали менее выраженные морфологические аномалии и относительно более высокую живучесть клеток, чем их свежие аналоги. Данные РНК-секвенирования раскрыли, что апоптотические гены были обогащены в клетках, обработанных свежими ZnO NPs, тогда как эти гены были гораздо менее затронуты обработкой старыми ZnO NPs. Кроме того, клетки, подвергшиеся воздействию старых ZnO NPs, показывали сниженный уровень кливированного Каспазы-3 белка, что дополнительно указывает на более высокую потенцию свежих ZnO NPs в вызове апоптоза в культивируемых клетках. В сочетании с нашими предыдущими находками, данное исследование предполагает, что сниженная цитотоксичность старых ZnO NPs обусловлена их ослабленной способностью запускать клеточный апоптоз.

Материалы и методы

Наночастицы и реактивы

Коммерчески доступные нанопорошки ZnO (ZnO NPs), с заявленным производителем средним размером 20 нм (99,5% чистоты, почти сферические) и 90–200 нм (99,9% чистоты, неправильная морфология), приобретены у Nanostructured & Amorphous Materials (Хьюстон, TX). За исключением особо оговоренного, все реактивы и химикаты, использованные в данном исследовании, приобретены у Sigma-Aldrich (Шанхай, Китай).

Диспергирование, старение и характеризация наночастиц

Стоковые суспензии ZnO NPs (1 мг/мл) готовились взвешиванием сухих нанопорошков в Milli-Q H₂O (Millipore, 18 МОм·см) и стерилизации автоклавированием (120 °C, 30 мин), затем хранились при 25 °C для естественного старения в периоде от 0 до 60 дней. 0- и 60-дневные естественно трансформированные ZnO NPs обозначены как свежие и старые NPs соответственно. Для обеспечения надлежащей дисперсии свежие и старые суспензии ультразвуково обрабатывались (100 Вт) 30 мин в ультразвуковой ванне перед характеризацией или инкубацией с клетками. Морфология, размер частиц и агломерация свежих и старых ZnO NPs характеризовались с использованием передаточной электронной микроскопии (TEM, JEOL JEM-2010, Токио, Япония). Кристаллическая структура свежих и старых ZnO NPs определялась с использованием порошковой рентгеновской дифракции (XRD, PANalytical B.V., Шанхай, Китай) путем сравнения с auténtными стандартами. Детали процесса естественного старения и характеризации ZnO NPs описаны ранее [23].

Клеточная культура и обработка ZnO NPs

Клеточная линия A_L, вид человеко-хомячьих гибридных клеток, образованных путем fusión мутанта gly2A китайской яйцеклеточной опухоли (CHO) и человеческих фибробластов, использовалась в данном исследовании. Эти гибридные клетки содержали стандартный набор хромосом CHO-K1 и одну копию человеской хромосомы 11 и культивировались в среде Ham's F12 (Hyclone, Grand Island, NY) с добавлением фетальной бычьей сыворотки (8%, Hyclone, Grand Island, NY), гентамицина (25 мкг/мл) и глицина (2 × 10⁻⁴ М) при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂ [24]. Стоковые суспензии свежих и старых ZnO NPs диспергировали 30-минутной ультразвуковой обработкой (100 Вт) для предотвращения агломерации, затем разбавляли до соответствующих концентраций культурной средой для воздействия на клетки. Клетки, содержащиеся в культурной среде без NPs, служили контролем в каждом эксперименте.

Тест для определения цитотоксичности

Клетки A_L в логарифмической фазе роста культивировали на стеклянных слайдах в 35-мм Петриевых чашках (6 × 10⁴ клеток/чашка) 24 ч перед стимуляцией, затем обрабатывали 2 мл культурной среды, содержащей 1, 5, 10, 12, 15 и 20 мкг/мл свежих или старых ZnO NPs 72 ч. После завершения времени обработки изображения морфологии клеток получали с использованием микроскопа Leica DM4B (Leica, Германия). ZnCl₂ включали как референс цинковых ионов для сравнения цитотоксичности с ZnO NPs.

Набор для подсчета клеток (CCK-8) (APExBIO, Шанхай, Китай) использовался для определения живучести клеток. В деталях, клетки A_L посевали в 96-однобортовую пластинку (4 × 10³ клеток/ячейку) с культурной средой 24 ч и обрабатывали средой, содержащей различные концентрации ZnCl₂, свежих и старых ZnO NPs 24, 48 и 72 ч соответственно. Для рабочего раствора объем добавленных NPs из стоковой суспензии был менее 5% от общего объема культурной среды в каждой ячейке. После завершения времени обработки культурная среда аспирировала, и клетки инкубировали с 100 мкл рабочего раствора CCK-8 2 ч при 37 °C согласно инструкциям производителя. Затем абсорбция записывалась при 450 нм с использованием флуоресцентного считывателя Spectra Max M2 (Molecular Devices, Wokingham, Berks, UK). Жизнеспособность клеток рассчитывалась как процент абсорбции в ячейках, с каждой концентрацией NPs, нормализованной к абсорбции контрольных клеток (100%).

Извлечение РНК, обратная транскрипция и количественный ПЦР

Клетки A_L в логарифмической фазе роста посевали в 35-мм Петриевые чашки (6 × 10⁴ клеток/чашка) с культурной средой 24 ч. Затем среда заменяли на 2 мл культурной среды, содержащей 12 мкг/мл ZnCl₂, свежих и старых ZnO NPs 72 ч. После завершения времени обработки культурная среда аспирировала, и клетки промывали 3 раза PBS. Затем 1 мл реактива Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) добавляли в каждую чашку для извлечения общей РНК согласно инструкциям производителя. Концентрация и чистота общей РНК после извлечения количественно определялись с использованием спектрофотометра Q5000 UV-Vis (Quawell, США). После квантования обратная транскрипция выполнялась с использованием набора TransGene RT-PCR (TransGene Biotech, Пекин, Китай) для получения цДНК из РНК матрицы согласно протоколам производителя. Полученные образцы цДНК количественно определялись с использованием Q5000 UV-Vis спектрофотометра и затем анализировались с использованием SYBR-Green в качестве флуоресцентного красителя (TransGene Biotech, Пекин, Китай) на системе Roche RT-PCR (Applied Biosystems) [25].

Ген доместика, кодирующий глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу (Gapdh), использовался как внутренний контроль для оценки экспрессии мРНК Il-1α, Il-1β, Caspase 3, CD69, Jun и MT1. Результаты выражались как относительное соотношение экспрессии между целевым геном и Gapdh. Последовательности праймеров, использованных в данном исследовании, приведены в Таблице 1.

Анализ данных РНК-секвенирования

Общие РНК образцы клеток A_L из контрольной группы, группы, обработанной старыми ZnO NPs, и группы, обработанной ZnCl₂, секвенировались в BangFei Bioscience (Пекин, Китай). Вкратце, общая РНК клеток A_L извлекалась по протоколам TRIZOL до изопропанолового осаждения. Затем РНК образцы ресуспендировали в экстракционном буфере перед секвенированием. Сырые счетные данные РНК-секвенирования анализировались с использованием R пакета Deseq2 [Eric1]. Венн-диаграмма генерировалась пакетом R VennDiagram [Eric1.2]. Значимо изменившиеся гены использовались для дальнейшего анализа обогащения путей. Эксперименты проводились в трех независимых репликах. РРНК гены, митохондриальные гены и гены, детектированные менее 40 нуклеотидов, исключались из анализа.

Данные РНК-секвенирования, референсные серии GSE97852, GSE60159 и GSE39444, получены из Gene Expression Omnibus [Eric 2, 3, 4]. График анализа обогащения набора генов (GSEA) генерировался R (версия 3.6.2) с использованием пакета fgsea [Eric 5]. Апоптотические гены с 1,5-кратным значимым изменением и p-значением < 0,05 использовались для дальнейшего анализа. Тепловая карта с деревом генов генерировалась пакетом R "ComplexHeatmap" [Eric 6]. Метод средней связи использовался как метод кластеризации, и Евклидово расстояние использовалось как мера расстояния. Анализ обогащения путей проводился с использованием STRING2.0 [Eric 7].

Вестерн-блоттинг

Клетки A_L в логарифмической фазе роста посевали в 60-мм Петриевые чашки (1,5 × 10⁵ клеток/чашка) с культурной средой 24 ч. Затем среда заменяли на 4 мл культурной среды, содержащей 12 мкг/мл свежих или старых ZnO NPs 24 ч. В конце периода воздействия культурная среда аспирировала, затем клетки промывали 3 раза PBS и лизировали на льду RIPA лизис-буфером (Beyotime, Китай) для сбора клеточных белков. Равные количества клеточных белков разделяли на 12% SDS-PAGE гелях, затем переносили на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану (Roche, Швейцария). Вкратце, после 2-часовой блокировки 5% обезжиренным молоком в TBST при 25 °C, мембраны последовательно инкубировали с первичным антителом при соответствующих разбавлениях (согласно протоколам производителя) при 4 °C на ночь, затем инкубировали с HRP-конъюгированными вторичными антителами (1:5000, Promega, Мадисон, США) 2 ч при 25 °C. Наконец, иммуномаркировка детектировалась с использованием усиленной химилюминесценции (ECL) (BOSTER, Китай) раствора. Первичные антитела анти-про/кливированная Каспаза-3 и анти-Актин приобретались у Cell Signaling Technology и ImmunoWay соответственно.

Статистика

Статистический анализ составлялся на основе средних значений результатов, полученных из минимум трех независимых экспериментов. Все данные представлялись как средние ± стандартное отклонение (SD) и статистически сравнивались с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA). Во всех графиках p-значения < 0,05 показывались как * и считались статистически значимыми.

Результаты

Характеризация ZnO NPs

Для определения различий в детальных физико-химических характеристиках между свежими и старыми ZnO NPs мы сначала наблюдали морфологию NPs с помощью TEM (Рис. 1A). Наши результаты указали, что 20 нм свежие ZnO NPs были почти сферическими кристаллами, а 90–200 нм свежие ZnO NPs — неправильно стержнеобразными/кубическими кристаллами. Размер отдельной частицы соответствовал размеру, указанному производителем. Очевидно, что и 20 нм, и 90–200 нм ZnO NPs склонны агломерации в ультрачистой воде. Кроме того, независимо от формы и размера исходных NPs, микроструктура и 20 нм, и 90–200 нм ZnO NPs драматически изменилась от четкой кристаллической структуры к аморфной или пластинчато/игольчатому состоянию после старения 60 дней. Более того, кристаллическая природа и фазовая чистота как свежих, так и старых NPs определялись с использованием рентгеновской дифракции (XRD) с Cu Kα излучением (λ = 0,15418 нм) при 25 °C, как показано на Рис. 1B. XRD картина свежих ZnO NPs указывала, что образцы состояли из кристаллическойюрцитовой структуры и не были идентифицированы характерные примесные пики, предполагая высокое качество свежих NPs. Для старых NPs XRD картина демонстрировала новообразование твердых фаз Zn₅(CO₃)₂(OH)₆ (номер карты 00-011-0287) и Zn(OH)₂ (номер карты 00-003-0888), указывая на химическую трансформацию ZnO NPs (20 и 90–200 нм) в процессе старения.

Морфологическое наблюдение клеток A_L, подвергшихся воздействию свежих и старых ZnO NPs

Обработка NPs приводит к заметному изменению клеточной формы или морфологии in vitro [26]. Поэтому клетки A_L, подвергшиеся воздействию свежих или старых ZnO NPs при 10 и 15 мкг/мл 72 ч, изучали под стереоскопическим микроскопом. Как показано на Рис. 2, морфология клеток в контрольной группе оставалась нормальной. Клетки хорошо адгерировали, большинство прикреплялось в течение 2 ч. Большинство клеток были مغزلовидными или полигональными, с небольшим количеством вновь делящихся клеток, показывающих более прозрачный цитоплазму и лучшую дисперсию в процессе адгезии. Обработка 12 мкг/мл свежими ZnO NPs (20 нм и 90–200 нм) 72 ч значительно изменила морфологию клеток. Хотя большинство клеток адгерировали в течение 3–5 ч, они не могли хорошо растечься, и некоторые клетки стали округлыми и потеряли полигональную форму. Когда концентрация ZnO NPs увеличивалась до 15 мкг/мл, обработанные клетки атробировали и не могли адгерировать, указывая на их значительно более низкую живучесть, чем клетки, обработанные 10 мкг/мл. Эти результаты указывали на то, что LC100 для свежих ZnO NPs, вероятно, меньше 15 мкг/мл при 72-часовой обработке. В противовес, морфология клеток в группах, обработанных 20 нм и 90–200 нм старыми NPs (15 мкг/мл), не была значительно затронута, и большинство выживших клеток могли адгерировать и растечься, с менее чем половиной мертвых клеток, обнаруживая, что старые ZnO NPs намного менее цитотоксичны, чем свежие ZnO NPs.

Старые ZnO NPs индуцировали более низкую цитотоксичность, чем свежие NPs

Для дальнейшего исследования разницы в цитотоксичности между свежими и старыми ZnO NPs мы изучали живучесть клеток с использованием наборов CCK-8. Как показано на Рис. 3, инкубация клеток A_L с градиентными дозами свежих и старых ZnO NPs (от 0 до 20 мкг/мл, 20 нм и 90–200 нм) 24 ч, 48 ч или 72 ч показала дозо-зависимое снижение живучести. Никакой очевидной цитотоксичности не наблюдалось при обработке клеток ZnO NPs ≤ 10 мкг/мл. Когда дозировка свежих и старых ZnO NPs повышалась до 12 и 15 мкг/мл, живучесть клеток показывала временно-зависимую убывающую тенденцию. Очевидно, живучесть клеток в группах, обработанных старыми NPs, была значительно выше, чем в группах, обработанных свежими NPs. Кроме того, обработка ZnCl₂ также снижала живучесть клеток дозо- и временно-зависимым образом, тогда как цитотоксичность ZnCl₂ была намного меньше, чем у свежих и старых ZnO NPs.

Обработка свежими ZnO NPs активировала апоптотические пути и повысила экспрессию апоптотических генов

Для раскрытия базовых механизмов, приводящих к более низкой цитотоксичности старых NPs, мы анализировали данные РНК-секвенирования от свежих и старых ZnO NPs. Как показано на Рис. 4A, B, после обработки свежими ZnO NPs апоптотический путь активировался в клетках Jurkat (p = 0,017) и HMDM (p = 0,041). Апоптотические гены: ANXA1, CYLD, TNFSF10, IER3, CDKN1A, JUN, SAT1, PMAIP1, CD38 и ISG20 были значительно обогащены в клетках Jurkat, обработанных свежими ZnO NPs. Апоптотические гены: CD38, TNFRSF12A, CCNA1, BMP2, PPP2R5B, EREG, IFNGR1, CD44, CD14, GNA15, GCH1, TIMP1, BTG2, IL1B, IL1A, BTG3, BCL2L11, SC5D и SPTAN1 были значительно обогащены в клетках HMDM, обработанных свежими ZnO NPs (Рис. 4C, D). Поскольку клетки Jurkat (периферические Т-лимфоциты) и HMDM (человеческие моноцит-производные макрофаги) — разные типы клеток, способ, которым они запускают апоптоз, может отличаться. В сумме, эти результаты показали, что воздействие свежими ZnO NPs могло активировать разные апоптотические пути в различных типах клеток.

Старые ZnO NPs не повысили экспрессию апоптотических генов как свежие ZnO NPs

Наши данные РНК-секвенирования от старых ZnO NP-обработанных клеток A_L показали, что p53, PI3k-Akt, FoXO, Глутатион, ErbB, HIF-1, Окситоцин и Jak-STAT сигнальные пути были обогащены (Рис. 5A). Апоптотические гены, обогащенные в клетках Jurkat и HMDM, не были значительно затронуты в клетках, обработанных старыми ZnO NPs (Рис. 5B). Для дополнительного подтверждения находок мы тестировали экспрессию связанных генов в реальном времени ПЦР. Мы обнаружили, что некоторые апоптотические гены: BMP2, PMAIP1, IL1α, CD69, CCNA1, CD38 и IL1β были не детектируемы в клетках A_L, обработанных старыми ZnO NPs (данные не показаны), вероятно, потому что большинство этих генов экспрессируются в клетках иммунной системы. Другие повышенные апоптотические гены (IL1α, IL1β и CD59), наблюдаемые в группах, обработанных свежими ZnO NPs, не значительно меняли уровни экспрессии под воздействием старых ZnO NPs. В то время как MT1, служащий положительным контролем, был значительно увеличен в уровне экспрессии, экспрессия Caspase 3 не была значительно изменена (Рис. 5C). Эти данные предполагали, что старые ZnO NPs, в отличие от их свежих аналогов, менее потенциальны в активации генов апоптотического пути в клетках A_L.

Свежие, но не старые ZnO NPs повысили уровень экспрессии активированного белка Каспазы 3

Определение экспрессии гена Caspase 3 в одиночестве не может напрямую указывать на активацию апоптотического пути. Для дальнейшего анализа того, могло ли воздействие ZnO NPs изменить уровень апоптотических белков, экспрессия кливированного белка Каспазы 3, общепринятого биомаркера для указания активации клеточного апоптоза [27], изучалась анализом вестерн-блоттинга. Как показано на Рис. 6, по сравнению с контрольной группой, обработка свежими ZnO NPs (20 нм) увеличила клеточный уровень кливированного белка Каспазы 3 на 1,31 ± 0,023-кратно, что было значительно выше, чем в группе, обработанной старыми 20 нм ZnO NPs (1,12 ± 0,039-кратно). Когда размер частиц свежих ZnO NPs увеличивался до 90–200 нм, экспрессия кливированного белка Каспазы 3, индуцированная свежими NPs, увеличивалась на 1,46 ± 0,078-кратно, значительно больше, чем у старых NPs (1,07 ± 0,075-кратно). Эти данные дополнительно иллюстрировали более высокую потенцию свежих ZnO NPs в индуцировании клеточного апоптоза по сравнению с их старыми аналогами.

Обсуждение

Сообщалось, что ZnO NPs проходят физико-химическую трансформацию в Zn₅(CO₃)₂(OH)₆ с высвобождением Zn²⁺ в процессе естественного старения [23, 28]. Однако цитотоксичность, индуцируемая трансформированными (старыми) ZnO NPs, и лежащие в основе механизмы остаются неясными. Здесь, для раскрытия механизма разнородной цитотоксичности между свежими и старыми ZnO NPs, проводились анализ РНК-секвенирования и тест RT-PCR. Также вестерн-блоттинг применялся для изучения уровня белка Каспазы 3, ключевого исполнителя в клеточном апоптозе.

Наши данные показали, что старые ZnO NPs индуцировали намного меньшую цитотоксичность, чем свежие ZnO NPs в клетках A_L. LC₁₀₀ обеих свежих ZnO NPs (90–200 нм и 20 нм) в нашем настоящем исследовании был ниже 15 мкг/мл (Рис. 3), что согласуется с предыдущими находками, что LC₁₀₀ ZnO NPs с 19–36 нм для NIH-3T3 или MSTO клеток составляет около 15 мкг/мл [29]. Мы подтвердили, что экологические трансформации физико-химических свойств NPs могут драматически изменять их токсичность. Сообщалось, что процесс сульфидирования ZnO NPs меняет их заряд, гидрофобность и состояние агломерации, приводя к адсорбции сульфидных NPs в человеческой слюне,поте и бронхоальвеолярном промывном жидкости. И белок, адсорбированный ZnO NPs, формировал особую белковую корону, влияющую на его биологический эффект [19]. Фосфаты, широко присутствующие в физиологических растворах (таких как слюна), могли конвертировать ZnO NPs в метастабильные ZnHPO₄ и Zn₃(PO₄)₂ в течение примерно 5–10 ч и проявляли цитотоксичность к эпителиальным клеткам пищеварительного тракта [20]. Иваск и соавт. доказали возникновение полной трансформации ZnO NPs (≤ 3 мкг/мл) в in vitro системе воздействия на человеческие Т-лимфоциты (37 °C, культурная среда RPMI1640 с 10% FBS 24 ч) с использованием синхроtronного рентгеновского поглощения ближней к краю структуры (XANES). Спектр и цитотоксичность продуктов трансформации были согласованы с ZnSO₄ [21]. Наши результаты раскрыли дозо- и временно-зависимую токсичность ZnCl₂ к клеткам A_L, где ее цитотоксичность была намного ниже, чем у свежих и старых ZnO NPs (Рис. 3). Наблюдение дополнительно объясняет находку, что цитотоксичность свежих ZnO NP не полностью обусловлена высвобожденным Zn²⁺ [30].

Наше предыдущее исследование также показало, что старые ZnO NPs демонстрируют более высокую потенцию в вызове РАК (реактивных форм кислорода), а также ослабленную способность убивать клетки по сравнению со свежими ZnO NPs [23]. Мы предполагаем, что более низкая цитотоксичность, индуцируемая старыми ZnO NPs, может быть более переносимой для млекопитающих клеток. Настоящее исследование данных РНК-секвенирования проиллюстрировало, что апоптотические гены были повышены в клетках, обработанных свежими ZnO NPs, где они были гораздо менее затронуты в группах, обработанных старыми NPs. IL1α и IL1β — члены семейства цитокинов интерлейкин 1. Высвобождение IL1α и IL1β частично активирует Каспазу-8-зависимый апоптоз [31]. CD69 кодирует член кальций-зависимой лектиновой суперсемейства тип II трансмембранных рецепторов. Повышенная экспрессия CD69 ассоциировалась с повышенной экспрессией маркеров апоптоза аннексин V и CD95 (Fas) [32]. JUN — субъединица транскрипционного фактора AP-1. Повышенная активность JUN протеолитически расщепляет альфа-фордрин, субстрат интерлейкин-1бета-конвертирующего фермента (ICE), и семью цистеиновых протеаз CED-3, что дальше вызывает запрограммированную гибель клетки [33]. Повышенная экспрессия этих апоптотических генов раскрыла, что свежие NPs запускают апоптоз несколькими разными способами. После повышения экспрессии этих апоптотических генов апоптотические процессы в конечном счете выполняются апоптотическими белками (Рис. 7). Каспаза 3 — основной протеаза для различных апоптотических сценариев; расщепление этого белка необходимо для активации как экстринсических, так и интринсических апоптотических путей [34, 35]. Поэтому детекция кливированной каспазы 3 является распространенным методом для идентификации апоптоза, индуцированного широкой вариацией апоптотических сигналов [36]. Наши данные вестерн-блоттинга раскрыли, что для 20 нм и 90–200 нм ZnO NPs сублетальное воздействие не изменяло уровень Про-каспазы 3 во всех группах обработки. В противовес, кливированная Каспаза 3 была значительно повышена обработкой свежими NPs, где старые NPs показывали мало (если вообще) эффектов на уровень кливированной каспазы 3 (Рис. 6). В сочетании с анализом РНК экспрессии, наши результаты четко прояснили более высокую потенцию свежих ZnO NPs в индуцировании клеточного апоптоза.

Заключение

В настоящем исследовании естественная физико-химическая трансформация ZnO NPs в ультрачистой воде была подтверждена, и вариации цитотоксичности, индуцируемые свежими и старыми NPs, изучались. Мы фокусировались на данных РНК-секвенирования от наших старых ZnO NP-обработанных клеток A_L и свежих NPs из базы данных. Мы сравнили те сигнальные пути, специально обогащенные в группе, обработанной старыми NPs, которые отличаются от путей, обогащенных свежими NP- или ZnCl₂-обработанными группами. Наши данные указали, что более низкая цитотоксичность старых ZnO NPs тесно связана с их ослабленной способностью индуцировать апоптоз, в то время как транскрипционная регуляция множественных путей, активированных NPs, способствует установлению клеточной гомеостаза в млекопитающих клетках.

Доступность данных и материалов

Не применимо.

Аббревиатуры

NPs:

Нанопорошки

ZnO:

Оксид цинка

Zn₅(CO₃)₂(OH)₆:

Гидроцинкит

Zn(OH)₂:

Гидроксид цинка

ZnCl₂:

Хлорид цинка

ZnSO₄:

Сульфид цинка

ZnHPO₄:

Фосфат водорода цинка

Zn₃(PO₄)₂:

Фосфат цинка

A_L клетки:

Человеко-хомячьи гибридные клетки

CHO клетки:

Китайские яйцеклеточные опухоли

Jurkat клетки:

Периферические Т-лимфоциты

HMDM клетки:

Человеческие моноцит-производные макрофаги

NIH-3T3 клетки:

Мышиные эмбриональные клетки

MSTO клетки:

Человечные клетки рака легких

RPMI1640:

Институт мемориальный Росвелл Парк 1640

ICE:

Интерлейкин-1бета-конвертирующий фермент

CED-3:

Ген смерти Caenorhabditis elegans

IL1α:

Интерлейкин-1альфа

IL1β:

Интерлейкин-1бета

mRNA:

Матричная РНК

cDNA:

Комплементарная ДНК

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

TEM:

Передаточная электронная микроскопия

XRD:

Рентгеновская дифракция

RT-PCR:

ПЦР в реальном времени

CPI:

Инвентарь нанопродуктов для потребителей

XANES:

Синхроtronное рентгеновское поглощение ближней к краю структуры

RIPA:

Радиоиммуннопреципитационный анализ

SDS-PAGE:

Полиакриlamide гель электрофорез

PVDF:

Поливинилиденфторид

ECL:

Усиленная химилюминесценция

CCK-8:

Набор для подсчета клеток-8