GoldMag: покрытие PSS-MA улучшает стабильность и оптическую точность для детектирования белков

Аннотация

Золотые магнитные наночастицы (GoldMag) привлекают внимание благодаря уникальным физико-химическим свойствам, сочетающим Fe₃O₄ и Au наночастицы. Покрытие GoldMag полимерами не только повышает стабильность коллоидного раствора в буфере, но и играет ключевую роль в создании точечных оптических тестов для клинически значимых биомолекул. В работе поли(4-стиролсульфоновая кислота-ко-малеиновая кислота) (PSS-MA), отрицательно заряженный полиэлектролит с сульфонатными и карбоксилатными анионными группами, использовался для покрытия положительно заряженной поверхности GoldMag (30 нм). Комплекс PSS-MA-GoldMag имеет стабильный плазмонный резонансный пик абсорбции при 544 нм. Пара анти-D-димерных антител сконъюгирована на поверхности этого композита, и целевой белок D-димер детектировался в диапазоне 0,3–6 мкг/мл. Сдвиг характерного пика, вызванный агломерацией GoldMag из-за формирования антиген-антителовых «сэндвич-мостиков», позволил детектирование.

Введение

Используя специфическое магнитное свойство — суперпарамагнетизм — магнитные наночастицы широко исследуются для биомедицинских приложений: доставка лекарств/генов, МРТ, биологические анализы. Золотые магнитные наночастицы (GoldMag), состоящие из Fe₃O₄/Au, не только имеют свойства оксида железа, но и характеристики золотых наночастиц: легкую поверхностную функционализацию и уникальные оптические свойства. Эти особенности привлекли внимание в биологии, особенно в детектировании биомолекул на основе оптических свойств. Например, Wang et al. использовали Fe₃O₄-Au стержни как оптические зонды для мультиплексного детектирования патогенов. Однако, как и другие наночастицы, высокая поверхностная энергия заставляет GoldMag агрегироваться в кластеры в буферном растворе, что сильно ограничивает их применение для оптического детектирования в биомедицине. Поэтому критически важно предотвратить агрегацию GoldMag и обеспечить стабильный коллоидный раствор. Настройка GoldMag для детектирования целевых молекул через покрытие полимерами имеет высокую утилитарность. Сообщалось, что дисперсность GoldMag может быть улучшена поверхностной модификацией различными макромолекулярными органическими соединениями: 11-меркапт운데кановой кислотой (MUA), полистиролсульфонатом (PSS), полиэтиленимином (PEI). MUA вводили на поверхность GoldMag лиганд-обменной стратегией, улучшая стабильность коллоидного раствора. Эти MUA-GoldMag использовали в детектировании белков на основе оптических свойств. Однако цепь MUA слишком коротка для обеспечения достаточного стерического препятствия для гарантии достаточной дисперсности. Более того, низкая плотность карбоксильных групп в MUA ограничивает количество белка, которое может адсорбироваться на GoldMag. Эти недостатки ограничивают применение MUA-частиц в оптических приборах и ограничивают чувствительность для детектирования биомаркеров.

Poly(4-стиролсульфоновая кислота-ко-малеиновая кислота) (PSS-MA) (PSS-MA 3:1, Mw ~ 20 000), блок-кополимер, полученный ковалентным связыванием PSS и полималеиновой кислоты, содержит как сульфонатные, так и карбоксилатные группы. Электростатическое отталкивание от большого числа карбоксильных и сульфонатных групп, а также стерическое препятствие от длинной полимерной цепи PSS-MA делают этот полимер очень полезным для поддержания стабильности наночастиц. Фактически, PSS-MA использовался как стабилизатор при приготовлении наночастиц, таких как наноматериалы оксида железа, палладия и биметаллические наноструктуры Ag-Au. Johnston et al. сообщили, что кополимер-покрытые нанокластеры оксида железа обеспечивают более высокую степень электростерической стабилизации, чем нанокластеры, покрытые единичными макромолекулярными полимерами. Кроме того, большое количество карбоксильных групп в малеиновой кислоте PSS-MA позволяет химическую модификацию биомолекулами для биомедицинских приложений.

D-димеры — стабильные конечные продукты деградации перекрестно-связанного фибрина, возникающие из-за усиленного образования фибрина и фибринолиза. Определение уровня D-димера в крови широко используется в диагностике тромбоэмболических событий и инфаркта миокарда. Здесь мы использовали D-димер как модель для оценки потенциала PSS-MA-GoldMag для оптического детектирования специфических белков. Мы использовали пару анти-D-димерных антител для иммобилизации на PSS-MA-GoldMag для формирования зондов для детектирования D-димера двойным антителовым сэндвич-иммуноанализом.

Таким образом, в настоящем исследовании PSS-MA использовался для поверхностной модификации GoldMag. Это не только улучшило стабильность магнитных наночастиц, но и посредствовало конъюгации между наночастицами и антителами для детектирования D-димера.

Методы

Материалы и реактивы

GoldMag (5 мг/мл) предоставлены Xi'an GoldMag Nanobiotech Co., Ltd. (Сиань, КНР). Боровая кислота, бура, цетилтриметиламмоний бромид (CTAB), Poly(4-стиролсульфоновая кислота-ко-малеиновая кислота) (PSS-MA) (PSS-MA 3:1, Mw ~ 20 000) приобретены у Sigma-Aldrich, США. Пара монохлональных анти-D-димерных антител (антитело 1: M-2.1.16; антитело 2: M-1.2.57) куплены у Roche. D-димер приобретен у Meridian Chemicals, США.

Поверхностная модификация GoldMag с PSS-MA

GoldMag синтезировали как описано ранее. 13,3 мл CTAB (50 ммоль/л) добавляли к 13,3 мл GoldMag (~3 мг/мл). Смесь механически перемешивали (200 об/мин) с ультразвуком (SB-5200DTD, Китай) 30 мин, затем дальнейшее перемешивание без ультразвука еще 30 мин. Частицы тщательно вымывали деионизированной водой. CTAB-GoldMag передиспергировали в 10 мл деионизированной воды и добавляли 16 мл 25 % (масс/масс) раствора PSS-MA с перемешиванием (180 об/мин) 90 мин. Модифицированные частицы вымывали деионизированной водой дважды и диспергировали в деионизированной воде.

Характеризация

PSS-MA-GoldMag наблюдали передаточной электронной микроскопией (ТЭМ, Hitachi H-600, Япония). Распределение размера анализировали ДСС (zeta-sizer, Malvern Instruments, UK). Фурье-преобразование ИК-спектроскопии (FTIR, Thermo Nicolet 5700, США) характеризовала функциональные группы PSS-MA-GoldMag. Термогравиметрический анализатор Mettler Toledo SDTA 851e (TGA) использовался для анализа доли полимерной оболочки на поверхности PSS-MA-GoldMag. Поверхностный плазмонный резонанс (SPR) спектр GoldMag записывали UV-2550 спектрофотометром (Shimadzu, Япония) в диапазоне 450–700 нм.

Подготовка зонда анти-D-димер антитело-PSS-MA-GoldMag

1 мг GoldMag взвешивали в 1 мл буфера боракс/бората (0,02 М, pH 7,4), содержащем 75 мг/мл 1-этил-3-(3-диметиламино-пропил)карбодиимид (EDC). Затем добавляли 100 мкг анти-D-димер антитела, ультразвук 1 ч. 3 мл блокирующего буфера (0,02 М боракс/борат, pH 7,4, 5 % BSA) добавляли в смесь и инкубировали 1,5 ч. После разделения во внешнем магнитном поле, анти-D-димер антитело-PSS-MA-GoldMag композит хранили в буфере при 4 °C. Конъюгация антител подтверждалась SPR спектроскопией и ДСС.

Раствор D-димера готовили разбавлением стокового (40 мг/мл) телячьим сывороточкой. Три концентрации D-димера (0,6, 2, 6 мкг/мл) использовали для оптимизации времени реакции между D-димером и анти-D-димер антитело-PSS-MA-GoldMag комплексом. 10 мкл зонда (0,3 мг/мл) смешивали с 80 мкл раствора D-димера (0,6, 2, 6 мкг/мл), инкубировали при 25 °C 10, 20, 30, 40 мин. Длину волны SPR пика считывали UV-2550.

Концентрации D-димера 6, 3, 1,5, 0,75, 0,3 мкг/мл готовили для анализа зависимости между концентрацией D-димера и изменением SPR спектра. 10 мкл зонда (0,3 мг/мл) смешивали с 80 мкл раствора D-димера и инкубировали 25 °C 30 мин. SPR пик считывали.

Для оценки вмешательства триглицеридов, билирубина и гемоглобина, растворы D-димера (0 и 3 мкг/мл) готовили и добавляли отдельно 22 мг/мл триглицеридов, 0,2 мг/мл билирубина, 2 мг/мл гемоглобина. 10 мкл зонда добавляли к смесям, SPR пик считывали.

Результаты и обсуждение

Схема 1 иллюстрирует процедуры поверхностной модификации и функционализации частиц для колориметрического детектирования белков. Для изучения адсорбции и включения PSS-MA в структуры PSS-MA-GoldMag выполняли FTIR, SPR спектроскопию и TGA. Рис. 1а показывает FTIR спектры чистого PSS-MA, PSS-MA-GoldMag и GoldMag. Широкий сильный полос 3000–3700 см⁻¹ соответствует растяжению –CO–OH и гидроксильных групп –SO₂–OH в полимерных цепях. Симметричные вибрации сульфонатных групп (SO₃⁻) при 1037 и 1126 см⁻¹, растяжение C=C бензена при 1403 и 1637 см⁻¹. Эти характерные полосы PSS-MA наблюдались в PSS-MA-GoldMag, демонстрируя успешное покрытие. Изменение поверхностных химических групп подтверждается ясным голубым сдвигом 11 нм от 555 до 544 нм в SPR полосе после модификации (Рис. 1б). Позиция и ширина SPR пика связаны с поверхностью, средой и дисперсностью наночастиц. TGA анализ показал, что массовое отношение органического материала к GoldMag почти 1:4 (Рис. 1в). При низких температурах потеря массы атрибутируется дегидратации; при повышении температуры — окислительному разложению органических молекул на поверхности. В процессе модификации CTAB-GoldMag были положительно заряжены (+12,2 мВ), а поверхность частиц стала отрицательно заряженной (−24,5 мВ) после покрытия PSS-MA (Рис. 1г). Все результаты показывают успешное адгезирование PSS-MA на поверхности наночастиц.

Микрографии (Рис. 2а, б) GoldMag и PSS-MA-GoldMag, полученные ТЭМ, показывают, что частицы моно-дисперсны после модификации. Слой полимера на поверхности частиц четко виден под высоким разрешением, дополнительно указывая на успешное покрытие (Рис. 2б). Рис. 2в показывает средний диаметр PSS-MA-GoldMag 116 нм. ПSS-MA-GoldMag суспензия имеет вино-красный цвет, указывающий на хорошую стабильность наночастиц (1 год в воде).

Стабильность оптических характеристик GoldMag и PSS-MA-GoldMag в буферных растворах с разными pH анализировали SPR спектроскопией. Как показано Рис. 3а, SPR характерный пик сдвигался к большим длинам волн от 555 нм, когда GoldMag взвешивали в буфере боракс/борат с pH 6,0–9,0. Состав буфера также влияет на стабильность суспензии GoldMag. Позиция SPR пика смещалась к большим длинам волн (558 нм) в PB буфере (pH 7,4), боракс/борат (pH 7,4) и NaCl (10 мМ) по сравнению с деионизированной водой (550 нм) (Рис. 3в). Однако характерный SPR пик (545 ± 2 нм) не менялся значительно, когда PSS-MA-GoldMag диспергировали в электролитном растворе или буфере с разными pH (Рис. 3б, г). Xia et al. и Storhoff et al. также сообщали, что агрегация наночастиц сдвигает SPR спектр к большим длинам волн. Зета-потенциал GoldMag и PSS-MA-GoldMag измеряли (Рис. 3д, е). Сообщалось, что низкий зета-потенциал (менее ±30 мВ) приводит к агломерации частиц. Когда GoldMag взвешивали в PB буфере (pH 7,4), боракс/борат (pH 7,4) и NaCl (10 мМ), зета-потенциал составлял −16,7±1,1 мВ, −14,3±2,1 мВ, −8,9±1,5 мВ соответственно. В буфере боракс/борат с pH 6,0–9,0 зета-потенциал был −14,2±1,7 мВ, −17±1,1 мВ, 13,9±1,7 мВ, −18,1±1,6 мВ. Однако адгезия PSS-MA к GoldMag драматически снижает зета-потенциал в разных электролитных растворах и при разных pH. Во всех случаях зета-потенциал был ниже −30 мВ. Эти результаты указывают, что поверхностная модификация GoldMag PSS-MA значительно улучшает устойчивость к изменениям состава и pH буферных растворов и обеспечивает высокий уровень дисперсности.

Для изучения взаимодействия белка с PSS-MA-GoldMag, анти-D-димер антитела конъюгировали с PSS-MA-GoldMag через реакцию аминогрупп белка и карбоксиловых групп полимера, посредствованную EDC. Как показано Рис. 4а, красный сдвиг SPR пика наблюдался после реакции PSS-MA-GoldMag с анти-D-димер антителами, указывая на конъюгацию антител на наночастицах. Увеличение среднего диаметра частиц с 116 до 130 нм подтверждает введение антител на PSS-MA-GoldMag (Рис. 4б). Влияние массы антител на оптические свойства PSS-MA-GoldMag оценивали SPR спектроскопией после добавления разного количества антител (20–200 мкг) в суспензию PSS-MA-GoldMag. Как показано Рис. 4в, SPR пик не менялся и оставался на 548 ± 3,0 нм, независимо от количества добавленных антител.

Для оценки активности антител после конъюгации на PSS-MA-GoldMag, зонд А и зонд Б приготовили иммобилизацией пары антител (антитело 1 и антитело 2) и антитела 1 на PSS-MA-GoldMag соответственно. Взаимодействие двух типов зондов с D-димером анализировали SPR спектроскопией. Лучшее время реакции получено наблюдением изменения максимума SPR пика в течение 40 мин после добавления трех концентраций D-димера (0,6, 2, 6 мкг/мл) к зонду А. Как показано Рис. 5а, значительный сдвиг поверхностного плазмонного резонанса наблюдался в результате агрегации PSS-MA-GoldMag через перекрестные связи антиген-антитело сэндвич-мостиков со временем. При низкой концентрации (0,6 мкг/мл) не было значительного изменения SPR спектра от 20 до 40 мин, указывая, что 20 мин достаточно для реакции 0,6 мкг/мл или ниже. Однако при средних и высоких концентрациях (2 и 6 мкг/мл) длина волны продолжала увеличиваться 30 мин. Это указывает, что оптимальное время реакции — 30 мин. Как показано Рис. 5б, SPR спектр композитных частиц показал выраженный красный сдвиг поверхностного плазмонного резонанса от λ_max = 550 до 570 нм и уменьшение интенсивности характерного пика по мере увеличения концентрации D-димера от 0,3 до 6 мкг/мл. Это провоцируется агрегацией PSS-MA-GoldMag, вызванной перекрестной связью D-димера с антителом 1 и антителом 2 на зонде А. Агрегация привела к изменению оптических свойств золотой части PSS-MA-GoldMag. Jiang et al. и Li et al. также сообщали, что агрегация нанозолота сдвигает SPR спектр к красному и расширяет его. Однако красный сдвиг не наблюдался на Рис. 5г, потому что взаимодействие D-димера с антителом 1 не могло привести к сборке наночастиц. Более того, различимый красный сдвиг (5 нм) наблюдался даже при количестве D-димера, добавленного к зонду А, как 0,3 мкг/мл, что указывает, что предел детектирования ниже диагностических пороговых значений (0,5 мкг/мл) для этого биомаркера. Линейная зависимость между позицией SPR спектрального пика и концентрацией D-димера найдена в диапазоне 0,3–6 мкг/мл (r² = 0,9944) (Рис. 5в).

Как показано Рис. 6, никакого значимого сдвига SPR характерного пика PSS-MA-GoldMag в присутствии триглицеридов, билирубина и гемоглобина не найдено. Этот результат указывает, что наша система детектирования белков не имеет вмешательств с триглицеридами, билирубином и гемоглобинами.

Эти результаты показывают, что PSS-MA-GoldMag — перспективная магнитная наночастица для иммобилизации белков и может формировать сэндвич-мостик на поверхности частицы через антитело 1-целевой белок-антитело 2. Это делает PSS-MA-GoldMag ценным материалом для использования в точечных оптических детектирований биомаркеров.

В данном исследовании PSS-MA впервые использовался для модификации GoldMag (Схема 1). Введение PSS-MA на поверхность GoldMag значительно улучшило его стабильность в буферном растворе. Помимо стерического препятствия, вызванного длинной полимерной цепью PSS-MA, карбоксильные и сульфо группы в PSS-MA вызывают электростатическое отталкивание между наночастицами. Это значительно повышает стабильность PSS-MA-GoldMag. Большое количество карбоксильных групп на поверхности частиц удовлетворяет требование конъюгации с биомолекулами. Взяв D-димер и его антитело как модель, найдено, что оптические характеристики могут быть адаптированы через перекрестные связи между антигеном и антитело-наночастицей композитом. Результаты показывают, что PSS-MA модифицированный GoldMag может служить очень перспективным кандидатом для оптического детектирования на основе иммуноанализов.

Заключение

В настоящем исследовании сообщается простой и быстрый метод покрытия GoldMag PSS-MA. Результаты показывают, что коллоидная стабильность и дисперсность GoldMag значительно улучшены через введение PSS-MA. Частицы показывают хорошую стабильность в буферном растворе в широком диапазоне pH. Более того, наличие карбоксильной группы дает возможность конъюгации белков к наночастицам. Взяв D-димер и его антитело как модель, найдено, что оптические характеристики могут быть адаптированы через перекрестные связи между антигеном и антитело-наночастицей композитом. Результаты показывают, что PSS-MA модифицированный GoldMag может служить очень перспективным кандидатом для оптического детектирования на основе иммуноанализов.

Аббревиатуры

DLS:

Динамическое световое рассеяние

FTIR:

Фурье-преобразование ИК-спектроскопия

GoldMag:

Золотые магнитные наночастицы

MUA:

11-меркапт운데кановая кислота

PEI:

Полиэтиленимин

PSS:

Полистиролсульфонат

PSS-MA:

Поли(4-стиролсульфоновая кислота-ко-малеиновая кислота)

SPR:

Поверхностный плазмонный резонанс

TEM:

Передаточная электронная микроскопия

TGA:

Термогравиметрический анализатор