Сверхчувствительный биосенсор для обнаружения ДНК холерного вибриона с помощью композитных наносфер полистирола и акриловой кислоты

Фон

Холерный вибрион , возбудитель пищевого происхождения, может вызывать эпидемии холеры у человека в результате острой водянистой диареи. Вспышка холеры по-прежнему является серьезной проблемой в некоторых частях мира, например. Азии и Африки, и приводит к низкому социально-экономическому статусу [1,2,3,4]. Этот кишечный патоген является основной причиной заболеваемости и смертности, особенно в развивающихся странах [5]. Эпидемия и пандемия холеры в различных регионах в основном вызваны V. холера серогруппы O1 и O139 [1, 2, 6]. В. холера серогруппа O1 имеет два основных серотипа, то есть Инаба и Огава, которые могут чередоваться между эпидемиями холеры. Третий серотип, Хикодзима, также существует, но встречается редко и нестабилен. Гены, ответственные за биосинтез антигена O1, были обозначены как rfb. Мутация, которая определяет серотипы Inaba и Ogawa, представляет собой единственную делеционную мутацию в гене rfbT [7]. Однако сообщалось, что случайные вспышки пищевых заболеваний у людей с тяжелой диареей также были вызваны не-O1 / не-O139 V. холера из-за проглатывания недоваренных морепродуктов [8] или воздействия загрязненной водной среды [9]. Первая эпидемия В. холера O139 возник в 1992 г. в Бангладеш и Индии, а затем быстро распространился на другие страны Юго-Восточной Азии [10]. Во всем мире в 2005 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) сообщила о 131 943 случаях холеры и 2272 смертельных исходах [11].

В поисках эффективного метода мониторинга или диагностики токсигенных V. холера бактерии необходимы для борьбы с эпидемией холеры. Традиционное отождествление В. холера часто достигается путем выделения и скрининга бактерий, который включает предварительное обогащение щелочной пептонной водой (APW) с последующим выделением V. холера на культуральной среде тиосульфат-цитрат-желчной соли сахарозного агара (TCBS) и идентификация с помощью теста агглютинации на предметных стеклах со специфической антисывороткой [12]. Однако этот метод требует очень много времени и трудозатрат, а результат, полученный через несколько дней, означал бы отсрочку клинической диагностики и лечения пациента. Молекулярный метод, включающий ПЦР-амплификацию для обнаружения V. холера [13] позволил сократить время диагностики [14], но метод ПЦР требует квалифицированных специалистов и дорогостоящей инфраструктуры, которую трудно выполнить в странах с ограниченными ресурсами. Сообщалось об экспресс-диагностических тестах, основанных на принципе иммунохроматографии, для дискретного или одновременного обнаружения V. холера серогруппы O1 и O139. Некоторые другие методы на основе иммуноанализа, используемые для обнаружения V. холера такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), коагглютинация, иммунофлуоресценция и микробаланс кварцевых кристаллов (QCM). Однако для большинства этих методов требуется сложное оборудование, длительное время проведения анализа и высококвалифицированный персонал с детальными техническими знаниями [15,16,17,18,19,20].

Электрохимические методы привлекли значительное внимание при обнаружении нуклеиновых кислот из-за их высокой чувствительности, специфичности, простоты и экономичного протокола, а также быстрого обнаружения и совместимости с технологией микротехнологий [21, 22]. Кроме того, электрохимический метод в сочетании с технологиями миниатюризации может быть использован для децентрализованного анализа in situ, например, устройство биосенсора ДНК на основе микрожидкостного чипа, что очень полезно для практических целей [23]. Для электрохимических измерений используется широкий спектр электродов, таких как стеклоуглеродный электрод (GCE), электрод из углеродной пасты (CPE), золотой электрод и платиновый электрод. В последнее время исследования были сосредоточены на использовании электродов с трафаретной печатью (SPE) из-за некоторых из их уникальных свойств, таких как обеспечение низкого фонового тока и широкого диапазона потенциалов, рентабельность, поскольку углеродные чернила недороги и могут производиться серийно. .

Сообщается о нескольких электрохимических методах обнаружения V. холера состояла из серии сложных шагов. Электрохимический В. холера genosensor, описанный Liew et al. [24] использовали метод электрохимической адсорбции для иммобилизации ДНК-зонда на угольном SPE. Лиофилизированные AuNPs-модифицированные многослойные частицы PSA с полиэлектролитами образовывали биоконъюгат с авидином, который функционировал как репортерная метка в сэндвич-анализе гибридизации ДНК. Однако добавление стабилизатора сорбита было необходимо для сохранения биоконъюгатов PSA-AuNPs-авидин, чтобы продлить рабочий период ДНК-биосенсора до 30 дней. Ферментативный электрохимический В. холера Биосенсор ДНК был недавно разработан Yu et al. [25], посредством чего ДНК-зонд, меченный тиолированной анти-флуоресцеин-конъюгированной щелочной фосфатазой (анти-FCAP), был связан с золотым SPE посредством химии золото-тиол. Целевая ДНК была помечена универсальным флуоресцеином, чтобы обеспечить распознавание гибридизации ДНК, достигаемое посредством ферментативного превращения α-нафтилфосфата в электроактивный α-нафтол. Тем не менее, эта схема обнаружения требовала длительного времени анализа, примерно 95 минут, для гибридизации ДНК, мечения ДНК-гибридов функциональным ферментом с последующей инкубацией электрода в электроактивном α-нафтилфосфатном субстрате до проведения амперометрического измерения. Другой ферментный электрохимический ДНК-биосенсор на основе углеродного ТФЭ, покрытого авидином, конъюгированного с биотинилированным ДНК-зондом, был разработан Лоу и его членами [26]. Меченый дигоксигенином (DIG) репортерный зонд также использовали в этой стратегии двойной гибридизации, которая фланкировала последовательность кДНК. Связанный с пероксидазой хрена анти-DIG (анти-DIG-HRP) был использован в качестве электрохимической метки, которая могла одновременно катализировать окисление 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидина (TMB) с восстановлением H ₂ О ₂ чтобы обеспечить перенос электрона к поверхности электрода для электрохимической трансдукции события гибридизации ДНК. Простая конструкция ДНК-биосенсора на основе покрытого золотом стеклянного электрода с иммобилизованным тиолированным ДНК-зондом была описана Patel et al. [22] для быстрого обнаружения V. холера , а метиленовый синий использовали в качестве индикатора гибридизации ДНК. Однако линейный диапазон обнаружения системы ограничен уровнями мкМ, что ограничивает ее применение в клинических образцах.

Наночастицы латекса и золота ранее использовались в качестве метки гибридизации ДНК посредством связывания авидина / биотина с ДНК-зондом при обнаружении V. холера [24], патоген рыб Aphanomyces invadans [27], Э. coli [28] и неспецифическая гибридизация ДНК [29], при которой латексные сферы были покрыты многослойным полиэлектролитом до того, как к ним электростатически прикрепились отрицательно заряженные коллоиды наночастиц золота. Kawde и Wang [29] прикрепили латексные частицы PSA к ДНК-репортерному зонду, который будет использоваться в качестве метки гибридизации ДНК, путем загрузки покрытых стрептавидином латексных частиц с покрытыми биотином AuNP. Куан и др. [24, 27] и Liew et al. [24, 27] также сообщили о том же методе связывания авидин-биотин с использованием конъюгатов зонд золото-PSA-ДНК. Pinijsuwan et al. [28] сообщили об использовании электростатического метода для загрузки частиц PSA, прикрепленных к ДНК-репортерному зонду, и частицы PSA, покрытые полиэлектролитом, были использованы в качестве метки для гибридизации, которая усиливала токовый отклик DPV.

В этом исследовании мы сообщаем о другом подходе к иммобилизации ДНК с использованием наночастиц латекс-золото в качестве субстрата иммобилизации ДНК-зонда для разработки высокочувствительной системы обнаружения для V. холера ДНК. Иммобилизация ДНК была выполнена с помощью очень простой и быстрой процедуры с использованием химии гидрохлорида 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимида / N-гидроксисукцинимида (EDC / NHS) в качестве связывающего реагента для повышения эффективности иммобилизации [30] на карбоксилированном латексе. поверхность частицы. Обнаружение гибридизации ДНК было основано на анализе сэндвич-типа, который включал реакцию гибридизации между иммобилизованным ДНК-зондом и последовательностью-мишенью с последующим сигнальным / репортерным зондом. Натриевую соль моногидрата антрахинон-2-сульфоновой кислоты (AQMS) использовали в качестве электрохимической метки для мониторинга события гибридизации. Предложенные латексные частицы субмикронного размера улучшили способность связывания ДНК-зонда, а чувствительность ДНК-биосенсора была увеличена за счет включения высокопроводящих наночастиц золота (AuNP). Биосенсор ДНК продемонстрировал исключительную чувствительность к обнаружению V. холера кДНК и чрезвычайно низкий предел обнаружения на зептомолярных уровнях по сравнению с авидин-биотиновой технологией, о которой сообщалось до сих пор [24, 26].

Методы

Химические вещества и реагенты

Стирол (St) и акриловая кислота (AA) были приобретены у Fluka. HAuCl ₄ · 3H ₂ О, дигидрат тринатрийцитрата, додецилсульфат натрия (SDS), гидрохлорид 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимид (NHS) были получены от Sigma-Aldrich. Персульфат аммония (APS), бромистоводородная кислота и бром были поставлены Riedel-De Haen, Ajax Finechem и Panreac соответственно. Все химические растворы готовили на деионизированной воде. Синтетические олигонуклеотиды-мишени на основе 30 оснований и несоответствия были приобретены в Bio Service Unit (NSTDA). Некомплементарная ДНК (нкДНК) и сигнальный зонд были от Sigma, а 5'-амино-модифицированный захватывающий зонд был от Bioneer. Зонд для захвата готовили в 0,05 М калий-фосфатного буфера (pH 7), в то время как целевую ДНК, несовпадающую мишень, репортерный зонд и растворы некомплементарной ДНК готовили в натрий-фосфатном буфере (0,05 М, pH 7). Олигонуклеотидные последовательности, использованные в настоящем исследовании, показаны в таблице 1.

Аппарат

Электроаналитическое измерение выполняли с помощью потенциостата / гальваностата (Autolab PGSTAT12, Metrohm), снабженного программным обеспечением GPES (4.0.007). Вольтамперометрические эксперименты проводились с традиционной трехэлектродной системой, состоящей из рабочего электрода с трафаретной печатью (SPE) из углеродной пасты (Quasense, Бангкок, Таиланд), электрода сравнения Ag / AgCl (3 M KCl) и платинового стержня ( Диаметром 2 мм) противоэлектрод. Метод дифференциальной импульсной вольтамперометрии (DPV) использовался для всех электрохимических исследований при ступенчатом потенциале 0,02 В и скорости сканирования 0,5 В / с от 0,0 до +1,0 В в 4,5 мл измерительного буфера (0,05 М калий-фосфатного буфера) при pH 7 и температура окружающей среды. Все потенциалы, измеренные в этом исследовании, были отнесены к электроду Ag / AgCl, и гомогенные растворы были приготовлены с использованием ультразвуковой ванны (Elma S30H). Сканирующий электронный микроскоп (SEM, LEO 1450VP) использовался для определения размера и распределения латексных сфер.

Методы

Синтез наночастиц коллоидного золота

Коллоидные AuNP получали восстановлением цитратом натрия по методу Туркевича [31]. Вкратце, около 10 мл 5 мМ HAuCl ₄ · 3H ₂ О растворяли в 180 мл деионизированной воды и кипятили в условиях непрерывного перемешивания на комбинированном устройстве с горячей пластиной и магнитной мешалкой. Десять миллилитров 0,5% ( w / v ) тринатрийцитрата добавляли в кипящий раствор, и наблюдалось постепенное изменение цвета раствора от бледно-красного до рубиново-красного.

Подготовка латексных частиц

Латексные частицы получали реакцией сополимеризации эмульсии без мыла, как описано Polpanich et al. [23] с некоторыми изменениями. Вкратце, около 190 г деионизированной воды продували газообразным азотом в трехгорлой колбе, погруженной в водяную баню на ~ 1 час при перемешивании со скоростью 350 об / мин. Затем добавляли двадцать граммов St и 0,5 г AA, и температуру поддерживали на уровне 70 ° C. После этого около 0,2 г APS добавляли в 10 мл деионизированной воды с последующим выливанием препарата в трехгорлую колбу для инициирования реакции радикальной полимеризации, и процесс полимеризации продолжался в течение 8 часов. Синтезированные карбоксилатексные сферы собирали центрифугированием с деионизированной водой дважды при 13000 об / мин в течение 20 минут [23, 27, 28] и повторно суспендировали в деионизированной воде при комнатной температуре (25 ° C) до использования. Морфологию и средний размер латексных частиц PSA определяли с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM).

Модификация поверхности SPE и иммобилизация ДНК-зонда

Перед модификацией поверхности углеродный ТФЭ тщательно промывали деионизированной водой, а затем покрывали по каплям суспензией PSA с концентрацией 3 мг / мл и оставляли сушиться на воздухе в условиях окружающей среды с последующим литьем по капле с 5 мг / мл коллоидных AuNP. . Электрохимические характеристики углеродного ТПЭ до и после модификации латексными частицами и AuNP исследовали методом CV. Затем модифицированный латексом-AuNPs углеродный SPE (PSA-AuNPs-SPE) промывали деионизированной водой и погружали в 0,1 M калий-фосфатный буфер (pH 5), содержащий карбодиимидные сшивающие реагенты, т.е. 0,002 M EDC и 0,005 M NHS в течение 2 часов [32] перед замачиванием в течение ночи в 0,05 М калий-фосфатного буфера (pH 7), содержащем 5 мкМ зонда захвата. После этого ДНК-модифицированный PSA-AuNPs-SPE (ДНК-PSA-AuNPs-SPE) тщательно промывали калий-фосфатным буфером (0,05 M, pH 7) для удаления физически адсорбированного зонда. ДНК-электрод погружали в 0,05 М натрий-фосфатного буфера при pH 7, содержащего линейную ДНК-мишень (1 мкМ) и метку гибридизации ДНК AQMS (5 мМ) для частичной гибридизации на 1 час, а затем погружали в 0,05 М натрий-фосфатного буфера (pH 7) кондиционировали 1 мкМ репортерного зонда и 5 мМ AQMS в течение еще 1 ч для полного процесса гибридизации ДНК. Наконец, ДНК-электрод промывали калий-фосфатным буфером (0,05 М, pH 7) для удаления негибридизированных олигонуклеотидных последовательностей. Электрохимический отклик каждого удлиненного вещества, прикрепленного к SPE, исследовали методом DPV. На рисунке 1 представлена ​​пошаговая процедура разработки V. холера ДНК-биосенсор на основе твердой подложки коллоидных PSA-AuNP.

Схематическое изображение пошаговой процедуры изготовления ДНК-биосенсора

Оптимизация гибридизации синтетических олигонуклеотидов

Влияние различных параметров, таких как концентрация ДНК-зонда и AQMS, pH, ионная сила и буферная емкость, на реакцию гибридизации иммобилизованного ДНК-зонда с сигнальным зондом и целевой ДНК было исследовано до определения динамического линейного диапазона ДНК. биосенсор. Кроме того, до разработки V. холера Биосенсор ДНК был готов к применению в эксперименте по «всплеску и восстановлению». Загрузки зонда захвата и AQMS были оптимизированы путем варьирования их концентраций от 1 до 6 мкМ и 0,1–5 мМ, соответственно, в то время как концентрация целевой ДНК и репортерного зонда поддерживалась на уровне 5 мкМ в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (pH 7,0). Исследования влияния pH и концентрации буфера проводились путем изменения pH и концентрации натрий-фосфатного буфера с pH 5,5 на 8,0 и от 0,001 до 1000 M соответственно. Наличие различных катионов в реакции гибридизации ДНК электрохимического ДНК-биосенсора определяли путем добавления Na ⁺ , K ⁺ , Ca ²⁺ , и Fe ³⁺ ионы в концентрации 1,0 М в буфер для гибридизации ДНК, содержащий 1 мМ AQMS и 5 мкМ кДНК и детекторный зонд с pH 7,0. Эффект ионной силы исследовали, варьируя концентрацию NaCl в диапазоне 0,1–3,0 М при pH 7,0. Затем определяли динамический диапазон ДНК-биосенсора в 1,0 × 10 ⁻²¹ до 1,0 × 10 ⁻⁸ М В. холера кДНК с использованием постоянной концентрации сигнала зонда при 5 мкМ и pH 7,0. Продолжительность иммобилизации ДНК-зонда определяли путем вымачивания ДНК-электрода в 5 мкМ раствора зонда-захвата (pH 7,0) между 1 и 13 часами, а ответ DPV измеряли каждые 1-2 часа. Между тем, время гибридизации ДНК определяли, давая возможность реакции гибридизации ДНК происходить между 15 и 180 мин, а ответ ДНК-биосенсора регистрировали каждые 15–30 мин. Срок годности ДНК-биосенсора определяли путем периодического измерения реакции ДНК-биосенсора на обнаружение 5 мкМ V. холера кДНК на 120 дней. Анализ проводили в пяти повторностях с использованием нового ДНК-электрода для каждого анализа гибридизации сэндвич. Регенерацию ДНК-электрода проводили с использованием 0,1 М раствора NaOH в течение 4 минут, а повторную гибридизацию ДНК-биосенсора (60 минут) выполняли с использованием раствора для регибридизации, содержащего 5 мкМ кДНК и детектирующего зонда и 1 мМ AQMS с ионной силой 2,0 М. в 0,05 М калий-фосфатного буфера (pH 7,0). Эксперимент по регенерации проводился в шести повторностях.

В. холера Количественная оценка с использованием электрохимического ДНК-биосенсора на основе PSA-AuNP

Разные В. холера бактериальные штаммы, а именно J2126-I, J2126-II, J3324-I, J3324-II, J3330-I, J3330-II, CDHI 5294-II и UVC1324, включая Citrobacter freundii (CF-I) и Citrobacter freundii (CF-II) были получены из лаборатории микробиологии факультета прикладных наук Университета AIMST, Кедах. Затем из этих бактерий проводили экстракцию геномной ДНК с использованием QIAGEN Genomic-tip 500 / G в соответствии с протоколом производителя. Затем экстрагированную ДНК разводили в 100 раз, используя натрий-фосфатный буфер (0,05 М, pH 7,0). Около 300 мл экстрагированной ДНК, содержащей 2,0 М NaCl и 1 мМ AQMS, обрабатывали ультразвуком в течение 15 минут для высвобождения разрывов ДНК. Затем иммобилизованный ДНК-зонд замачивали на 1 час, чтобы дать возможность провести процесс гибридизации ДНК, и осторожно промывали 0,05 М калий-фосфатным буфером (pH 7,0) для удаления несвязанной ДНК. Оценку ответа ДНК-биосенсора на основе пикового тока DPV измеряли и сравнивали с текущим ответом, генерируемым ДНК-электродом без реакции с кДНК в качестве контрольного сигнала. Каждый эксперимент проводили в трех экземплярах в одних и тех же экспериментальных условиях. Обычный t Тест использовали для определения значительной разницы между ответом ДНК-биосенсора и ответом контроля. Восстановление В. холера J3324 и V. холера ДНК UVC1324 в концентрации 1,0 × 10 ⁻⁴ мкг мкл ^-1 , 1,0 × 10 ⁻⁵ мкг мкл ^-1 , и 1.0 × 10 ⁻⁶ мкг мкл ^-1 добавление в буфер гибридизации затем проводили с использованием предложенного электрохимического ДНК-биосенсора на основе PSA-AuNPs.

Результаты и обсуждение

Морфология латексных частиц и электрохимическое поведение SPE, модифицированного латексными наночастицами.

На рис. 2 представлена ​​полученная с помощью SEM микрофотография сфер карбоксилированного латекса со средним размером частиц 186,1 ± 4,6 нм. Равномерное распределение сфер PSA по размерам позволило гомогенно иммобилизовать молекулы ДНК на поверхности латекса для усиления реакции воспроизводимости биосенсора ДНК. Сканирующий электронный микроскоп (SEM, LEO 1450VP) использовался для определения размера и распределения латексных сфер.

СЭМ-микрофотография синтезированных латексных сфер PSA при увеличении 10 000

Электродинамические результаты модифицированного SPE приведены в таблице 2. Разделение потенциалов пиков (ΔEp) указывает на кинетику переноса электронов в системе. ТФЭ, модифицированный PSA (PSA-SPE), показал наивысшее значение ΔEp из-за медленного процесса переноса заряда в слое частиц коллоидного сополимера, что привело к переходу системы в квазиобратимое состояние. Однако, когда AuNP загружали в PSA-SPE, уменьшение ΔEp означает улучшение скорости переноса электронов на поверхности электрода.

На рисунке 3 показаны дифференциальные импульсные вольтамперограммы реакции окисления AQMS на модифицированном латексом SPE и реакции последовательной гибридизации V. холера Биосенсор ДНК. Значительная разница в пиковом токе DPV наблюдалась между электродами, которые содержали только микросферы, модифицированные латексом, и без иммобилизованной захватывающей ДНК (эксперименты (а) и (b)) и модифицированные иммобилизованными зондами захвата ДНК в присутствии кДНК и указанного зонда (эксперимент (g )). Это указывает на то, что аминированные зонды захвата ДНК были успешно иммобилизованы на покрытых карбоксилированных латексных сферах PSA посредством протокола связывания EDC / NHS [33]. Эксперимент (g) также показывает намного более высокий ответ DPV по сравнению с ДНК-электродами в присутствии нкДНК и сообщенным репортерным зондом (эксперимент (d)), в несовпадающей ДНК и сообщенном репортерном зонде (эксперимент (e)), и целевой кДНК с о пробе не сообщалось (эксперимент (f)). Это происходит из-за полной гибридизации целевой ДНК с захватывающими и репортерными зондами посредством реакции сэндвич-гибридизации на поверхности биосенсора ДНК, как показано в эксперименте (g). Это также показывает, что использование указанного зонда может усилить сигнал от гибридизации ДНК. Тем не менее, ток DPV в результате гибридизации, наблюдаемой в присутствии целевой ДНК без включения указанного зонда (эксперимент (f)), все еще выше, чем текущие сигналы DPV, наблюдаемые для негибридизованной ДНК (эксперименты (c), (d) и (e)).

Сигнал дифференциальной импульсной вольтамперограммы от AQMS электродов ( a ) PSA-SPE, ( b ) PSA-AuNPs-SPE, ( c ) улавливают зонд-PSA-AuNPs-SPE и в присутствии ( d ) нкДНК и репортерный зонд, ( e ) несовпадение ДНК и репортерного зонда, ( f ) только кДНК и ( g ) кДНК и репортерный зонд

Влияние загрузки ДНК-зонда и концентрации AQMS

Влияние концентрации ДНК-зонда на реакцию гибридизации ДНК наблюдали с помощью реакции электрохимического окисления AQMS. На рис. 4а показано, что ответ ДНК-биосенсора постепенно увеличивался с увеличением количества ДНК-зонда, иммобилизованного на PSA-AuNPs-SPE, с 1 до 4 мкМ. Это было приписано увеличению количества электроактивного AQMS, интеркалированного в двухцепочечную ДНК (дцДНК), чтобы обеспечить перенос электронов через иммобилизованную спираль ДНК. Было обнаружено, что DPV-ответ ДНК-биосенсора становится почти плато между 4 и 6 мкМ ДНК-зонда, что указывает на достижение оптимальной нагрузки ДНК-зонда на поверхность электрода [34]. Таким образом, зонд захвата 4 мкМ был выбран в качестве оптимальной загрузки зонда ДНК в последующих экспериментах. Концентрация метки AQMS также была оптимизирована при измерении электролита между 0,1 и 5,0 мМ, а концентрация AQMS при 1 мМ оказалась достаточной для оптимальной реакции интеркаляции ДНК (рис. 4b).

Эффект датчика захвата ( a ) и концентрации AQMS ( b ) на ответ ДНК-биосенсора, выполненный с 5 мкМ кДНК и сигнальным зондом в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (pH 7,0)

Влияние pH, ионной силы и буферной емкости

Скорость реакции гибридизации ДНК очень сильно зависит от pH раствора. Как видно на фиг. 5а, в более кислой среде протонирование фосфодиэфирного остова ДНК снижает растворимость молекулы ДНК, что в конечном итоге снижает скорость реакции гибридизации ДНК. В то время как в основной среде он разорвал слабые водородные связи, удерживающие вместе пары оснований ДНК. Оптимальная реакция гибридизации ДНК была более благоприятной в нейтральных условиях, благодаря чему она способствовала большему количеству захватывающих зондов для гибридизации с целевой ДНК и впоследствии позволяла интеркаляцию окислительно-восстановительных зондов AQMS, чтобы сделать распознавание гибридизации ДНК в бизнесе. Таким образом, 0,05 М натрий-фосфатного буфера при pH 7,0 использовали в качестве среды для гибридизации ДНК для последующих исследований ДНК-биосенсоров. Положительно заряженные ионы, такие как Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ , и Fe ³⁺ ионы могут взаимодействовать с отрицательно заряженной фосфодиэфирной цепью ДНК. Эта ионная реакция нейтрализует заряд молекулы ДНК, тем самым уменьшая стерическое отталкивание между молекулами ДНК, чтобы облегчить реакцию гибридизации ДНК. На рисунке 5b показано влияние некоторых катионов на реакцию гибридизации ДНК. Было замечено, что реакция гибридизации ДНК увеличивается в присутствии положительно заряженного иона порядка Na ⁺ > K ⁺ > Fe ³⁺ > Ca ²⁺ . Оба Ca ²⁺ и Fe ³⁺ было обнаружено, что ионы значительно снижают реакцию гибридизации ДНК из-за ионных взаимодействий Ca ²⁺ и Fe ³⁺ ионами фосфата из буферного раствора, что привело к образованию нерастворимых фосфатных соединений. Это уменьшило содержание ионов в среде, тем самым увеличив электростатическое отталкивание между молекулами ДНК. Наибольший ток гибридизации ДНК был получен в присутствии Na ⁺ ion из-за его меньшего размера и более сильного сродства к сахарно-фосфатному остову ДНК по сравнению с K ⁺ ion, чтобы преодолеть стерические препятствия и электростатическое отталкивание между отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК.

Влияние pH ( a ) различные катионы ( b ), концентрация буфера ( c ) и ионной силы ( d ) на реакцию гибридизации ДНК электрохимического V. холера Биосенсор ДНК. Гибридизацию проводили с 5 мкМ кДНК и репортерным зондом с последующей интеркаляцией 1 мМ AQMS

Кроме того, ионная сила раствора также будет влиять на реакцию биосенсора ДНК. На рис. 5c, d показана оптимальная буферная емкость, а ионная сила была достигнута с использованием 0,05 М натрий-фосфатного буфера с фиксированным pH 7,0 и 2,0 М NaCl, соответственно. В этом состоянии он в высшей степени благоприятствовал реакции гибридизации ДНК; следовательно, был получен высокий ответ DPV. При оптимальной буферной емкости и ионной силе раствора электростатическое отталкивание между молекулами ДНК уменьшалось и, таким образом, улучшалась реакция гибридизации ДНК. Напротив, когда использовалось слишком низкое или слишком высокое содержание ионов, стерические препятствия и электростатическое отталкивание становились доминирующими и ограничивали гибридизацию молекул ДНК.

Создание V. холера Калибровочная кривая ДНК-биосенсора

Из результата, показанного на фиг. 6a, ответ ДНК-биосенсора увеличивался пропорционально увеличению концентрации кДНК с 1,0 × 10 ^-21 до 1,0 × 10 ⁻⁸ M ( R ² =0,99) с пределом обнаружения 1.0 × 10 ⁻²¹ М. Предел обнаружения был рассчитан на основе трехкратного стандартного отклонения ответа биосенсора на кривой отклика, аппроксимирующего предел обнаружения, деленного на наклон линейной калибровки. Широкий линейный диапазон обнаружения ДНК-биосенсора был обусловлен высокодисперсными и сферическими латексными частицами PSA субмикронного размера, используемыми в качестве матрицы-носителя для иммобилизации ДНК. Слой, богатый акриловой кислотой, на поверхности латексных частиц предлагал большой участок связывания для прикрепления зондов захвата ДНК, чтобы создать максимально покрытую поверхность воспринимающим ДНК слоем. Кроме того, включение AuNP в SPE, модифицированное PSA, дополнительно усилило аналитический сигнал реакции гибридизации ДНК, и это обеспечило высокую чувствительность ДНК-биосенсора (рис. 6b).

Differential pulse voltammograms (a ) and DNA biosensor linear range (b ) obtained using various cDNA concentrations from 1.0 × 10 ⁻¹⁵ to 1.0 × 10 ⁻¹ μM V. cholerae target DNA and 5 μM signal probe

DNA Probe Immobilisation and Hybridization Times

It took about 8 h for the capture probe to be immobilised on the PSA copolymer particles surface, as illustrated by the DNA biosensor response in Fig. 7a, which showed a current increment from 1.0 to 8.0 h of capture probe immobilisation time, after which no obvious change in the DPV current was observed. Longer immobilisation time resulted in a higher amount of DNA probes immobilised onto the latex. After 8.0 h of exposure to the DNA probes, the hydrophilic functional latex with reactive carboxyl groups at the surface was presumably fully attached with the DNA probes. DNA hybridisation time, on the other hand, is the rate limiting step, which determines the response time of the DNA biosensor. Based on the DNA biosensor response trend in Fig. 7b, the response time of the V. cholerae DNA biosensor developed in this study was estimated to be about 60 min for the dual hybridisation processes to complete.

DNA probe immobilisation duration on the immobilised PSA latex colloidal particles (a ) and DNA hybridization duration of the DNA biosensor (b ) in 0.05 M potassium phosphate buffer at pH 7.0 containing 5 μM target DNA and reporter probe and 1 mM AQMS at 2.0 M ionic strength

Long-Term Stability and Regeneration of V.cholerae DNA Biosensor

Figure 8 shows the shelf life of the V. cholerae DNA biosensor. The DNA biosensor showed the highest response to the detection of 5 μM of V. cholerae cDNA for the first month of the experimental period. The electrochemical DNA biosensor was able to retain 95% of its initial DPV current after 58 days of storage period. The DNA hybridisation response was then gradually decreased to about 75% of its original response on the 75th day and exhibited 40% of its initial performance on the 100th operational day. The bioactivity of the immobilised capture probe was finally declined to 30% after 3 months of storage period. The reproducibility of each calibration point, which was repeated on five replicate DNA electrodes, gave satisfactory relative standard deviation (RSD) between 2.4 and 4.5% (n =5).

The life span profile of the fabricated V. cholerae DNA sensing electrode. The electrode was stored in 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) at 4 °C after every DPV measurement was taken

Regeneration of biosensor indicates whether the biosensor is reusable for a series of consecutive analyses. The regeneration method used in this study was conducted based on previously reported protocol in other studies [11, 21] with slight modifications. In this study, 0.1 M of NaOH solution was used as the regeneration solution to break the hydrogen bonds between base pairs of hybridised dsDNA. With the result from Fig. 9, it is notable that the DNA biosensor response declined significantly after incubation in 0.1 M of NaOH and the percentage of the DNA biosensor response reduced from 35.1 to 5.2% relative to the DNA biosensor initial response after incubation in 0.1 M of NaOH solution from 30 to 240 s. The DNA biosensor response decreased with the increasing incubation time signifies the hydrogen bonds between hybridised dsDNA were broken up by the alkaline regeneration solution. However, rehybridisation of the DNA biosensor was able to attain almost 100% of its initial response for a consecutive six DNA analyses with a reversibility RSD of 5%.

Repeatability of V. cholerae DNA biosensor using 0.1 M NaOH regeneration solution and rehybridization solution containing 5 μM cDNA and detection probe and 1 mM AQMS at 2.0 M ionic strength in 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 7.0)

Determination of V. cholerae Bacteria with the Developed DNA Biosensor

The optimised DNA biosensor has been applied to quantify the V. cholerae DNA extracted from various V. cholerae bacterial strains. Table 3 presents the results acquired from DNA tests carried out with the hybridisation medium spiked with different strains of V. cholerae DNAs and other bacterial species at a concentration within the calibration range of the DNA biosensor. The DNA biosensor showed superior selectivity towards V. cholerae J3324–I, V. cholerae J3324–II, and V. cholerae UVC1324 with high DPV current response and low current signals were obtained for the evaluation of both Citrobacter freundii (CF-I) and Citrobacter freundii (CF-II).

Recovery of V. cholerae J3324 and V. cholerae UVC1324 DNAs at three different concentrations spiked into the hybridisation buffer demonstrated 91.4 ± 2.2% to 108.9 ± 4.8% (n =3) of recoveries percentage (Table 4). This result suggests that the proposed PSA-AuNPs-based electrochemical DNA biosensor could be adopted for highly reliable and accurate detection of V. cholerae DNA in environmental and clinical samples.

Performance Comparison with Other Reported V. cholerae DNA Biosensors

Based on the data summarised in Table 5, the proposed electrochemical DNA biosensor based on PSA-AuNPs immobilisation material shows an exceptional broad linear quantification range compared to other planar two-dimensional electrodes as the DNA supporters. This clearly demonstrates the advantage of the micro-sized latex particles where the polymeric PSA is capable to intensify the probe binding capacity with a simple loading method via the classical EDC/NHS coupling compared to avidin-biotin technology [24, 26] and ultra-low detection limit in zeptomolar range with reasonable assay time.

Conclusions

This study reports the development of an electrochemical DNA biosensor for the detection of one of the most devastating high-risk V. cholerae pathogens. The PSA-AuNPs-modified DNA biosensor can be used for direct detection of DNA of interest from the extracted DNA without the need of amplification reaction via conventional PCR method, which is commonly used in those previously reported V. cholerae DNA biosensors. In addition, no further dilution of the extracted DNA is needed as the high-capacity AuNPs-doped latex microspheres-based DNA biosensor is highly sensitive for the quantitation of DNA at extremely low level in sub zeptomolar range. Therefore, the electrochemical DNA biosensor is greatly suitable as a surveillance and diagnostic tool to control the epidemic of the fatal intestinal infection.