Ультрачувствительный электрохимический ДНК-биосенсор для детекции Vibrio cholerae на полистирол-акриловой кислоте наночастицах и золотистых наночастицах

Аннотация

Мы сообщаем о высокочувствительном электрохимическом ДНК-биосенсоре для обнаружения ДНК Vibrio cholerae. Сенсор использует полистирол-ко-акриловую кислоту (PSA) латекс наносферы, загруженные золотистыми наночастицами (AuNP), как ДНК-носительную матрицу. Дифференциальный пульсовый вольтамперометрией (DPV) с антрахинон-базированным олигонуклеотидным маркером измеряют гибридизационный сигнал. AuNP значительно усиливают фарадейский ток, давая воспроизводимый линейный отклик от 1,0×10⁻²¹ до 1,0×10⁻⁸ М (RSD = 4,5%, n = 5) и предел детекции (LOD) 1,0×10⁻²¹ М (R² = 0,99). Рекуперация в засеянных образцах 91–109% (n = 3). Сенсор сохраняет 95% исходного отклика после 58 дней и может быть переиспользован шесть раз с RSD 5% (n = 5).

Введение

Vibrio cholerae остается глобальной угрозой здоровью, особенно в низкоресурсных условиях. Традиционные культурные методы медленны и трудоемки, ПЦР требует дорогого оборудования и квалифицированных операторов. Быстрые, недорогие и высокочувствительные диагностики необходимы для своевременного контроля вспышек. Электрохимические ДНК-биосенсоры предлагают высокую чувствительность, специфичность и потенциал миниатюризации, делая их идеальными для point-of-care тестирования.

Методы

Химические реактивы

Полистирол, акриловая кислота, HAuCl₄·3H₂O, тринатрий цитрат и др. от Fluka, Sigma-Aldrich, Riedel-De Haën. Целевые, мисматч и репортер олигонуклеотиды синтезированы Bio Service Unit (NSTDA) и Bioneer.

Аппарат

DPV измерения на экранно-печатанном углеродном электроде (SPE) с Ag/AgCl референсом и платиновым контр-электродом, Autolab PGSTAT12 потенциостат. Электрохимические параметры: 0,02 В шаг, 0,5 В/с сканирование, 0,05 М фосфатный буфер, pH 7.

Синтез AuNP и PSA латексных частиц

AuNP готовили цитратным восстановлением (метод Туркевича). PSA латексные сферы синтезировали мыло-бесплатной эмульсионной кополимеризацией стирола и акриловой кислоты, давая субмикронные частицы (~186 нм) с обильными карбоксильными группами для ДНК присоединения.

Модификация электрода и иммобилизация ДНК

PSA частицы каплевали на SPE, затем осаждали AuNP. EDC/NHS сцепление в pH 5 буфере активировало карбоксильные группы, затем иммобилизовали 5 мкМ захвата зонда. Гибридизация с 1 мкМ целевой ДНК и 5 мМ антрахинон маркером (AQMS) шла в два этапа: захват-цель и репортер-связывание, каждый 1 ч.

Оптимизация

Загрузка зонда (1–6 мкМ) и AQMS концентрация (0,1–5 мМ) оптимизировали; 4 мкМ зонд и 1 мМ AQMS дали максимальный отклик. pH 7, 0,05 М фосфатный буфер, 2,0 М NaCl обеспечили оптимальные ионные условия. Время гибридизации 60 мин и иммобилизации зонда 8 ч выбрали.

Оценка производительности

Сенсор продемонстрировал линейный диапазон 1,0×10⁻²¹ – 1,0×10⁻⁸ М с LOD 1,0×10⁻²¹ М. Тесты рекуперации в засеянных образцах (1,0×10⁻⁴ – 1,0×10⁻⁶ мкг/мкл) дали 91,4–108,9% (n = 3). Изучения сроков годности показали 95% активности после 58 дней; сенсор регенерировали 0,1 М NaOH и переиспользовали шесть раз с 5% RSD.

Результаты и обсуждение

SEM подтвердил равномерные PSA сферы (~186 нм). DPV анализ показал, что загрузка AuNP снизила разделение пиковых потенциалов (ΔE_p), указывая на улучшенный электронный перенос. Гибридизационные эксперименты раскрыли выраженный рост DPV пикового тока только при наличии обоих целевого и репортер зондов, подтверждая сендвич-тип специфичность. Оптимальная загрузка зонда и AQMS концентрация идентифицированы; более высокие плотности зондов приводили к плато отклика, избыточный AQMS вызывал фоновый шум. pH 7, Na⁺ ионы и высокая ионная сила (2,0 М NaCl) максимизировали гибридизационную эффективность.

Калибровочная кривая показала отличную линейность (R² = 0,99). Сенсорный субзептомолярный LOD превосходит ранее сообщенные PSA-базированные или авидин-биотиновые системы, сохраняя быстрое время анализа (~60 мин). Стабильность тесты демонстрировали минимальную потерю сигнала за 58 дней, и регенерационные протоколы восстанавливали полную активность до шести циклов.

Заключение

Мы разработали надежный, бесподсиливающий электрохимический ДНК-биосенсор, обнаруживающий ДНК V. cholerae при субзептомолярных концентрациях с высокой специфичностью и воспроизводимостью. Его простая фабрикация, быстрое время анализа и долгий срок годности делают его пригодным для полевого развертывания в условиях вспышек.