Флуоресцентный аптасенсор на основе оксида графена для обнаружения включения CCRF-CEM

Фон

Лейкоз - агрессивное и распространенное злокачественное гематологическое заболевание, представляющее угрозу для выживания и здоровья человека, особенно детей и подростков [1, 2]. Он влияет не только на нормальные кроветворные клетки организма, но и на костный мозг, а также на иммунную систему [3,4,5]. Поэтому ранняя диагностика лейкемии для лечения и улучшения качества жизни пациентов имеет важное значение. В настоящее время обычно используемым методом выявления лейкемии является взятие клеток периферической крови и костного мозга, после чего проводится множество видов анализов [6], включая морфологию клеток, цитохимию [7,8,9], иммунофенотип [10, 11], иммуногистохимический анализ. [12, 13] и проточная цитометрия на основе аптамеров [14, 15]. Эти методы могут обнаруживать лейкозные клетки, но у них все еще есть много недостатков, таких как высокая стоимость, низкая чувствительность и сложность. Поэтому очень срочно найти недорогой, высокочувствительный и простой метод выявления лейкемии.

Аптамеры, которые представляют собой короткую одноцепочечную ДНК (оцДНК) или РНК, были проверены in vitro скринингом систематической эволюции лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX) [16, 17]. Основываясь на специальных третичных структурах, аптамеры обладают высокой аффинностью связывания и высокой специфичностью с мишенями, включая небольшие органические молекулы, белки и даже клетки [18,19,20]. Более того, аптамеры также легко синтезируются и модифицируются, поэтому они широко используются в качестве зондов для обнаружения рака [21]. Функционализированные наноматериалы на основе аптамеров для обнаружения рака также являются горячими точками в последние годы [22, 23], такие как квантовые точки и наночастицы кремнезема [24].

Оксид графена (GO), как новый двумерный планарный углеродный наноматериал, привлек значительное внимание благодаря своим уникальным свойствам, включая хорошую растворимость в воде [25], большую удельную поверхность и превосходную способность гасить флуоресценцию [26, 27]. Основываясь на этих свойствах, GO считается превосходным рецептором энергии в резонансном переносе энергии флуоресценции (FRET), что делает GO перспективным для широкого применения в флуоресцентных аптасенсорах [28]. Более того, GO может связываться с аптамерами с помощью π - π стэкинг-взаимодействий, но не с двухцепочечной ДНК или комплексами аптамер-мишень [19, 29, 30]. Следовательно, датчик аптамера на основе графена может улучшить стабильность аптамера по сравнению со свободным аптамерным зондом [31].

В настоящее время во многих исследованиях сообщается о возможности использования флуоресцентного аптасенсора на основе оксида графена для обнаружения мишени [21, 32]. Тем не менее, до сих пор было проведено несколько исследований с использованием аптасенсора на основе ГО для лейкозных клеток. Здесь мы разработали новую стратегию для обнаружения "включения" сигнала лейкозных клеток на основе GO и карбоксифлуоресцеин-меченного аптамера Sgc8 (FAM-apt). GO и аптамер использовали в качестве тушителя флуоресценции и агента-мишени соответственно. В отсутствие лейкозных клеток GO может взаимодействовать с FAM-apt и гасить почти всю флуоресценцию, а сигнал обнаружения отключается. Однако, когда клетки-мишени присутствуют, аптамеры активно нацелены на клетки и отпадают от GO, что приводит к восстановлению флуоресценции в системе обнаружения и включению сигнала обнаружения. Следовательно, концентрацию клеток-мишеней можно измерить соответственно по изменению интенсивности флуоресценции.

Методы

Реагенты

FFAM-apt с последовательностью 5'-FAM-AT CTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3 'был синтезирован компанией Sangon Biotech Co., Ltd. (Шанхай, Китай). В этой работе использовался саморегулирующийся буфер Трис-HCl, включая 20 мМ Трис-HCl (pH 7,4), 5 мМ MgCl ₂ , и 100 мМ NaCl. Аптамеры, использованные в этом эксперименте, растворяли в буфере Tris-HCl. Порошок оксида графена был приобретен в Xianfeng Nano Materials Tech Co., Ltd. (Нанкин, Китай). Все растворы были приготовлены с использованием сверхчистой воды 18 МОм, очищенной в системе очистки Milli-Q (Millipore, Бедфорд, Массачусетс, США).

Ячейки

Клеточные линии CCRF-CEM (линии клеток острого лейкозного лимфобласта человека), Ramos (линии клеток лимфомы Беркитта человека), 293T (линии клеток эмбриональной почки человека) и H22 (линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы мыши) были приобретены в Банке клеток Китая. Академия наук (Шанхай, Китай). Все клеточные линии культивировали при 5% двуокиси углерода и 37 ° C, а среда 1640 содержала 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS; HyClone) и 100 Ед / мл пенициллин-стрептомицин (Гибко, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США).

Аппарат

Все спектры флуоресценции и интенсивность флуоресценции измеряли и регистрировали на флуоресцентном спектрофотометре F-7000 (Hitachi Company, Tokyo, Japan). Для хранения раствора пробы использовали кварцевую кювету емкостью 700 мкл. Благодаря характерным длинам волн пиков карбоксилфлуоресцеина (FAM) интенсивность люминесценции контролировали путем возбуждения образца при 490 нм и измерения эмиссии при 518 нм.

Все изображения, полученные с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ), были получены с помощью микроскопа SPI3800N (Seiko Instruments Industry Co., Токио, Япония).

Дзета-потенциал GO, FAM-apt и комплекса оксид графена с аптамером (GO-apt) определяли с помощью анализатора размера наночастиц, дзета-потенциала и абсолютной молекулярной массы (Zetasizer Nano ZS, Малверн, Великобритания).

Спектры поглощения GO, FAM-apt и GO-apt в УФ и видимой областях регистрировали на NanoDrop 2000 (Thermo, США).

Подготовка флуоресцентного аптасенсора GO-apt

Порошок оксида графена растворяли и рассыпали в очищенной воде Milli-Q, а затем диспергировали с помощью ультразвука для получения гомогенного черного раствора с концентрацией 1 мг / мл. Разбавив исходный раствор 20 мМ трис-HCl буфером, мы получили концентрацию 20 нМ FAM-apt. После этого 1 мкл FAM-apt (10 мкМ) и 10 мкл раствора GO (1 мг / мл) были смешаны, а затем разбавлены буфером Tris-HCl до 500 мкл.

Получение изображений клеток

Клетки CCRF-CEM и Ramos культивировали в течение 12 ч в шестилуночных планшетах (5 × 10 ⁵ клеток на лунку). Клетки дважды промывали холодным фосфатно-солевым буфером (PBS) и инкубировали с раствором GO-apt при 4 ° C в темноте в течение 30 мин. Затем клетки промывали трижды и фиксировали в течение 20 мин 4% полиоксиметиленом. Клетки снова промывали PBS и окрашивали дигидрохлоридом 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI; Life Co., США) в течение 5 минут в темноте. Наконец, клетки трижды промывали PBS и исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии (Nikon DS-Ri1; Япония).

Обнаружение ячеек CCRF-CEM

Клетки CCRF-CEM собирали центрифугированием и суспендировали в 1 мл PBS. Различные концентрации клеток CCRF-CEM (от 0 до 1,0 × 10 ⁷ / мл) инкубировали с флуоресцентным аптасенсором GO-apt при 4 ° C в темноте в течение 30 мин. После инкубации клетки CCRF-CEM детектировали с помощью флуоресцентной спектроскопии в диапазоне длин волн 560–500 нм. Предел обнаружения (LOD) оценивается на основе 3 σ / S расчет, где σ стандартное отклонение для решения GO-apt ( n =10) и S - наклон линейного уравнения [33].

Анализ специфичности

Чтобы исследовать специфичность флуоресцентного аптасенсора на основе ГО, мы протестировали систему с несколькими различными клетками, включая клетки Рамоса, клетки H22 и клетки 293T. Каждая из 100 мкл реакционных систем включала 1 × 10 ⁶ ячеек.

Статистический анализ

Каждый эксперимент повторяли трижды. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения SigmaPlot 12.5, а статистический анализ выполняли с помощью GraphPad Prism 6.02 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Порог значимости во всех анализах был P <0,0001.

Результаты и обсуждение

Принцип использования флуоресцентного аптасенсора GO-apt для обнаружения CCRF-CEM

В этом исследовании GO и FAM-apt были использованы для создания флуоресцентного аптасенсора для обнаружения клеток CCRF-CEM. Принцип действия флуоресцентного сенсора для обнаружения клеток CCRF-CEM показан на рис. 1. В отсутствие клеток CCRF-CEM модифицированные FAM аптамеры адсорбируются на поверхности GO за счет π - π штабелирование. Так как GO и флуорофор находятся слишком близко к переносу энергии, то в качестве гасителя GO гасит флуоресценцию FAM. В присутствии клеток CCRF-CEM слабая сила связывания GO-аптамера позволяет аптамеру упасть с поверхности GO и связываться с клетками, вызывая восстановление флуоресценции. Следовательно, количество клеток CCRF-CEM может быть определено соответственно в соответствии с восстановлением интенсивности флуоресценции FAM.

Схематическое изображение флуоресцентного аптасенсора GO-apt для обнаружения клеток CCRF-CEM

Тушение и восстановление флуоресценции

Этот непрерывный процесс гашения флуоресценции ГО и возврата флуоресценции в присутствии клеток CCRF-CEM можно наблюдать с помощью флуоресцентного спектрофотометра. Весь процесс зондирования на основе аптамеров GO-флуоресценции показан на рис. 2а. Спектр флуоресценции FAM-apt в 25 нМ трис-HCl буфере демонстрирует сильную интенсивность флуоресценции благодаря присутствию FAM (рис. 2а, кривая а). Однако при добавлении ГО интенсивность флуоресценции заметно снижалась (рис. 2а, кривая b), что указывает на то, что ГО был способен эффективно гасить флуоресценцию, когда ГО и аптамеры были близко друг к другу и адсорбировались вместе. Удивительно, но когда 5 × 10 ⁶ Добавляли клетки CCRF-CEM, тушенная флуоресценция могла восстанавливаться со временем (фиг. 2a, кривая c). Тем не менее, интенсивность флуоресценции FAM-apt без конъюгации GO не претерпела явных изменений при добавлении клеток CCRF-CEM (рис. 2а, кривая d). CCRF-CEM - нефлуоресцентная клетка (рис. 2а, кривая е); следовательно, восстановление флуоресценции происходит в основном за счет диссоциации аптамера с поверхности графена и обнажения флуоресцентной группы. Эти эксперименты по тушению и восстановлению флуоресценции ясно продемонстрировали, что комплекс CCRF-CEM-аптамер (CEM-apt) может препятствовать гашению FAM-apt под действием GO, а CEM имеет более сильное сродство связывания со своим аптамером, чем GO. Благодаря различию в структуре одноцепочечного аптамера и комплекса CEM-аптамер, аптамеры на поверхности GO могут взаимодействовать с CEM, а затем превращаться в комплекс CEM-аптамер. Это явление также ясно указывает на то, что связывание комплекса СЕМ-аптамер с аптамером слабее, чем у ГО, что позволяет аптамеру упасть с поверхности ГО. Поскольку FAM-apt расположен вдали от поверхности GO и эффективность передачи энергии снижается, флуоресценция восстанавливается. Статистический анализ спектров излучения флуоресценции аптамера Sgc8, меченного FAM, и CCRF-CEM проводили в различных условиях (рис. 2b).

Возможность успешного обнаружения клеток CEM. а Спектры излучения флуоресценции клеток FAM-apt и CCRF-CEM в различных условиях:(а) FAM-apt, (б) FAM-apt + GO, (в) FAM-apt + GO + CCFF-CEM, (г) FAM- apt + CCFF-CEM и (e) CCRF-CEM; FAM-apt (20 нМ); ГО (25 мкг / мл); CCRF-CEM (1 × 10 ⁶ ячеек). Возбуждение 490 нм. б Статистический анализ спектров излучения флуоресценции FAM-apt и CCRF-CEM в различных условиях. NS не имеет значения. **** P <0,0001

Характеристики флуоресцентного аптасенсора GO-apt

Для проверки конструкции был получен единый и децентрализованный ГО. Из рис. 3а мы знаем, что лист GO толщиной 1,17 нм имеет типичный двумерный вид с помощью АСМ. Однако GO-apt толщиной 1,94 нм показал, что FAM-apt успешно абсорбируется на поверхность GO. Дзета-потенциал FAM-apt и GO составлял -11,35 и -23,90 мВ, соответственно, но когда GO неконвалентно взаимодействует с FAM-apt, абсолютное значение дзета-потенциала увеличивается (фиг. 3b). Эти результаты показали, что аптасенсоры были успешно сконструированы. Из рис. 3c мы знаем, что GO демонстрирует сильное поглощение на длине волны 234 нм, которое приписывается π - π * переходы ароматических связей C =C. FAM-apt характеризуется полосами поглощения последовательности ДНК (260 нм) и FAM (503 нм), тогда как добавление GO в раствор FAM-apt вызывает красный сдвиг, а поглощение FAM при 503 нм увеличивается. Возможная причина в том, что FAM-apt адсорбируется на поверхности GO, что указывает на электронные взаимодействия между двумя π системы ГО и красители в основном состоянии. Таким образом, результаты показали, что GO-apt был успешно построен.

Характеристика GO-apt. а АСМ изображения GO и CEM-apt. б Поверхностный дзета-потенциал FAM-apt, GO и CEM-apt. Планки погрешностей указывают ± SD ( n =3). c Спектры поглощения в УФ-видимой области (а) GO, (b) FAM-apt и (c) GO-apt

Флуоресцентная микроскопия клеток

Чтобы непосредственно визуализировать специфичность связывания упавшего FAM-apt на клеточном уровне, мы инкубировали клетки CCRF-CEM и Ramos с Go-apt, а затем проанализировали их с помощью флуоресцентной микроскопии. В соответствии с экспериментами по спектру флуоресценции, FAM-apt может падать с Go-apt и затем связываться с клетками CCRF-CEM для флуоресцентного окрашивания, но не с клетками Ramos (рис. 4).

Флуоресцентные микрофотографии клеток CCRF-CEM и Ramos после смешивания с GO-apt. Ядра окрашивали DAPI. Шкала показывает 25 мкм

Оптимизация экспериментальных условий для обнаружения CCRF-CEM

Чтобы получить отличные характеристики флуоресцентного аптасенсора, время гашения и восстановления флуоресценции было оптимизировано. Кинетическое поведение FAM-apt и GO, а также FAM-apt в гомогенном растворе GO с клетками CCRF-CEM было исследовано путем мониторинга интенсивности флуоресценции как функции времени тушения и восстановления (рис. 5a, b). Как показано на фиг. 5а, можно наблюдать тушение флуоресценции FAM-apt как функцию времени инкубации в присутствии ГО. FAM-apt быстро адсорбируется на поверхности GO и после этого подвергается передаче энергии, и в то же время интенсивность флуоресценции значительно снижается и имеет тенденцию к замедлению через 2 мин. Напротив, образуется CEM-apt, и высвобождение с поверхности GO происходит медленнее. Интенсивность флуоресценции достигала платформы, когда время инкубации превышало 30 мин (рис. 5b). Эти эксперименты, зависящие от времени, показывают, что ГО, являясь отличным гасителем, быстро гасит флуоресценцию FAM-apt и постепенно восстанавливает флуоресценцию в присутствии СЕМ.

Оптимизация экспериментальных условий. а Тушение флуоресценции FAM-apt (20 нМ) в буфере Tris-HCl с помощью GO как функция времени. б Восстановление флуоресценции FAM-apt в растворе GO методом CCRF-CEM (1 × 10 ⁶ ) как функция времени. c Влияние концентрации ГО на интенсивность флуоресценции FAM-apt в отсутствие (кривая а) и в присутствии (кривая б) 1 × 10 ⁶ Клетки CCRF-CEM. г Интенсивность флуоресценции ( F / F ₀ ) FAM-apt на 1 × 10 ⁶ Клетки CCRF-CEM как функция концентрации ГО. Возбуждение 490 нм

Чтобы сделать флуоресцентный аптасенсор более чувствительным к обнаружению CCRF-CEM, незаменима реакционная система, используемая для оптимизации концентрации GO. Рисунок 5c, который ясно иллюстрирует нашу стратегию, показывает влияние различных концентраций GO на интенсивность флуоресценции FAM-apt в отсутствие (фиг. 5c, кривая a) и в присутствии (фиг. 5c, кривая b) CCRF -CEM. Как видно из рис. 5в, при добавлении ГО фон сигнала флуоресценции значительно снижается. На рис. 5г показано восстановление флуоресценции FAM-apt на 1 × 10 ⁶ Зависимость клеток CEM от концентрации GO. Из рис. 5d видно, что когда концентрация GO составляет 20 мкг / мл, соотношение F / F ₀ (где F ₀ и F представляют собой интенсивности флуоресценции FAM при 518 нм в отсутствие и в присутствии CCRF-CEM, соответственно) получает наивысшее значение, которое составляет 13,0354. Поэтому оптимальной концентрацией ГО считалось 20 мкг / мл.

Обнаружение CCRF-CEM с помощью флуоресцентного аптасенсора GO-apt

Чтобы получить хорошие экспериментальные результаты, были использованы оптимальные экспериментальные условия для обнаружения CCRF-CEM. На рисунке 6а показано, что при увеличении количества CCRF-CEM от 0 до 1 × 10 ⁷ , соответственно увеличивается и интенсивность флуоресценции. Кроме того, F / F ₀ показывает четкую линейную зависимость от количества CCRF-CEM в диапазоне 1 × 10 ² –1 × 10 ⁷ (Рис. 6б). Уравнение линейной регрессии: Y ( F / F ₀ ) =3,2608 × log C - 5,1892 (где C - количество CCRF-CEM) с коэффициентом регрессии R ² =0,9922. Предел обнаружения считается менее десяти ячеек. Следовательно, зондирование флуоресцентного аптамера на основе GO имеет широкий диапазон обнаружения, поэтому его можно использовать в качестве идеального биосенсора для обнаружения CCRF-CEM. По сравнению с другими методами, этот метод имеет более высокую чувствительность (таблица 1) [34,35,36,37,38,39].

Эффективное обнаружение клеток CEM. а Спектры флуоресценции флуоресцентного аптасенсора GO-apt в присутствии различных концентраций клеток CCRF-CEM. б Линейная зависимость между интенсивностью флуоресценции ( F / F ₀ ) и концентрации клеток CCRF-CEM

Специфика флуоресцентного аптасенсора GO-apt

Чтобы исследовать специфичность флуоресцентных адаптеров GO-apt, для тестирования системы было использовано несколько различных клеток, таких как клетки Ramos, клетки H22 и клетки 293T. Каждая из 100 мкл реакционных систем включала 1 × 10 ⁶ клетки. На рисунке 7 показано, что CCRF-CEM имеет более высокую интенсивность флуоресценции, чем другие контрольные группы. Результаты также ясно показали, что разработанный флуоресцентный аптасенсор обладает высокой специфичностью.

Специфика флуоресцентного аптасенсора для CEM. Интенсивность флуоресценции ( F / F ₀ ) флуоресцентного аптасенсора GO-apt в присутствии клеток CEM, клеток Ramos, клеток H22 и клеток 293T, соответственно (1 × 10 ⁶ ), где F ₀ и F - интенсивность флуоресценции без и с детектирующими ячейками при 518 нм. Возбуждение 490 нм

Выводы

Мы разработали удобный, недорогой и высокочувствительный флуоресцентный аптасенсор для обнаружения клеток CCRF-CEM. Эта стратегия умело использует взаимодействие нековалентных связей посредством π - π стекинг между графеном и одноцепочечной ДНК и превосходные характеристики гашения флуоресценции графена. По сравнению с аптамером связывание комплекса СЕМ-аптамер с ГО слабое, поэтому флуоресценция, тушенная графеном, может постепенно восстанавливаться. В оптимизированных условиях предел обнаружения составляет менее 100 ячеек. Таким образом, благодаря отличным характеристикам флуоресцентный аптасенсор имеет широкие перспективы в обнаружении опухолевых клеток.

История изменений

Сокращения

AFM:

Атомно-силовая микроскопия

CEM-apt:

CCRF-CEM-аптамерный комплекс

FAM-apt:

Меченый FAM аптамер Sgc8

FRET:

Флуоресцентный резонансный перенос энергии

GO:

Оксид графена

GO-apt:

Комплекс оксид графена-аптамер

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером