Высокочувствительный флуоресцентный аptaсенсор на оксиде графена для быстрого обнаружения лейкемических клеток CCRF-CEM

Аннотация

Разработан удобный, дешевый и высокочувствительный флуоресцентный аptaсенсор для детекции лейкемии на базе оксида графена-аptaмерного комплекса (GO-apt). Оксид графена (GO) может адсорбировать карбоксифлуоресцеин-маркированный Sgc8 аptaмер (FAM-apt) через π-π стакинг и гасить флуоресценцию через флуоресценционный резонансный энергетический перенос (FRET). В отсутствии мишеневой клетки CCRF-CEM Sgc8 флуоресценция почти полностью погашена. И наоборот, при добавлении CCRF-CEM клеток погашенная флуоресценция быстро и значимо восстанавливается. Следовательно, основан на изменении флуоресцентных сигналов, можно детектировать число CCRF-CEM клеток в широком диапазоне от 1 × 10² до 1 × 10⁷ клеток/мл с пределом детекции (LOD) 10 клеток/мл. Эта стратегия оксида графена-базированного флуоресцентного аptaсенсора может быть перспективной для раковой детекции.

Введение

Лейкемия — агрессивное и распространенное злокачественное гематологическое заболевание, угрожающее выживанию и здоровью людей, особенно детей и подростков [1, 2]. Она затрагивает не только нормальные гематопоэтические клетки организма, но также костный мозг и иммунную систему [3,4,5]. Поэтому ранняя диагностика лейкемии для лечения и улучшения качества жизни пациентов является существенной. В настоящее время распространенный метод детекции лейкемии — взятие периферической крови и костного мозга, после чего проводят много виды анализа [6], включая клеточную морфологию, цитобиохимию [7,8,9], иммунофенотипирование [10, 11], иммуногистохимию [12, 13] и аptaмер-базированную потоковую цитометрию [14, 15]. Эти методы могут детектировать лейкемические клетки, но все еще имеют много недостатков, таких как высокая стоимость, низкая чувствительность и сложность. Поэтому очень срочно найти дешевый, высокочувствительный и простой метод для детекции лейкемии.

Аptaмеры — короткие однокатечальные ДНК (ssDNA) или РНК, отобранные in vitro скринингом систематической эволюции лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX) [16, 17]. Благодаря специальным третичным структурам, аptaмеры имеют надежную связывающую аффинность и высокую специфичность с мишенями, включая малые органические молекулы, белки и даже клетки [18,19,20]. Более того, аptaмеры также имеют характеристики легкой синтеза и модификации, поэтому широко используются как раковые детекционные пробы [21]. Функционализированные наноматериалы на базе аptaмеров для раковой детекции также горячие темы последних лет [22, 23], такие как квантовые точки и кремнезовые наночастицы [24].

Оксид графена (GO), как новый двумерный планарный углерод наноматериал, получил существенное внимание благодаря уникальным свойствам, включая хорошую водную растворимость [25], большую удельную площадь и отличную способность гасить флуоресценцию [26, 27]. Основан на этих свойствах, GO считается отличным энергетическим акцептором в флуоресценционном резонансном энергетическом переносе (FRET), что делает GO перспективным для флуоресцентного аptaсенсора [28]. Более того, GO может связываться с аptaмерами через π-π стакинг взаимодействия, но не с двухкатечальной ДНК или аptaмер-мишень комплексами [19, 29, 30]. Следовательно, графен-базированный аptaмер сенсор может улучшить стабильность аptaмера по сравнению с свободным аptaмерным пробой [31].

В настоящее время множество исследований сообщали, что стратегия оксида графена-базированного флуоресцентного аptaсенсора для детекции мишени выполнима [21, 32]. Тем не менее, мало исследований проводилось с использованием GO-базированного аptaсенсора для лейкемических клеток до сих пор. Здесь мы спроектировали новую стратегию для сигнального «включения» детекции лейкемических клеток на базе GO и карбоксифлуоресцеин-маркированного Sgc8 аptaмера (FAM-apt). GO и аptaмер использовались как флуоресцентный гаситель и мишеней агент соответственно. В отсутствии лейкемических клеток GO может взаимодействовать с FAM-apt и гасить почти всю флуоресценцию, и детекционный сигнал выключен. Однако когда мишеневые клетки присутствуют, аptaмеры активно целят клетки и отходят от GO, приводя к флуоресцентному восстановлению в детекционной системе, и детекционный сигнал включен. Поэтому мишеневой клеточный концентрация может быть измерена соответственно согласно изменению флуоресцентной интенсивности.

Методы

Реактивы

FAM-apt с последовательностью 5′-FAM-AT CTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3′ синтезирован Sangon Biotech Co., Ltd. (Шанхай, Китай). В работе использовали саморегулирующий Tris-HCl буфер, включающий 20 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 5 мМ MgCl₂ и 100 мМ NaCl. Аptaмеры, используемые в эксперименте, растворяли Tris-HCl буфером. Оксид графена порошок приобрели у Xianfeng Nano Materials Tech Co., Ltd. (Нанкин, Китай). Все растворы готовили ультрачистой водой 18 МОм из Milli-Q системы очистки (Millipore, Бедфорд, MA, США).

Клетки

CCRF-CEM (человеческие острые лейкемические лимфобластные клеточные линии), Ramos (человеческие лимфомные Беркитта клеточные линии), 293T (человеческие эмбриональные почечные клеточные линии) и H22 (мышиные гепатоцеллюлярные карциномные клеточные линии) клеточные линии приобрели из Клеточного банка Китайской академии наук (Шанхай, Китай). Все клеточные линии культивировали при 5% углекислого газа и 37 °C, среда 1640 содержит 10% фетовый бычий сиворотка (FBS; HyClone) и 100 ЕД/мл пенициллин-стрептомицин (Gibco, Гранд-Айленд, NY, США).

Аппаратура

Все флуоресцентные спектры и флуоресцентная интенсивность измеряли и записывали флуоресцентным спектрофотометром F-7000 (Hitachi Company, Токио, Япония). 700-мкл кварцевая кювета использовалась для удержания образцового раствора. Благодаря характерным пиковым длинам волн карбоксифлуоресцеина (FAM), люминесцентная интенсивность мониторилась возбуждением образца при 490 нм и измерением эмиссии при 518 нм.

Все атомно-силовой микроскопии (AFM) образы получали на SPI3800N микроскопе (Seiko Instruments Industry Co., Токио, Япония).

Зета-потенциал GO, FAM-apt и оксида графена-аptaмерного комплекса (GO-apt) определяли наночастицовым размером, зета-потенциалом и абсолютным молекулярным весом анализатором (Zetasizer Nano ZS, Malvern, UK).

UV-видимые абсорбционные спектры GO, FAM-apt и GO-apt записывали на NanoDrop 2000 (Thermo, США).

Подготовка GO-apt флуоресцентного аptaсенсора

Оксид графена порошок растворяли и диспергировали в Milli-Q очищенной воде, затем ультразвуково обрабатывали для получения однородного черного раствора концентрации 1 мг/мл. Разбавляли стоковый раствор 20 мМ Tris-HCl буфером, получали концентрацию 20 нМ FAM-apt. После этого 1 мкл FAM-apt (10 мкМ) и 10 мкл GO раствора (1 мг/мл) как приготовленные смешивали и затем разбавляли Tris-HCl буфером до 500 мкл.

Клеточное визуализирование

CCRF-CEM и Ramos клетки культивировали 12 ч в 6-колодчатых пластинках (5 × 10⁵ клеток на колодец). Клетки промывали дважды холодным фосфатно-буферным салином (PBS) и инкубировали с GO-apt раствором при 4 °C в темноте за 30 мин. Затем клетки промывали трижды и фиксировали 20 мин 4% полиоксиметиленом. Клетки снова промывали PBS и окрашивали 4′,6-диамидино-2-фенилиндигидрохлоридом (DAPI; Life Co., США) за 5 мин в темноте. Наконец, клетки промывали трижды PBS и изучали флуоресцентной микроскопией (Nikon DS-Ri1; Япония).

Детекция CCRF-CEM клеток

CCRF-CEM клетки собирали центрифугированием и взвешивали в 1 мл PBS. Различные концентрации CCRF-CEM клеток (0 до 1,0 × 10⁷/мл) инкубировали с GO-apt флуоресцентным аptaсенсором при 4 °C в темноте за 30 мин. После инкубации CCRF-CEM клетки детектировали флуоресцентной спектроскопией в диапазоне длин волн 560–500 нм. Предел детекции (LOD) оценивали на базе 3σ / S расчета, где σ — стандартное отклонение для GO-apt раствора (n = 10) и S — наклон линейного уравнения [33].

Специфичность тест

Для исследования специфичности GO-базированного флуоресцентного аptaсенсора тестировали систему с несколькими разными клетками, включая Ramos клетки, H22 клетки и 293T клетки. Каждая из 100-мкл реакционных систем включала 1 × 10⁶ клеток.

Статистические анализы

Каждый эксперимент повторяли три раза. Данные обрабатывали ПО SigmaPlot 12.5, статистические анализы выполняли GraphPad Prism 6.02 (GraphPad Software, Сан-Диего, CA, США). Порог значимости во всех анализах был P < 0,0001.

Результаты и обсуждение

Принцип GO-apt флуоресцентного аptaсенсора для детекции CCRF-CEM

В этом исследовании GO и FAM-apt использовали для проектирования флуоресцентного аptaсенсора для детекции CCRF-CEM клеток. Принцип флуоресцентного сенсора для детекции CCRF-CEM клеток показан на Рис. 1. В отсутствии CCRF-CEM клеток FAM-модифицированные аptaмеры адсорбируются на GO поверхность π-π стакингом. Поскольку GO и флуофор слишком близки к энергетическому переносу, как гаситель, GO гасит флуоресценцию FAM. В присутствии CCRF-CEM клеток слабая связывающая сила GO-аptaмера позволяет аptaмеру отойти от GO поверхности и связаться с клетками, вызывая флуоресцентное восстановление. Поэтому число CCRF-CEM клеток может быть детектировано соответственно согласно восстановлению FAM флуоресцентной интенсивности.

Флуоресцентное гашение и восстановление

Этот непрерывный процесс гашения флуоресценции GO и возврата флуоресценции в присутствии CCRF-CEM клеток может быть наблюдаен флуоресцентным спектрофотометром. Весь процесс сенсинга на базе GO-флуоресцентных аptaмеров показан на Рис. 2a. Флуоресцентный спектр FAM-apt в 25 нМ Tris-HCl буфере представляет сильную флуоресцентную интенсивность благодаря наличию FAM (Рис. 2a, кривая a). Однако при добавлении GO флуоресцентная интенсивность заметно снижалась (Рис. 2a, кривая b), указывая, что GO способен эффективно гасить флуоресценцию, когда GO и аptaмеры близки и адсорбированы вместе. Удивительно, когда 5 × 10⁶ CCRF-CEM клетки добавляли, погашенная флуоресценция могла восстановиться во времени (Рис. 2a, кривая c). Тем не менее, флуоресцентная интенсивность FAM-apt без GO конъюгации не имеет очевидных изменений при добавлении CCRF-CEM клеток (Рис. 2a, кривая d). CCRF-CEM — не-флуоресцентная клетка (Рис. 2a, кривая e); поэтому флуоресцентное восстановление главным образом обусловлено диссоциацией аptaмера от поверхности графена и экспозицией флуоресцентной группы. Эти эксперименты флуоресцентного гашения и восстановления четко иллюстрировали, что CCRF-CEM-аptaмер комплекс (CEM-apt) может удерживать FAM-apt от гашения GO, и CEM имеет более сильную связывающую аффинность к своему аptaмеру, чем GO. Благодаря структурной разнице между однокатечальным аptaмером и CEM-аptaмер комплексом, аptaмеры на GO поверхности могут взаимодействовать с CEM и затем трансформироваться в CEM-аptaмер комплекс. Это явление также четко указывает, что связывание CEM-аptaмер комплекса с аptaмером слабее, чем GO, таким образом позволяя аptaмеру отойти от GO поверхности. Поскольку FAM-apt находится далеко от GO поверхности и эффективность энергетического переноса снижается, флуоресценция восстанавливается. Статистический анализ флуоресцентных эмиссионных спектров FAM-маркированного Sgc8 аptaмера и CCRF-CEM выполняли при разных условиях (Рис. 2b).

Характеристики GO-apt флуоресцентного аptaсенсора

Для верификации дизайна, получен равномерный и децентрализованный GO. С Риса. 3a известно, что GO лист с толщиной 1,17 нм обладает типичным двумерным внешним видом по AFM. Однако GO-apt с толщиной 1,94 нм показал, что FAM-apt успешно адсорбирован на GO поверхность. Зета-потенциал FAM-apt и GO был −11,35 и −23,90 мВ соответственно, но когда GO нековалентно взаимодействует с FAM-apt, абсолютное значение зета-потенциала увеличивается (Рис. 3b). Эти результаты указывали, что аptaсенсоры успешно построены. С Риса. 3c известно, что GO демонстрировал сильное поглощение при 234 нм, атрибутируемое π-π* переходам ароматических C=C связей. FAM-apt характеризуется поглощающими полосами ДНК последовательности (260 нм) и FAM (503 нм), тогда как добавление GO в FAM-apt раствор вызывает красный сдвиг и абсорбцию FAM при 503 нм увеличивается. Возможная причина: FAM-apt адсорбирован на GO поверхности, указывая на электронные взаимодействия между двумя π системами GO и красителей в основном состоянии. Следовательно, результаты указывали, что GO-apt успешно построен.

Флуоресцентная микроскопия клеток

Для прямой визуализации специфичности отшедшего FAM-apt связывания на клеточном уровне, инкубировали CCRF-CEM и Ramos клетки с Go-apt и затем анализировали флуоресцентной микроскопией. Согласовано с флуоресцентными спектральными экспериментами, FAM-apt может отойти от Go-apt и затем связаться с CCRF-CEM клетками для флуоресцентной окраски, но не с Ramos клетками (Рис. 4).

Оптимизация экспериментальных условий для детекции CCRF-CEM

Для получения отличной производительности флуоресцентного аptaсенсора, время флуоресцентного гашения и восстановления оптимизировали. Кинетические поведения FAM-apt и GO, а также FAM-apt в однородном GO растворе с CCRF-CEM клетками исследовали мониторением флуоресцентной интенсивности как функции гашения и восстановления времени (Рис. 5a, b). Как показано на Рис. 5a, флуоресцентное гашение FAM-apt как функция инкубационного времени в присутствии GO может быть наблюдаено. FAM-apt быстро адсорбируется на GO поверхность и, после этого, проходит энергетический перенос, и одновременно флуоресцентная интенсивность значимо снижается и склоняется к замедлению после 2 мин. Напротив, CEM-apt формируется и освобождение от GO поверхности медленнее. Флуоресцентная интенсивность достигала плато когда инкубационное время выше 30 мин (Рис. 5b). Эти время-зависимые эксперименты показывают, что GO как отличный гаситель быстро гасит FAM-apt флуоресценцию и постепенно восстанавливает флуоресценцию в присутствии CEM.

Для того чтобы сделать флуоресцентный аptaсенсор более чувствительным к детекции CCRF-CEM, реакционная система для оптимизации GO концентрации становится незаменимой. Рисунок 5c, четко иллюстрирующий нашу стратегию, показывает эффект разных концентраций GO на флуоресцентную интенсивность FAM-apt в отсутствии (Рис. 5c, кривая a) и в присутствии (Рис. 5c, кривая b) CCRF-CEM. Как мы видели с Риса. 5c, при добавлении GO флуоресцентный сигнальный фон значимо снижается. Рисунок 5d показывает восстановленную флуоресценцию FAM-apt 1 × 10⁶ CEM клеток как функцию GO концентрации. С Риса. 5d находим, что когда GO концентрация 20 мкг/мл, отношение F/F₀ (где F₀ и F — флуоресцентные интенсивности FAM при 518 нм в отсутствии и присутствии CCRF-CEM соответственно) получает наивысшее значение, 13,0354. Поэтому 20 мкг/мл считалось оптимальной GO концентрацией.

CCRF-CEM детекция с GO-apt флуоресцентным аptaсенсором

Для получения хороших экспериментальных результатов оптимальные экспериментальные условия использовали для детекции CCRF-CEM. Рисунок 6a показывает, что с увеличением числа CCRF-CEM от 0 до 1 × 10⁷ флуоресцентная интенсивность также соответствующе увеличивается. Более того, F/F₀ показывает четкую линейную зависимость от числа CCRF-CEM в диапазоне 1 × 10²–1 × 10⁷ (Рис. 6b). Линейная регрессия уравнение Y(F/F₀) = 3,2608 × log C − 5,1892 (где C — число CCRF-CEM) с регрессионным коэффициентом R² = 0,9922. Предел детекции считается менее десяти клеток. Следовательно, GO-базированное флуоресцентное аptaмер сенсирование имеет широкий детекционный диапазон, так что может использоваться как идеальный биосенсор для детекции CCRF-CEM. По сравнению с другими методами, этот метод имеет высокую чувствительность (Таблица 1) [34,35,36,37,38,39].

Специфичность GO-apt флуоресцентного аptaсенсора

Для исследования специфичности GO-apt флуоресцентных адаптеров, несколько разных клеток использовали для тестирования системы, такие как Ramos клетки, H22 клетки и 293T клетки. Каждая из 100-мкл реакционных систем включала 1 × 10⁶ клеток. Рисунок 7 показывает, что CCRF-CEM получает более высокую флуоресцентную интенсивность чем другие контрольные группы. Результаты также четко указывали, что спроектированный флуоресцентный аptaсенсор обладает высокой специфичностью.

Заключение

Разработан удобный, дешевый и высокочувствительный флуоресцентный аptaсенсор для детекции CCRF-CEM клеток. Эта стратегия умело использует нековалентное взаимодействие π-π стакинга между графеном и однокатечальной ДНК и превосходную производительность графена-гашения флуоресценции. По сравнению с аptaмером, связывание CEM-аptaмер комплекса с GO слабое, так что флуоресценция, погашенная графеном, может постепенно восстанавливаться. Под оптимизированными условиями предел детекции считается менее 100 клеток. Следовательно, основан на своей отличной производительности, флуоресцентный аptaсенсор имеет широкие перспективы в детекции опухолевых клеток.

История изменений

Аббревиатуры

AFM:

Атомно-силовая микроскопия

CEM-apt:

CCRF-CEM-аptaмер комплекс

FAM-apt:

FAM-маркированный Sgc8 аptaмер

FRET:

Флуоресценционный резонансный энергетический перенос

GO:

Оксид графена

GO-apt:

Оксид графена-аptaмер комплекс

PBS:

Фосфатно-буферный салин