Электропряженные хитозан-полиэтиленоксид/фибриногенные скаффолды для устойчивой доставки PDGF и усиленного заживления ран

Аннотация

Заживление ран — многогранный процесс, управляемый факторами роста, клеточной миграцией и ремоделированием внеклеточной матрицы. Хотя биоактивные перевязки продвинулись, лишь немного достигают клинической практики из-за проблем доставки. Спроектирован нановолокнистый скаффолд из хиitozана (CS), полиэтиленоксида (PEO) и фибриногена (Fb) с использованием двухструйной электроспиннинг платформы. Полученный CS-PEO/Fb композит демонстрировал нанометрические волокна, равномерное распределение полимеров и благоприятную механическую целостность. Включение тромбоцитарного фактора роста (PDGF) достигнуто без потери биоактивности, исследования релиза выявили бифазный профиль, доставляющий 21,6% PDGF в первый час с последующим устойчивым высвобождением за 48 ч. In vitro тесты миграции фибробластов подтвердили, что PDGF, высвобождаемый из скаффолда, равен по эффективности единичной дозе 50 нг/мл, в то время как Fb компонент один лишь умеренно стимулировал миграцию. Скорость паропроницаемости композита (≈807 г·м⁻²·день⁻¹) и прочность на разрыв (≈0,3 МПа) соответствуют клиническим стандартам раневых перевязок. Вместе эти данные демонстрируют, что CS-PEO/Fb электроспиннинг скаффолды обеспечивают надежную, биоактивную платформу для устойчивой доставки факторов роста и ускоренного заживления ран.

Введение

Несмотря на прогресс в уходе за ранами, трансляция биоактивных перевязок в клинику остается ограниченной. Каскад заживления опирается на скоординированное взаимодействие цитокинов, иммунных клеток и матриксных белков. Факторы рота, будучи мощными, страдают от быстрого клиренса и короткого полужизненного периода, требуя повторного дозирования, обременительного для пациентов. Перевязка, способная к устойчивой, локализованной доставке, драматически улучшила бы исходы и внедрение.

PDGF — ключевой хемотактический агент, мобилизующий нейтрофилы, моноциты и фибробласты, и модулирующий матриксное депонирование и рубцовое формирование. FDA-одобренный Regranex® гель (2,2 мкг/см²) ускоряет заживление ~30% при диабетических язвах, но его ежедневное применение неудобно. Таким образом, устойчивая-релиз система желательна.

Электроспиннинг предлагает универсальный маршрут производства нановолокнистых ковров, эмулирующих родную внеклеточную матрицу. Природные полимеры как коллаген, эластин и фибриноген обладают врожденной биоактивностью и аффинностью к факторам роста. Однако фибриноген один лишь лишен механической прочности, необходимой для долгосрочных перевязочных применений. Хитозан, деацетилированный хитиновый производный, обеспечивает антимикробную активность и может электроспинниться при смешивании с PEO. Поликатионная природа CS усложняет смешивание с негативно заряженным Fb, но двухсопловая электроспиннинг машина преодолевает электростатические несовместимости, позволяя равномерное композитное формирование.

Методы

Материалы

Все реактивы (уксусная кислота, CS, PEO, Fb, HFIP, BSA, DMSO) и клеточные линии (человеческие дермальные фибробласты PCS-201-012) приобрели у Sigma-Aldrich или ATCC и использовали как полученные. Рекомбинантный человеческий PDGF-BB получен из PeproTech.

Фабрикация скаффолда

CS-PEO растворы (5,5 вес.%, CS:PEO = 2:1) готовили в 1% уксусной кислоте с 0,5% BSA и 10% DMSO. Fb растворяли в 1:9 (об./об.) HFIP/10× EMEM смеси при 110 мг/мл. PDGF добавляли непосредственно перед спиннингом. Двухструйный электроспиннинг (NE-1000 шприц-насос, 18-гаугольные иглы) использовал 0,7 мл/ч (CS-PEO) и 1,0 мл/ч (Fb) потоки, напряжения 28 кВ и 22 кВ, и 25 об/мин вращающийся ман드рин на 22 см (CS-PEO) и 12,5 см (Fb). Сканирование проводили 3 ч при 35–45% влажности.

Морфология

FESEM визуализация (Zeiss Sigma VP-40) золотистых образцов квантифицировала диаметры волокон (n = 100 на скаффолд) через ImageJ. CS-PEO/Fb волокна в среднем 202 ± 113 нм, тоньше CS-PEO (270 ± 68 нм) и Fb (351 ± 102 нм) в одиночку.

Поверхностная химия

ToF-SIMS (Bi₃²⁺, 30 кВ) маппировали характерные ионы (CNO⁻, CN⁻, C₂H₅O⁺) по 50 × 50 мкм растрам, подтверждая равномерное CS-PEO и Fb распределение.

Угол смачивания водой

Измеряли по ASTM D7334-08 с 2 мкл дистиллированной воды. CS-PEO/Fb показал гидрофильный угол 61,4 ± 7,6°, промежуточный между CS-PEO (44,2 ± 5,1°) и Fb (115,7 ± 16,2°).

Механическое тестирование

Униаксиальные растягивающие тесты (Instron E3000, 1 мм/мин) на 40 × 25 мм полосках (толщина 94 ± 7 мкм) дали нагрузка-деформация кривые. CS-PEO/Fb достиг 0,31 ± 0,02 МПа пикового напряжения, превосходя Fb один (0,12 ± 0,01 МПа).

Скорость паропроницаемости

WVTR определяли по ASTM E96 с силикагель десикантами; CS-PEO/Fb давал 806,5 ± 56,1 г·м⁻²·день⁻¹, в клинически желаемом диапазоне (≈2000 г·м⁻²·день⁻¹).

Цитотоксичность

Косвенные WST-1 тесты (ISO 10993-5) за 120 ч не показывали значимого ингибирования пролиферации при 48 ч, хотя умеренное снижение появилось при 72 ч, вероятно из-за степени ацетилирования CS.

Клеточное адгезирование

Live/Dead и фаллоидин-DAPI окраска фибробластов на поверхностях скаффолда выявили здоровую морфологию и надежное адгезирование, сравнимое с фибронектин-покрытыми контролями.

Деградация

Скаффолды, инкубированные в FBM (37 °C, 5% CO₂), показывали линейную потерю массы после начального 1-ч прорыва, сохраняя целостность ≥48 ч.

PDGF релиз

ELISA квантифицировал кумулятивный релиз: 1,8 ± 0,7, 4,4 ± 1,8 и 11,4 ± 4,8 нг/мг при 2, 4 и 8 мкг/мл загрузке соответственно. Бифазный паттерн высвободил 21,6% в первый час.

Миграция фибробластов

ORIS™ миграционные тесты продемонстрировали, что элютсы от PDGF-загруженных скаффолдов соответствуют миграции, индуцируемой единичной 50 нг/мл PDGF дозой, с устойчивым эффектом до 48 ч. Fb один также умеренно стимулировал миграцию.

Результаты и обсуждение

Двухструйный электроспиннинг успешно объединил CS-PEO и Fb в однородную нановолокнистую матрицу, преодолев электростатические несовместимости. Уменьшение диаметра волокон в композите атрибутируется увеличенной струйной репульсии, удлиняющей время депониции и индуцирующей изгибные нестабильности, дающие более тонкие волокна.

ToF-SIMS маппирование подтвердило равномерный поверхностный состав, а углы смачивания водой указали на гидрофильную поверхность, препятствующую бактериальному адгезированию при поддержке белкового адсорбции. Механическое тестирование показало, что CS-PEO интеграция восстанавливает растягивающую прочность, пригодную для раневых перевязок, устраняя неврожденную слабость Fb.

WVTR измерения поместили CS-PEO/Fb в терапевтическое окно для влажных раневых сред, балансируя экссудат менеджмент и кислородную проницаемость. Цитотоксичность тесты предложили, что любые остаточные HFIP или высокие DA CS концентрации были минимальны; биологический профиль безопасности скаффолда приемлем для клинической трансляции.

PDGF релиз профили продемонстрировали желаемый бифазный паттерн: ранний прорыв, доставляющий ~21% дозы, за которым следовало контролируемое, линейное высвобождение, поддерживающее биологически релевантные концентрации за 48 ч. Эта устойчивая доставка отрицает необходимость ежедневных смен перевязок, требуемых Regranex®, потенциально улучшая комплаенс пациентов.

Функциональные тесты подтвердили, что высвобожденный PDGF сохранил хемотактическую активность, достигая фибробластовой миграции, эквивалентной единичному высокодозному лечению. Аддитивный эффект врожденных хемотактических свойств Fb дополнительно усиливает клеточный рекрутинг, предполагая синергетический механизм.

Заключение

Электропряженные CS-PEO/Fb нановолокнистые скаффолды сочетают антимикробные и механические преимущества хиitozана с биоактивностью фибриногена, обеспечивая устойчивую, функциональную PDGF доставку. Их наноархитектура, подходящий WVTR и механическая надежность делают их перспективными кандидатами для перевязок следующего поколения, способных ускорять фибробластовый рекрутинг и заживление без неудобства повторных фактор-роста применений.