Продвинутое обнаружение miRNA-335-5p с помощью межпальцевых электродов для оценки тяжести аневризмы брюшной аорты

Аннотация

Аневризма брюшной аорты (АБА) относится к расширению нижней артерии брюшной аорты, и в раннем обнаружении инструмента остро нуждаются для диагностики. В настоящем исследовании сенсорная поверхность межпальцевого электрода (IDE) использовалась для идентификации miRNA-335-5p, который отражает формирование АБА. Равномерность силицеового материала наблюдалась 3D профилометрией, а химически модифицированная высокопроводящая поверхность улучшила обнаружение в режиме I-V. Целевой miRNA-335-5p детектировался доза-зависимым образом, и на основе линейной регрессии и 3σ анализов чувствительность определялась как 1 фМ с биотинилированным зондом. Высокая специфичность демонстрировалась дискриминацией целевой последовательности от некомплементарных и одиночных/тройных несовпадающих последовательностей. Эти результаты продемонстрировали высокопроизводительное обнаружение miRNA-335-5p с хорошей воспроизводимостью для определения тяжести АБА.

Введение

Аневризмы брюшной аорты (АБА) — это опасные для жизни заболевания, определяемые как брюшная аорта с диаметром > 3 см или больше нормального. Это состояние возникает при атеросклерозе или накоплении бляшек, которые ослабляют стенки брюшной аорты и вызывают наружное выпячивание, похожее на шарик. Со временем стенка артерии расширяется, и эта ситуация сравнима со старением садовых шлангов. Давление от качающейся через аорту крови вызывает выпячивание этого ослабленного участка наружу, что называется аневризмой. АБА образуется, когда ослабленный участок аорты приводит к осложнениям. АБА может привести к смерти из-за разрыва даже при малых аневризмах. В настоящее время физические осмотры, компьютерная томография аорты, МРТ и ультразвуковая сонорграфия используются для диагностики этого состояния. Однако нет методов обнаружения АБА, которая обычно выявляется при анализе других проблем со здоровьем. Это приводит к задержанной идентификации АБА, в конечном счете вызывая ненужные проблемы со здоровьем. Для преодоления этой проблемы исследователям необходимо разработать методы раннего обнаружения, и одна из потенциальных стратегий — разработка сенсорной системы.

Раннее, быстрое и чувствительное обнаружение заболеваний количественным образом является жизненно важной целью для клинической диагностики. Настоящие биосенсорные платформы удовлетворяют нескольким требованиям и требуют надлежащих лабораторных условий и обучения. Таким образом, большинство методов не являются портативными, что требуется для идеального точечного ухода. Кроме того, для помощи врачам в принятии решений точным и быстрым образом, анализ изменений уровней биомаркеров крайне желателен. Циркулирующие биомаркеры, экспрессирующиеся в специфических областях, должны быть дополнительно исследованы для диагностики АБА и отслеживания прогресса лечения. Идентификация таких циркулирующих биомаркеров поможет диагностировать заболевание и проводить наблюдение за пациентом после лечения. Для удовлетворения этих потребностей это исследование предлагает генерировать сенсоры соответствующих биомаркеров для АБА. Сенсор (межпальцевый электрод), предложенный в этом исследовании, имеет потенциал для высокопроизводительного анализа с широким спектром биомаркеров. Это диэлектродная система с чередующимися зазорами и пальцами, работающая под диэлектрическими измерениями.

Биомаркеры могут быть любыми биомолекулами, включая ДНК, РНК, белки, углеводы, липиды и их модифицированные формы. Кроме того, исследователи предложили, что разные биомаркеры, такие как некодирующие РНК, экспрессируются в клеточной системе, но не переводятся в белки. Некодирующие РНК обычно не переводятся в белки и обычно имеют короткие последовательности. Разные классы некодирующих РНК, такие как микроРНК (miRNA), рибосомные РНК, транспортные РНК, малые нуклеолярные РНК, малые ядерные РНК, теломеразные РНК, snRNA, Xist RNA, vault RNA и 7SL RNA, были описаны. miRNA функционируют в основном в транскрипционной и посттранскрипционной регуляции экспрессии генов и часто приводят к глушению генов. Недавно исследователи описали важность miRNA для предсказания АБА и сообщили о снижении экспрессии miRNA-335-5p у пациентов с АБА. Доказано, что сочетание клинических факторов и экспрессии микроРНК резко улучшило предсказание заболеваний и показало повышенную точность. Исследователи специально фокусировались на miRNA-335-5p, который демонстрировал значительно минимальный диапазон у лиц с быстрорастущей АБА. Снижение уровня miRNA-335-5p повышало уверенность в обнаружении растущей АБА. Другими словами, отрицательный результат (более высокие уровни) miR-335-5p указывает на тяжесть АБА и минимизирует трудоемкий скрининг. Это было продемонстрировано Wanhainen et al. и показало, что miRNA полезны как биомаркеры для скрининга АБА и устранения риска быстрорастущей АБА. Текущее исследование демонстрирует применение обнаружения miRNA-335-5p сенсором межпальцевого электрода (IDE) для определения тяжести АБА у пострадавших лиц.

Материалы и методы

Реактивы и биомолекулы

Стрептавидин, 1,1'-карбонилдиимидазол (CDI) и фосфатный буферный раствор (PBS) приобретены у Sigma-Aldrich, США. Этаноламин куплен у Fisher Scientific, Великобритания. Все олигонуклеотиды синтезированы коммерчески у Apical Scientific Sdn. Bhd., Малайзия.

Проектирование узора на хромовой маске

Изначально узор диэлектрического сенсора проектировался с помощью программного обеспечения AutoCAD. Желаемые размеры: длина 7500 мкм, ширина 4100 мкм, 20 пар палец-зазор, размер зазора 85 мкм, размер электрода 100 мкм, толщина электрода 40 нм, длина пальца 4000 мкм. Узор печатался на чистом фотомаске и наклеивался на поверхность хромового стекла. Это хромовое стекло фиксировалось под системой УФ-экспозиции для процедуры переноса узора. Кремниевый диоксидный субстрат, осажденный тонким алюминиевым слоем, помещался в противоположном направлении против хромового стекла и экспонировался УФ-светом 10 с. Узор переносился с последующим процессом проявки с использованием проявителя резиста.

Фабрикация межпальцевого электрода

Поверхностный электрод производился конвенциональным микроэлектронным процессом фабрикации поверхности следующим образом: (i) Подготавливали 4-дюймовый пластин с существующим нативным оксидом. (ii) Пластин очищали буферным оксидным эchantом (BOE) и пираньевым раствором для удаления нативного оксида и неорганических загрязнений. (iii) Оксидный слой толщиной 2800 Å выращивали за час влажной термической оксидации при 1000 °C. (iv) Пластин с оксидным слоем делили на четыре для лучшей обработки. (v) Металлический слой осаждали с л как адгезионным слоем для проводимого слоя. Алюминиевый слой (40 нм) производили длиной 3 см с диаметром 0,5 мм термическим испарением физического осаждения, (vi) Слой положительного фоторезиста наносили спин-коутингом на субстрат, (vii) Пластин мягко выпекали при 90 °C 60 с. (viii) Пластин выравнивали с хромовой маской и экспонировали УФ-светом 10 с. (ix) Пластин промывали в растворителе RD6 в течение 15 с для удаления неэкспонированной области, в результате чего получался узор межпальцевого электрода (IDE) с оксидом. (x) Пластин твердо выпекали при 90 °C 120 с. (xi) Пластин эчтили акварегией для удаления экспонированных областей обоих слоев. (xii) Поверхностный узор производился, и оставшийся фоторезист смывали ацетоном. Затем 3D нанопрофилометрия (Hawk 3D-profilometry, США) анализировалась для наблюдения четкого изображения зазоров между электродами. Измерения тока (А) выполнялись на Keithley 6487 с линейным сканированием 0–2 В с шагом 0,1 В (при 20 с).

Химическая функционализация поверхности: тетравалентная стратегия стрептавидин-биотин

Для химической функционализации поверхности силицевая поверхность сначала тщательно мыли 1 M гидроксидом калия (pH 9,0) для активации поверхности. Эта поверхность дополнительно модифицировали CDI (0,5 M) с инкубационным периодом 1 ч для реакции с 100 нМ стрептавидина (в течение 1 ч), разбавленного из оригинального стока в 10 мМ фосфатно-буферном салине (PBS; pH 7,4). После этого этапа нереагировавшие участки блокировали 1 M этаноламином (в течение 1 ч). Затем тетравалентный стрептавидин реагировал с 1 мкМ биотинилированного зонда miRNA-335-5p (в течение 10 мин) при комнатной температуре. После завершения каждой модификации поверхность тщательно промывали PBS, если не указано иное.

Проектирование зонда и целевых последовательностей из miRNA-335-5p

Полноразмерный miRNA-335-5p (5′-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3′) с кодом доступа MIMAT0000765 собран из банка данных. Желаемая область для этого исследования как цель: 5′-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3′. Для захвата целевой области miRNA-335-5p зонд спроектирован как 5′-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUG-3′. На 3′-конце биотин был отмечен для взаимодействия с иммобилизованным на сенсорной поверхности стрептавидином. Вторичная структура полноразмерного miRNA-335-5p предсказывалась онлайн-программой mfold (https://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold).

Взаимодействия зонд-мишень: последовательности miRNA-335-5p

При связывании биотинилированного зонда со стрептавидиновой поверхностью, как описано выше, целевая последовательность miRNA-335-5p взаимодействовала (в течение 10 мин) при комнатной температуре от низкофемтомолярных до низконаномолярных концентраций. Эти концентрации варьировали от 1 фМ до 1 нМ с 10-кратными последовательными разбавлениями в PBS. Прикрепления тестировались независимо от низких к высоким концентрациям, и при формировании дуплекса поверхность промывали 5-кратными объемами PBS, и измерения проводились.

I-V измерения

Электрические характеристики выполнялись I-V измерениями с пикоамперметром Keithley 6487 с источником напряжения/тока. Измерения записывались на упомянутых вольтах на голой поверхности, затем на каждой поверхностной химической модификации. Аналогично, для интерактивного анализа между зондом и целевым miRNA-335-5p при каждой концентрации измерение выполнялось после этапа промывки 10 реакционными объемами. Все модификации, взаимодействия и измерения поддерживались во влажных условиях, если не указано иное.

Результаты и обсуждение

Фабрикация IDE сенсора и анализ поверхности

Текущее исследование использовало miRNA-335-5p как инструмент для выяснения тяжести АБА интерактивным анализом на сенсоре межпальцевого электрода (IDE) (рис. 1). Для интерактивного анализа с зондом и мишенью, спроектированными из полной длины miRNA-335-5p, поверхность IDE проектировалась и изготавливалась с использованием конвенциональных фотолитографических техник. Пошаговые поверхностные модификации проводились и измерялись амперметром (рис. 2b, c). Выравнивание маски, спроектированное для фабрикации IDE и равномерность, подтверждались высокоразрешающим 3D нанопрофилометрическим анализом. Это наблюдение подтвердило, что фабрикация и расстояние между каждым пальцем были хорошо выровнены (рис. 2d). IDE имеют размер электрода ~100 мкм с интервалом ~85 мкм, и большая интеркалированная сеть с миллионами биомаркеров в последовательном/параллельном соединении формируется. Для обеспечения успешности изготовленных IDE мы использовали разные голые устройства для определения воспроизводимости под диэлектрической системой. Эта система измеряет молекулярные вибрации между диэлектродами, вызванные дипольным моментом (рис. 2c). Эта диэлектрическая IDE — хорошо признанная система, широко использовавшаяся для различных биомолекулярных и химических анализов. В этом исследовании все поверхностные химические модификации и интерактивные анализы измерялись режимом I-V тока.

Высокоплотная поверхностная молекулярная сборка: стратегия стрептавидин-биотин

Высокоплотные молекулярные прикрепления на сенсорной поверхности или биочипах показано, что являются критическими и сильно зависят от поверхностной функционализации. Это исследование направлено на определение подходящей поверхности для большого количества молекулярных размещений, что обязательно для экспрессии генов, открытий и молекулярного анализа. Для этих потенциальных приложений генерация аналитических системных поверхностей требует правильного сцепления молекул для их иммобилизации в соответствующих форматах. Эти материальные поверхности изучались для исследования поверхностного интерактивного механизма, так как они дешевы и обеспечивают различные степени плотности упаковки, морфологии и толщины. Это открытие облегчит правильное прикрепление молекул и предотвратит потерю биомолекулярной активности. Более того, правильная ориентация иммобилизации биомолекул сохраняется с правильным подтверждением вторичной структуры.

Для достижения высокой плотности молекул на поверхности мы сначала тщательно промыли силицевую поверхность щелочным раствором и модифицировали её CDI. Для захвата высокого уровня биотинилированных зондов на CDI поверхности мы иммобилизовали зонд со стрептавидином. Стрептавидин — тетравалентный белок с четырьмя сайтами для связывания биотина и считается молекулой с высокой аффинностью в биологических науках. Поверхность IDE имела уровень тока 2,08E-10 А, и после прикрепления CDI он увеличился до 9,2E-06 А. Это находка четко указывает на то, что поверхность IDE, модифицированная CDI, подходит для наших анализов. Когда добавляли стрептавидин, уровень тока еще больше увеличивался до 2,36E-05 А. Используя эту стратегию, мы иммобилизовали большее количество биотинилированных зондов, спроектированных из полноразмерного miRNA-335-5p, на поверхности IDE (рис. 3a). Взаимодействия биотина проводились после этапа блокировки на поверхности IDE для маскировки нереагировавших участков. При каждой поверхностной модификации определяли изменения в токе (рис. 3b). Как показано на рис. 3c, после добавления этаноламина изменения тока составляли 2,53E-05 А, а когда добавляли 1 нМ биотинилированной целевой последовательности, уровень тока снижался до 1,29E-08 А. Это изменение тока подтвердило иммобилизацию зонда-захвата на сенсорной поверхности IDE. Обычно одноколоночный олигонуклеотид несет более отрицательный заряд с экспонированным 5-углеродным фосфатным основанием (зонд), тогда как чистый заряд этаноламина нейтрален, как указано поставщиком. Эта большая разница в заряде привела к явной вариации измеренного тока, как показано на рис. 3c. Далее, этот параметр снова восстанавливался при формировании дуплекса с целевой цепью. Это обусловлено уменьшением экспозиции фосфатного основания и дополнительными положительными зарядами, исходящими от нуклеиновых оснований в цепи miRNA (рис. 4a).

Доза-зависимый интерактивный анализ на IDE

При прикреплении биотинилированного зонда на сенсорной поверхности целевой интерактивный анализ проводился с разными дозами. Эта валидация выполнялась от низкофемтомолярного до низконаномолярного диапазона. Для обеспечения этого диапазона мы провели предварительный анализ с 1 нМ целевых последовательностей miRNA-335-5p. После добавления 1 нМ целевой последовательности miRNA-335-5p на поверхность, модифицированную зондом-захватом, уровень тока изменился с 1,29E-08 А до 1,29E-07 А (рис. 4a); этот результат указывал на гибридизацию между зондом-захватом и целевой последовательностью. После этого подтверждения, для определения предела обнаружения, мы титрировали целевую последовательность от 1 фМ до 1 нМ, которые независимо капали на поверхности, модифицированной зондом-захватом. Изменения тока детектировались до и после иммобилизации. Различия в токе для гибридизации 1 фМ, 10 фМ, 100 фМ, 1 пМ, 10 пМ, 100 пМ и 1 нМ составляли 2,87, 3,87, 5,04, 6,88, 8,59, 11,21 и 11,61E-08 А соответственно. На основе полученных результатов четкие доза-зависимые изменения тока были детектированы во всех тестированных концентрациях целевой последовательности (рис. 4b).

Высокая аналитическая производительность: чувствительность, специфичность и воспроизводимость

На основе вышеуказанных результатов с концентрационно-зависимыми приращениями выполняли линейный регрессионный анализ. Чувствительность обнаружения оценивалась расчетом 3σ и составляла 1 фМ (рис. 5a, b). Концентрация ниже 1 фМ показывала фоновый сигнал и более низкие значения. Далее, анализ специфичности проводили для дискриминации целевых последовательностей от некомплементарных и одиночных/тройных несовпадающих последовательностей. Видно, что спроектированный зонд показывал более сильную реакцию с идеальными комплементарными последовательностями miRNA-335-5p, чем с другими последовательностями (рис. 6a). Одиночная несовпадающая последовательность давала более высокий токовый ответ, чем некомплементарная и тройная несовпадающая последовательности, из-за частичного формирования дуплекса одиночной несовпадающей последовательностью на зондовой последовательности. Анализы воспроизводимости проводили со всеми химическими и биологическими модификациями на поверхности IDE в триplicates, и данные усреднялись. Усредненные данные указывали на отсутствие значительных изменений при выполнении разных экспериментов (рис. 6b). Кроме того, для поддержки производительности IDE сравнивали характеристики существующих методов (Таблица 1).