Ультрачувствительный электрохимический ДНК-биосенсор на акрилово-золотом нанокомпозите для быстрого определения пола арованы

Аннотация

Представлен ультрачувствительный электрохимический ДНК-биосенсор для определения пола азиатской арованы (Scleropages formosus) с пределом детекции атто-молярного уровня. Сенсор использует акриловые микросферы, функционализированные сукцинимидными группами, и коллоидные золотистые наночастицы (AcMP-AuNP), иммобилизованные на углеродном экранно-печатном электроде. Аминированная ДНК-зонда ковалентно крепится к AcMP, а гибридизация целевой ДНК арованы количественно определяют дифференциальным пульсовым вольтамперометрием (DPV) с антрахинонсульфокислотой как редокс-маркером. При оптимизированных условиях сенсор достигает предела детекции 1,0×10⁻¹⁸ М и линейного диапазона 1,0×10⁻¹⁸ – 1,0×10⁻⁸ М (R² = 0,99) за один час, что делает его легким, экономичным инструментом для on-site диагностики в рыбоводстве.

Введение

Азиатская арована (Scleropages formosus) — пресноводный вид, ценный для декоративных целей и культурного значения в Юго-Восточной Азии и Океании. Из-за высокого спроса дикие популяции сильно истощены, вид внесен в CITES и Красную книгу МСОП как исчезающий. Точное определение пола на ювенильном этапе критично для разведенических программ и рыночного регулирования, однако традиционные визуальные методы ненадежны и трудоемки, а стандартный ПЦР требует сложной лабораторной инфраструктуры.

Недавние достижения в наноматериалах для биосенсоров предлагают перспективную альтернативу. Интеграция акриловой полимерных микросфер с золотистыми наночастицами создает высокоповерхностную, проводящую платформу, усиливающую загрузку зондов и электронный перенос, что повышает чувствительность и сокращает время анализа.

Методы

Аппарат и электроды

DPV измерения проводили на Autolab PGSTAT 12 с углеродным экранно-печатным электродом (SPE), модифицированным AcMP и AuNP. Использовали платиновый вспомогательный электрод и Ag/AgCl опорный электрод (3,0 М KCl). Растворы ультразвуковы обрабатывали в ванне Elma S30G для однородности.

Реактивы

Ключевые реагенты: 2,2-диметокси-2-фенилацетофенон (DMPP), 1,6-гександиолдиакрилат (HDDA), n-бутилакрилат (nBA), хлорид золота (III) тригидрат, NAS. Коллоидные золотистые наночастицы синтезировали по Grabar et al. (1995). ДНК-зонды готовили в 0,05 М K-фосфатном буфере (pH 7,0), гибридизацию — в 0,05 М Na-фосфатном буфере (pH 7,0) с 1,0 мМ AQMS и 2,0 М NaCl.

Синтез акриловых микросфер

AcMP получали односторонней UV-инициированной фотополимеризацией смеси HDDA, nBA, DMPP и NAS в водной эмульсии. После 10 мин ультразвука и 600 с UV-отверждения под N₂, микросферы центрифугировали, трижды промывали K-фосфатным буфером и сушили на воздухе.

Фабрикация ДНК-биосенсора на акриловых микросферах

Поверхность SPE каплевали 3 мг/мл дисперсией AcMP, затем 5 мг/мл коллоидными AuNP. Модифицированный электрод инкубировали в 5 мкМ растворе аминированной зонда ДНК арованы 6 ч, затем тщательно промывали. Гибридизация с целевой cDNA (5 мкМ) в присутствии 1 мМ AQMS и 2 М NaCl шла 1 ч перед DPV-анализом в 0,05 М K-фосфатном буфере при комнатной температуре.

Оптимизация электрохимического ДНК-биосенсора

Иммобилизацию зонда оптимизировали варьируя время инкубации (1–18 ч) и гибридизации (10–100 мин). Систематически изучали температуру, pH, ионную силу и валентность катионов для максимизации DPV-отклика. Оптимальные условия: 6 ч инкубации зонда, 30 мин гибридизации при 25 °C, pH 7,0, 0,05 М Na-фосфатный буфер, 2 М NaCl, 1 мМ AQMS.

Извлечение ДНК и анализ ДНК арованы

15 тканевых образцов арованы извлекали набором QIAquick PCR Purification. Геномную ДНК амплифицировали ПЦР и проверяли на 1,5% агарозных гелях. Те же экстракты тестировали биосенсором: DPV-токи выше базовой линии указывали на мужскую ДНК, токи на базовой линии — на женскую. Статистическую значимость оценивали t-тестом (95% доверие).

Результаты и обсуждение

SEM подтвердил равномерные сферические AcMP (рис. 2) с узким распределением размеров (рис. 3). Электрохимическая характеристика модифицированного SPE показала диффузионно-контролируемый обратимый редокс-процесс с линейной зависимостью пикового тока от квадратного корня скорости сканирования (R² = 0,996; рис. 4). DPV-ответ (рис. 6) продемонстрировал выраженный рост тока только после гибридизации с комплементарной ДНК, подтверждая специфичность зонда.

Оптимизация показала, что иммобилизация зонда насыщается через 6 ч, а гибридизация достигает равновесия за 30 мин при комнатной температуре (рис. 7). Температура выше 25 °C ускоряла гибридизацию, но рисковала денатурацией, поэтому 25 °C выбрали как оптимальную. pH-зависимость дала максимальный DPV-сигнал при нейтральном pH 7,0; более низкий или высокий pH снижал эффективность гибридизации (рис. 9). Среди катионов Na⁺ давал лучшее усиление, вероятно, из-за минимального осаждения и благоприятного электростатического экранирования (рис. 10). Анализ ионной силы выявил 2 М NaCl и 0,05 М Na-фосфатный буфер как оптимальный гибридизационный буфер (рис. 11).

Калибровочная кривая (рис. 12) показала линейный отклик от 1,0×10⁻¹⁸ М до 1,0×10⁻⁸ М (R² = 0,99) и репрезентативный DPV-спектр.

Определение пола арованы с ДНК-биосенсором

При применении к полевым образцам назначение пола биосенсором совпало с результатами ПЦР (табл. 2), подтверждая надежность для быстрого on-site использования.

Заключение

Разработанный электрохимический ДНК-биосенсор обеспечивает исключительную чувствительность, широкий динамический диапазон и низкий предел детекции для ДНК арованы. Его способность к быстрому обнаружению на атто-молярном уровне в сочетании с легким, одноразовым форматом делает его идеальным для интеграции в point-of-use устройства, поддерживающие рыбоводство ранним определением пола и окраса.