Новая аналитическая система для оценки физико-химических свойств наночастиц серебра в человеческой коже

Аннотация

Для обеспечения безопасного использования наночастиц серебра (nAg) в косметике необходимо раскрыть их физические свойства внутри кожи, так как эти свойства могут меняться в процессе perkutанного поглощения. В этом исследовании мы стремились установить аналитическую систему на основе масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой в режиме одиночных частиц (sp-ICP-MS) для определения физических свойств nAg в коже. Сначала мы оптимизировали метод предобработки для растворения кожных образцов и показали, что большинство nAg восстанавливается обработкой гидроксидом натрия, сохраняя частичную форму. Для разделения кожи на эпидермис и дермис мы отобрали несколько условий микроволнового облучения. Анализ sp-ICP-MS указал, что применение 200 Вт в течение 30 с было оптимальным, так как это условие обеспечивало полное разделение кожных слоев без изменения физических свойств большинства nAg. Наконец, мы оценили in vivo применение, анализируя количество и физические свойства Ag в эпидермисе, дермисе и периферической крови мышей после воздействия кожи nAg или Ag⁺. Последующий анализ sp-ICP-MS показал, что nAg могут поглощаться и распределяться в более глубокие слои в ионизированной форме, тогда как Ag⁺ поглощался и распределялся без изменения физических свойств. Это исследование указывает на то, что для полного понимания ответа кожи после воздействия nAg необходимо учитывать распределение и размер частиц не только nAg, но и Ag⁺, выделяющегося из nAg в кожу.

Введение

Недавние технологические достижения в нанотехнологиях ускорили разработку инженерных наночастиц (ENP) — частиц менее 100 нм. Благодаря их полезным свойствам, таким как усиленное проникновение в ткани и поверхностная реактивность, по сравнению с микро- и крупными материалами, ENP широко используются в различных продуктах, включая косметику, пищу и медицину. Например, наночастицы серебра (nAg), один из самых распространенных типов ENP, включаются в косметику из-за их антибактериальных свойств, обусловленных стабильным выделением ионов серебра (Ag⁺). Однако уникальные физико-химические свойства, связанные с малым размером частиц nAg, могут быть опасными. Известно, что эти частицы могут разрушать иначе непробиваемые барьеры, такие как гематоэнцефалический барьер, и вызывать воспаление. Кроме того, некоторые исследования сообщали, что ENP могут проникать через кожный барьер. Поэтому для определения безопасности непрерывного использования этих частиц важно понять связанные с ENP, содержащими nAg, токсические эффекты, изучая динамику этих частиц в тканях, таких как кожа.

Для обеспечения безопасности необходимо понимать возможные риски использования ENP, что включает интегративные концепции «опасности» (потенциальная токсичность) и «условий воздействия». Хотя опасности ENP анализировались во всем мире, лишь несколько исследований изучали условия, касающиеся воздействия ENP. В частности, сообщалось, что nAg и Ag⁺ могут менять свои физические свойства в организме. Например, ионизация nAg приводит к формированию nAg с меньшим размером частиц и выделению Ag⁺. Наоборот, nAg с малым размером частиц обнаруживались в кишечном эпителии крыс после перорального введения ацетата серебра. Кроме того, мы недавно сообщили, что по сравнению с более мелкими nAg и Ag⁺, более крупные nAg легче находятся в молоке лактирующих мышей, подвергшихся воздействию этих nAg. Следовательно, nAg может менять свои физические свойства в организме, что, в свою очередь, приводит к изменению кинетики. Таким образом, для понимания задействованных рисков необходимо оценивать физические свойства, такие как размер частиц, этих частиц и различать их от ионов в организме.

В этом отношении мы применили масс-спектрометрию с индуктивно связанной плазмой в режиме одиночных частиц (sp-ICP-MS), которая вводит максимум одну частицу в анализатор за время пребывания. Это эффективный метод, позволяющий определять размер частиц путем анализа интенсивности пиков и концентрацию частиц через частоту пиков. Частицы и ионы можно различать, анализируя как пиковые, так и фоновые сигналы. Мы ранее оптимизировали метод предобработки для sp-ICP-MS в биологических образцах для полуколичественного определения физических свойств ENP в различных органах, таких как печень, сердце, легки, почки и селезенка.

Кожа состоит из эпидермиса, включая роговой слой (SC), и дермиса, содержащего кровеносные сосуды, лимфатические сосуды и нервы. Поэтому попадание ENP в каждый кожный слой может индуцировать токсичность разной степени. Например, распределение наночастиц диоксида титана в кератиноцитах эпидермиса человеческой кожи может стимулировать производство реактивных форм кислорода. Более того, в лысых мышах дермальное воздействие наночастиц диоксида титана в течение 60 дней не только привело к патологическим изменениям, таким как утончение дермиса из-за локальной токсичности, но и к патологическим изменениям в печени, таким как ликвефактивный некроз из-за системной токсичности, распространившейся через кровеносные сосуды дермиса. Кроме того, биологические ответы в каждом слое могут варьироваться в зависимости от физических свойств, таких как размер частиц, и различий между частицами и ионами. Для понимания безопасности использования nAg необходимо понимать физические свойства и биодистрибуцию nAg после воздействия на кожу.

Для решения этой конкретной проблемы нужен подход, позволяющий предобрабатывать кожу и разделять ее слои без потерь при восстановлении или изменений физических свойств ENP. Однако такой оптимальный подход для кожи еще не был разработан.

В этом исследовании мы оптимизировали подход предобработки, полуколичественно определяющий физические свойства nAg, как модели ENP, в каждом слое кожи через sp-ICP-MS, и затем оценили его эффективность in vivo.

Методы

Мыши

Самки мышей Slc:ICR (8 недель) приобретены у Japan SLC (Шизуока, Япония). Мыши содержались в помещении со следующим световым циклом: свет включен в 8:00, выключен в 20:00. Корм и вода доступны в виде гранул и системы водоснабжения на верхушке клетки. Все экспериментальные протоколы выполнялись при условиях, одобренных комитетом по животным исследованиям Осакского университета, Япония.

nAg и Ag⁺

Суспензии цитрат-стабилизированных nAg диаметром 100 нм (nAg100) приобретены у nanoComposix (Сан-Диего, КА, США) в виде стоковых дисперсий (1 мг/мл). Нитрат серебра (AgNO₃) приобретен у Wako Pure Chemical Industries (Осака, Япония), также в виде стоковых дисперсий (1 мг/мл). RM8013, используемый как стандарт для расчета эффективности транспорта, приобретен у Национального института стандартов и технологий (Гайтерсбург, МД, США). Каждый тип наночастиц ультразвуково обрабатывали 10 мин перед использованием. Наночастицы и ионы также вихрево перемешивали 10 с перед использованием.

Реактивы

Гидроксид натрия (NaOH, 0,1 моль/л) приобретен у Nacalai Tesque Company (Осака, Япония) и азотная кислота (HNO₃, 70%) — у Kanto Kagaku Chemical Industries (Токио, Япония). Фосфатно-буферный раствор (PBS), pH 7, приготовлен.

Оптимизация методов предобработки

Эпидермис и дермис каждой мыши разделяли, смешивали с PBS (массово-объемное соотношение 1:10) и гомогенизировали. Гомогенат смешивали с раствором nAg100 концентрацией 100 нг/мл. Смесь затем обрабатывали одним из следующих реактивов при объемном соотношении 1:1: 0,1 моль/л NaOH, 70% HNO₃ или PBS. Образцы инкубировали 3 часа при 37 °C и подвергали sp-ICP-MS.

Разделение кожи посредством микроволнового облучения

Каждую мышь эвтаназировали изофлураном (Wako), после чего эксцидировали дорсальный кожный образец 2 см² (2 см × 1 см) с помощью хирургических ножниц и пинцетта. Особую осторожность соблюдали для предотвращения повреждения тканей при эксцизии. Микроволновую печь (RE-SW-20-H, Sharp, Япония) использовали для облучения кожи на частоте 2450 МГц. Кожные образцы помещали на тарелку в центр микроволновки. В соответствии с требованиями тестирования, кожные образцы облучали 10, 30 и 60 с при 200, 600 и 900 Вт соответственно. После облучения образцы быстро извлекали и эпидермис и дермис быстро разделяли легким скоблением хирургическими пинцеттами. Раствор nAg100 100 нг/мл использовали для анализа коэффициента восстановления и среднего диаметра nAg после облучения (200 Вт, 30 с).

Трансдермальное введение nAg100 и Ag⁺

Девятинедельные самки Slc:ICR мышей разделяли на 6 групп по 3 мыши в группе в зависимости от массы тела. Мышей анестезировали изофлураном. Волосы на спине стригли машинкой (Panasonic®, Осака, Япония) и станком для бритья (Gillette®, Германия). Затем nAg100 и Ag⁺ (20 мкг/см²) наносили прямо на площадь 2,25 см² (1,5 см × 1,5 см) дорсальной кожи и плотно накрывали непроницаемой пластиковой пленкой. На пленку клали кусочек марли того же размера. Самоклеящийся эластичный бинт использовали для накрытия марли путем обмотки вокруг кожи, и кожу оставляли накрытой на 5 дней.

Предобработка кожных образцов и крови

Через 5 дней после лечения собирали периферическую кровь из ретроорбитального венозного сплетения и дорсальную кожу для анализа. Затем эксцидировали дорсальные кожные образцы 2,25 см² (1,5 см × 1,5 см) хирургическими ножницами и пинцеттом. Особую осторожность соблюдали для предотвращения повреждения тканей при эксцизии. Роговые слои (SC) последовательно удаляли с помощью 2-см кусков клейкой ленты (Scotch®, 3M) перед разделением эпидермиса от дермиса. Куски ленты прижимали к обработанной зоне дорсальной кожи, после чего прилагали постоянное давление 10 с. Двадцать кусков ленты требовались для удаления всего SC каждой мыши. Затем дермис и эпидермис разделяли микроволновым облучением и гомогенизировали с PBS (массово-объемное соотношение 1:10). Собранная кровь, а также гомогенаты дермиса и эпидермиса обрабатывали 0,1 моль/л NaOH при объемном соотношении 1:1 и инкубировали раздельно 3 часа при 37 °C. После инкубации общая масса серебра в крови, эпидермисе и дермисе смесях анализировали индуктивно связанной плазмой масс-спектрометрией (ICP-MS). Квантификация и оценка физических свойств nAg и Ag⁺ проводили с помощью sp-ICP-MS.

Измерение общей массы серебра

Для измерения общей концентрации серебра в крови, SC, эпидермисе и дермисе образцах использовали систему Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies, Санта-Клара, КА, США). Условия анализа: RF мощность 1550 Вт; несущий газ 1,05 л/мин Ar; время пребывания 100 мс. Измерения повторяли трижды в режиме MS. Родий использовали как внутренний стандарт для Ag. Целевые элементы ICP-MS анализов — ¹⁰³Rh и ¹⁰⁷Ag. Ag и родий стандартные растворы получены от Wako.

sp-ICP-MS анализ и расчет

Для sp-ICP-MS анализа использовали Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies). Условия анализа: RF мощность 1550 Вт; несущий газ 1,05 л/мин Ar; время пребывания 10 мс; время анализа 30 с. Инструменты расчета одиночных частиц — RIKILT, опубликованный Wagenen Food Safety Research (Вагененгский университет, Вагененген, Нидерланды) — использовали для расчета размера частиц.

Статистический анализ

Все статистические анализы проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism версии 5.0 для Macintosh (GraphPad Software, Ла-Хойя, КА, США). Статистическая значимость устанавливали при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Стратегии построения метода для определения количества и физических свойств nAg в каждом кожном слое

Для определения количества и физических свойств nAg в каждом кожном слое необходимо полностью растворить кожные образцы и подготовить образцы, пригодные для sp-ICP-MS анализа. Также необходимо разделить эпидермис и дермис без потерь при восстановлении или изменений физических свойств nAg, поскольку не трансдермально поглощенные nAg иногда могут быть устранены при удалении SC методом ленточного отстрейпинга.

Что касается растворения кожных образцов, мы ранее сообщали, что предобработка NaOH — оптимальная техника для квантификации и анализа физических свойств nAg в животных тканях, таких как печень, сердце, легкие, почки и селезенка. Поэтому предобработка NaOH применялась к кожным образцам в этом исследовании.

Гидротермическая обработка, приводящая к размолчению коллагеновых волокон и усиленному ферментативному гидролизу, способствующему разделению на эпидермально-дермальном стыке (EDJ), широко используется для разделения кожи на эпидермальный и дермальный слои. Хотя эти обработки эффективно разделяют кожные слои, nAg в слоях может ионизироваться в водном растворе, меняя свои физические свойства. Сообщается, что короткий импульс микроволнового облучения позволяет разделить кожу на эпидермальный и дермальный слои через тепловое воздействие, разрушающее EDJ. Поэтому мы применили микроволновое облучение без инкубации в растворе на короткое время.

Коллективно мы предложили стратегию (иллюстрированную на рис. 1), которая была подтверждена анализом коэффициентов восстановления и изменений физических свойств nAg в каждом кожном слое.

Оптимизация методов предобработки для обнаружения nAg100 в эпидермисе и дермисе

Мы обратились к нашему предыдущему исследованию для оптимизации метода предобработки растворения кожных образцов. Ишидзака и соавт. сообщали, что среди различных растворительных реагентов, таких как NaOH и HNO₃, предобработка NaOH была оптимальной. Таким образом, мы тестировали HNO₃ и NaOH как кислотный и щелочной растворительные реагенты соответственно. Гомогенаты эпидермиса и дермиса, разделенные из кожных образцов мышей, смешивали с nAg100 для получения конечной концентрации Ag 100 нг/мл, за чем следовала обработка каждым растворительным реагентом при 37 °C. Сначала оценивали коэффициент восстановления Ag после обработки этими реагентами. Анализ ICP-MS показал, что почти 100% коэффициент восстановления достигнут только обработкой NaOH и HNO₃ (рис. 2a). Затем, для оценки изменений физических свойств из-за каждой обработки, анализировали коэффициенты восстановления каждой частицы и иона. Анализ sp-ICP-MS указал, что nAg100 почти полностью ионизировался HNO₃. Это предполагало, что HNO₃ как кислотный реагент растворял частицы и превращал их в ионы, как также сообщалось в предыдущем исследовании. Напротив, большинство nAg100, обработанных NaOH, оставались в виде частиц, а не ионов (рис. 2b). Таким образом, NaOH позволяло большинству nAg100 оставаться в частичной форме. Наконец, распределения диаметров частиц оценивали для детального анализа физических свойств. Обработка HNO₃ изменила средний диаметр частиц с 100 нм на 40 нм, что соответствовало ионизации nAg100. Наоборот, средний диаметр частиц после обработки NaOH составлял примерно 100 нм, соответствующий начальному размеру частиц (рис. 2c). Это предполагало, что предобработка NaOH была оптимальной для обнаружения nAg100 в мышьей коже.

Разделение кожных образцов на эпидермис и дермис посредством микроволнового облучения и оценка коэффициентов восстановления и изменений физических свойств nAg

Для разделения кожных образцов на эпидермальный и дермальный слои мы применили разные условия микроволнового облучения, релевантные нашему исследованию и ранее сообщенные как успешные, и сравнили их производительность по разделимости кожи и изменениям физических свойств. Наблюдалось, что при условиях 200 Вт 10 с, 600 Вт 30 с, 600 Вт 60 с, 950 Вт 30 с и 950 Вт 60 с кожа не разделялась на эпидермальный и дермальный слои (рис. 3a). Более того, кожа лишь частично разделялась на эпидермальный и дермальный слои при условиях 200 Вт 60 с, 600 Вт 10 с и 950 Вт 10 с. Напротив, кожа полностью разделялась на эпидермальный и дермальный слои только после облучения 200 Вт 30 с. Эти результаты указывают на то, что облучение 200 Вт 30 с оптимально для разделения кожных слоев.

Для проверки того, влияет ли это микроволновое облучение 200 Вт 30 с на физические свойства nAg100, мы определили физические свойства Ag в эпидермальном и дермальном слоях. Гомогенаты эпидермиса и дермиса, каждый смешанный с 100 нг/мл nAg100 соответственно, лизировали обработкой NaOH и облучали 200 Вт 30 с. Анализ sp-ICP-MS раскрыл, что большинство nAg100, обработанных микроволновым облучением, оставались в виде частиц, как и в необработанной группе (рис. 3b). Для детального анализа физических свойств также оценивали распределения диаметров частиц. Средний диаметр частиц был почти 100 нм, соответствующий начальному размеру (рис. 3c). Эти выводы указывают на то, что микроволновое облучение кожных образцов 200 Вт 30 с является перспективным подходом для эффективного разделения кожи на эпидермальный и дермальный слои без изменения физических свойств nAg100.

Коллективно эти результаты указывают на то, что мы успешно разработали систему для полуколичественного определения физических свойств nAg100 в каждом кожном слое. Конкретно, метод включает: (i) удаление не трансдермально поглощенных nAg100 удалением SC методом ленточного отстрейпинга; (ii) разделение кожи на эпидермальный и дермальный слои посредством микроволнового облучения; (iii) растворение эпидермиса и дермиса обработкой NaOH; и (iv) полуколичественное определение физических свойств Ag в каждом кожном слое с помощью sp-ICP-MS.

Практическая оценка путем определения количества и физических свойств nAg100 и Ag⁺ в кожных слоях мышей in vivo

Для оценки практического применения этого подхода мы анализировали количество и физические свойства Ag в эпидермисе и дермисе, а также в периферической крови, после воздействия мышьей кожи nAg100 и Ag⁺ in vivo. Через 5 дней после воздействия мы разделяли кожу на эпидермис и дермис при оптимизированных условиях микроволнового облучения и растворяли их NaOH, как описано в предыдущем разделе. Анализ ICP-MS показал, что Ag присутствовал во всех тканях (таких как эпидермис, дермис и кровь) во всех группах. В дермисе и крови Ag в группе, подвергшейся воздействию Ag⁺, тенденциально увеличивался по сравнению с группой, подвергшейся воздействию nAg100 (рис. 4a). Данные предполагали, что хотя и ионная, и частичная формы перкутально поглощались и распределялись, как сообщалось ранее, ионные формы легче проникали в глубокие тканевые слои, чем частичные формы.

Затем оценивали отношение nAg и Ag⁺ в каждом образце. В группе, подвергшейся воздействию Ag⁺, почти весь Ag обнаруживался в ионной форме в эпидермисе, дермисе и крови, указывая на то, что Ag⁺ перкутально поглощался и распределялся без изменения физических свойств. Напротив, в группе, подвергшейся воздействию nAg100, примерно 70% Ag в эпидермисе и дермисе присутствовало в частичной форме, в то время как остальной Ag ионизировался. Более того, Ag, обнаруженный в периферической крови, был почти полностью ионизирован, а частичная форма практически не обнаруживалась (рис. 4b). Наконец, оценивали размер частиц в эпидермальном и дермальном слоях, где в основном обнаруживались частичные формы. Анализ sp-ICP-MS раскрыл, что размеры частиц, обнаруженных в обоих слоях, составляли примерно 70–80 нм, соответствующие скорости ионизации nAg100 (рис. 4c). Эти данные предполагают, что когда кожа воздействуется nAg100, он может поглощаться и распределяться, будучи ионизированным.

Как сообщалось ранее, поверхностные лиганды наночастиц влияли на их поглощение кожей. Например, золотые наночастицы, модифицированные аминогруппой, поглощались в мышью и человеческую кожу в большей степени, чем золотые наночастицы, модифицированные карбоксилгруппой, в ex vivo экспериментах. Более того, молекулярно-динамический анализ указывал, что способность проникать в кожу уменьшалась от нейтральных гидрофобных к катионным к анионным золотым наночастицам в этом порядке. В этом отношении в настоящем исследовании делалось заключение, что nAg100 менее вероятно проникает через SC в эпидермисе, исходный кожный барьер, потому что nAg100 модифицирован цитратом и нежно заряжен. Поэтому причиной наблюдения частиц в дермисе и крови могло быть то, что частицы проникали через поры, а также через эпидермис.

Также сообщалось, что проникающая способность золотых наночастиц улучшалась модификацией клеточнопроникающими пептидами, такими как Tat и R7. Поэтому в будущем подобные модификации можно рассмотреть для nAg для их доставки глубже в кожу. Кроме того, может быть необходимо уменьшить размер nAg, потому что эффект поверхностной модификации больше при большей удельной поверхности.

Заключение

В этом исследовании мы разработали подход предобработки для полуколичественного определения физических свойств nAg100 в каждом кожном слое с помощью sp-ICP-MS. Используя этот подход, мы показали, что воздействие кожи nAg100 может привести к ионизации nAg100, его поглощению и распределению в более глубокие слои. Поэтому для понимания биологических ответов или токсичности, связанной с воздействием кожи nAg100, может быть необходимо учитывать не только распределение nAg100 и его размер частиц, но и Ag⁺ из nAg100, который расплавляется в кожных тканях. Следовательно, этот подход показывает перспективы как фундаментальная техника, которая может использоваться для анализа рисков.

Доступность данных и материалов

Обмен данными не применим к данной статье, так как наборы данных не были сгенерированы или проанализированы в ходе текущего исследования.

Аббревиатуры

ENPs:

Инженерные наночастицы

nAg:

Наночастица серебра

Ag⁺:

Ионы серебра

sp-ICP-MS:

Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой в режиме одиночных частиц

SC:

Роговой слой

nAg100:

Наночастица серебра диаметром 100 нм

AgNO₃:

Нитрат серебра

NaOH:

Гидроксид натрия

HNO₃:

Азотная кислота

PBS:

Фосфатно-буферный раствор

ICP-MS:

Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой

EDJ:

Эпидермально-дермальный стык