Количественное исследование поглощения наночастиц PLGA раковыми клетками гортани и иммунными клетками для улучшения доставки лекарств

Аннотация

Клиническое применение наномедицины на основе поли(лактид-ко-гликолид) (PLGA) ограничено, в том числе из-за низкой эффективности доставки, вызванной неспецифическим фагоцитозом фагоцитами. Взаимодействие наночастиц с раковыми и иммунными клетками до сих пор плохо изучено. В данном работе впервые проведено количественное исследование клеточного поглощения флуоресцентных частиц PLGA (100 нм, 500 нм и 1 мкм) клетками рака гортани в моно- и кокультуре с моноцитами/макрофагами. Частицы PLGA в концентрациях 5–20 мкг/мл демонстрируют высокую биосовместимость, за исключением частиц 500 нм и 1 мкм при 20 мкг/мл, которые незначительно снижают живучесть клеток. Микроскопическое наблюдение показало, что все три размера частиц эффективно поглощаются как раковыми клетками, так и макрофагами; однако количественный флуоресцентный анализ выявил, что индекс поглощения раковыми клетками (средняя внутриклеточная флуоресценция частиц на раковую клетку, нормированная на макрофаг) существенно снижается для всех частиц PLGA в кокультурах по сравнению с монокультурами (1,35–1,05, 1,50–0,59 и 1,4–0,47 для частиц 100 нм, 500 нм и 1 мкм соответственно). Анализ методом потоковой цитометрии подтвердил снижение индекса поглощения раковыми клетками в кокультурах, но более высокое количество частиц на макрофаг. Также установлено, что лечение PLGA способствует формированию многоядерных гигантских клеток за счет слияния макрофагов, что может быть использовано как потенциальный подход для доставки лекарств в опухоль. Полученные результаты дают новые сведения о взаимодействии наночастиц с иммунными и раковыми клетками, что может способствовать применению нанопереносчиков на основе PLGA для лечения рака гортани.

Введение

Рак является одной из главных причин смертности во всем мире: в 2018 г. зарегистрировано около 10 млн новых случаев смертности [1]. Рак гортани (злокачественные клетки, возникающие в гортани) — второе по распространенности злокачественное новообразование среди пластиноклеточных раков головы и шеи (ПКРГШ), в 2018 г. диагностировано около 180 000 новых случаев и 95 000 смертей [2]. В настоящее время разрабатываются таргетированные препараты как альтернативное лечение для проблем, возникающих при традиционных терапиях: хирургии, лучевой и химиотерапии [3]. Научные усилия направлены на улучшение таргетирования и эффективности препаратов, а также снижение побочных эффектов за счет разработки новых нанопереносчиков лекарств (например, микроигл), персонализированных противоопухолевых препаратов и систем таргетированной доставки терапевтических антител [4].

Нанопереносчики широко используются для загрузки противоопухолевых препаратов, таких как цисплатин, паклитаксель и докетаксель, чтобы улучшить их водорастворимость, биодоступность и стабильность для повышения эффективности доставки и терапии [3, 4]. В целом, доставка лекарств на основе наночастиц (НЧ) позволяет адресовать широкий спектр веществ (белки, антитела, вакцины, нуклеиновые кислоты) в конкретные области организма как в животных моделях, так и у пациентов [4, 5]. Однако так называемый эффект усиленной проницаемости и удержания (EPR) приводит к значительной вариабельности таргетинговой эффективности среди разных типов рака [6]. Недавние данные указывают, что накопление нанолекарственных переносчиков (здесь — золотых НЧ) в опухолях преимущественно зависит от процесса транцитоза [7] — типа внутриклеточного транспорта, при котором вещества/НЧ переносятся через клетку от одной стороны к другой, включая стадии эндоцитоза, везикулярного переноса и экзоцитоза. Следует отметить, что противоречивые результаты относительно механизмов таргетированной доставки подчеркивают критическую важность понимания основ клеточного взаимодействия с нанолекарствами или НЧ с использованием множества экспериментальных стратегий: от in vitro клеточных культур до ex vivo тканевых культур и in vivo животных исследований.

Множество нанопереносчиков — липосомы, альбуминовые НЧ, кремнезовые НЧ и поли(лактид-ко-гликолид) (PLGA) — клинически применяются для лечения различных типов рака, включая рак гортани [4]. Полимерные НЧ, такие как мицеллы и PLGA, обладают большим потенциалом в биомедицине благодаря универсальным формулировкам нанолекарств путем простого смешивания или ковалентной конъюгации, отличной способности к самоассамблерированию, высокой загрузочной способности и биосовместимости [8, 9]. Например, PLGA-нанопереносчики, модифицированные полиэтиленгликолем (ПЭГ) и загруженные доксорубицином и индицианином green, обеспечивают синергетическую хемо-фототермическую терапию рака груди [10]. Также как in vitro, так и in vivo исследования показали, что мицеллы с цисплатином демонстрируют высокую противоопухолевую активность против ортотопических опухолей ПКРГШ (SAS-L1 и HSC-2) [11]. Хотя несколько полимерных нанопереносчиков, таких как PLGA и мицеллы, одобрены для клинического применения или проходят клинические испытания [4, 6], гораздо больше полимерных нанолекарств находятся на стадии до клинических исследований с различными клеточными линиями рака головы и шеи и ксенографтными опухолевыми моделями животных [11–14].

Научные данные подчеркивают значение иммунного ответа организма на нанолекарственные переносчики, поскольку как только НЧ попадают в организм, они неизбежно распознаются иммунной системой. Макрофаги считаются первой линией клеточной защиты хозяина, специализирующейся на нейтрализации и очищении аллергенов, микроорганизмов и чужеродных частиц (например, нанопереносчиков) через фагоцитоз и последующую активацию иммунного ответа. Большинство новoproектированных нанопереносчиков не достигают таргетированной доставки в злокачественные области или опухоли in vivo из-за эффективного накопления НЧ в мононуклеарной фагоцитарной системе (МФС), такой как купферовы клетки в печени и макрофаги красной мякоти селезенки [15]. Поэтому понимание механизмов клеточного поглощения НЧ иммунными клетками (моноцитами и макрофагами) критически важно, так как оно определяет время жизни нанопереносчиков в соответствующих тканях и биологических жидкостей. Встречные in vitro системы кокультуры постепенно привлекают все больше внимания в наномедицине и токсикологии из-за растущего спроса на более значимые результаты, лучше отражающие in vivo условия [16]. Действительно, системы кокультуры демонстрируют реалистичную картину при моделировании здоровых и болезненных состояний тканей [17] и надежно используются в исследованиях клеточного поглощения НЧ и абсорбции лекарств [18–21]. Использование моделей кокультуры раковых и иммунных клеток предоставляет подходящую платформу для изучения путей и механизмов поглощения этих наноматериалов клетками, что может способствовать проектированию нанопереносчиков, лучше таргетированных на раковые клетки при одновременном снижении фагоцитоза НЧ. Поэтому необходимо определить эффективность и судьбу НЧ в раковых клетках в присутствии иммунных клеток. Большинство нанопереосчиков проектируют с диаметром 50–200 нм для использования EPR-эффекта и продления циркуляции в крови, в то время как более крупные НЧ (> 500 нм) эффективно очищаются МФС [6]. PLGA, одобренный FDA нанопереосчик, в различных размерах (100, 500 и 1000 нм) был выбран для изучения способностей к поглощению клетками UM-SCC-17A (классическая линия плоскоклеточного рака гортани) [22] и THP-1 (линия человеческих острой моноцитарной лейкемии). Несколько in vitro исследований применяли PLGA-нанопереосчики для доставки препаратов в клетки ПКРГШ в монокультурах [12, 13, 23], но это первое исследование, изучающее эффективность и механизм поглощения НЧ иммунными и раковыми клетками гортани синхронно в модели кокультуры с использованием PLGA разных размеров, что может дать фундаментальную базу для разработки новых безопасных наномедицин для терапии ПКРГШ.

Материалы и методы

Материалы

В исследовании использовались три коммерческих препарата частиц PLGA (Sigma-Aldrich) разных размеров: 100 нм, 500 нм и 1000 нм. Все частицы были загружены зелеными флуорофорами с длинами волн возбуждения и эмиссии (ex/em) 460 нм и 500 нм. Частицы поступали в виде порошка и растворялись в дистиллированной воде до конечной концентрации 10 мг/мл для дальнейшего использования. Гидродинамические диаметры и дзета-потенциалы трех частиц определялись динамическим световым рассеянием (ДСР) на приборе Malvern Zeta Sizer Nano (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK). Стоковые суспензии каждой частицы разбавлялись 1:100 в 80 мкл дистиллированной воды для измерений ДСР. Согласно указаниям производителя, для каждой частицы проводилось 3 повторных измерения.

Клеточные культуры UM-SCC-17A и THP-1 и инкубация с частицами

Линия клеток рака гортани человека UM-SCC-17A и линия моноцитов/макрофагов человека THP-1, приобретенные у Sigma-Aldrich (США) и Shanghai Hengya Biotechnology Company (Китай) соответственно, использовались для создания in vitro модели. Клетки UM-SCC-17A и THP-1 культивировали в среде DMEM [22] или RPMI-1640 с добавлением 10% ФСБ (Gibco, Германия) и 1% пенициллин-стрептомицин (Gibco, Германия) при 37 °C и 5% CO2. Клетки THP-1 перед посевом дифференцировали в макрофаги экспозицией к 100 нМ форбола 12-миристата 13-ацетату (ФМА) (Sigma, США) в течение 72 ч. Обе линии клеток пассажировали с 0,5% трипсин-ЭДТА каждые 3 дня, морфологию проверяли ежедневно для контроля жизнеспособности.

Клетки посеяли в 24-колбовые пластинки по 0,1 × 10⁶ клеток/колба для монокультур (WST-1 и LDH-тесты) или на стерильные стеклянные couvre-slips в 24-колбовые пластинки для флуоресцентной микроскопии. Для модели кокультуры клетки UM-SCC-17A сначала посеяли по 50 000/колба на ночь, затем добавили 50 000/колба клеток THP-1. Частицы взвешивали в 500 мкл соответствующей среды для монокультур или 1:1 смешанной среды для кокультур и инкубировали с клетками 24 ч при конечных концентрациях 5, 10 и 20 мкг/мл для WST-1 и LDH-тестов или 10 мкг/мл для флуоресцентной микроскопии.

Для измерений FACS клетки посеяли в 12-колбовые пластинки аналогичным образом при плотности 250 000 клеток/колба, или 125 000 клеток/колба каждого типа для кокультуры. Клетки выращивали в 1 мл среды на ночь и инкубировали с частицами PLGA при конечной концентрации 10 мкг/мл в течение 24 ч.

Тест на живучесть клеток (WST-1)

Живучесть клеток определялась по набору реагентов WST-1 (Roche, Германия) согласно инструкции производителя. Раствор WST-1 разбавляли 1:10 в соответствующей среде для монокультур UM-SCC-17A или THP-1, или в 1:1 смешанной среде для кокультур. После инкубации супернатант удаляли, клетки инкубировали с 500 мкл рабочего раствора WST-1 при 37 °C в течение 30 мин. Образцы центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 10 мин для удаления частиц. Абсорбция (OD) измеряли при длине волны 450 нм на Infinite®F200 (Tecan, США). Значения абсорбции корректировали вычитанием значения бланка (только рабочий раствор WST-1), относительная живучесть сравнивалась с необработанным контролем.

Тест на проницаемость клеточной мембраны (LDH)

Высвобождение лактатдегидрогеназы (LDH) измеряли коммерческим набором (Roche, Германия) для определения цитотоксичности частиц PLGA. Супернатант собирали через 24 ч после экспозиции, центрифугировали при 14 000 об/мин 10 мин и разбавляли 1:10 в 200 мкл полной среды. Позитивный контроль — полное высвобождение LDH инкубацией клеток с 0,2% Тритон X-100 при 37 °C 15 мин, разбавленным 1:50 в 200 мкл среды. Образцы инкубировали с 100 мкл рабочего раствора LDH 30 мин при комнатной температуре, реакцию останавливали 50 мкл 1% HCl. Абсорбция при 492 нм измеряли на Infinite®F200 (Tecan, США), относительная концентрация LDH рассчитывали по формуле:

Относительная концентрация LDH = (OD образца – OD бланка) / (OD позитивного контроля – OD бланка) × 5 × 100%

Флуоресцентная микроскопия

Клетки визуализировали окраской Hoechst для локализации частиц под флуоресцентным микроскопом. После 24-часовой экспозиции клетки промывали ПБС 3 раза, фиксировали 4% формальдегидом 10 мин при комнатной температуре, затем инкубировали с 200 мкл раствора окраски (1:1000 Hoechst и 1% БСА в ПБС) 30 мин. Покрыстекла переносили на предметное стекло вверх дном с каплей антифлюоресцентного средства DAKO. Настраивали четыре оптических канала: яркое поле для морфологии, DAPI для ядер, GFP для частиц. Время экспозиции канала частиц фиксировали для гомогенизации интенсивности флуоресценции, внутриклеточные частицы рассчитывали по интенсивности флуоресценции в случайно выбранных областях с помощью ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Индекс поглощения сравнивали между моно- и кокультурами UM-SCC-17A. Средняя флуоресцентная интенсивность (MFI) внутриклеточных частиц рассчитывали по 50 клеток каждого типа как разность между общей флуоресценцией (I_total) конкретной области и автофлуоресценцией (I_auto) равной области без частиц [24, 25]. Индекс поглощения раковых клеток определяли как MFI UM-SCC-17A, нормированную на MFI THP-1 в моно- или кокультуре по формуле:

Индекс поглощения = (I_total1 – I_auto1) (MFI_UM-SCC-17A) / (I_total2 – I_auto2) (MFI_THP-1)

Флуоресцентно-активированная клеточная сортировка (FACS)

FACS использовали для количественного определения поглощения трех типов частиц. Через 24 ч после экспозиции клетки промывали ПБС 3 раза для удаления среды и адсорбированных частиц, инкубировали с 200 мкл 0,5% трипсин-ЭДТА (Gibco, Германия) при 37 °C 4 мин для откола. Реакцию останавливали добавлением 2 мл полной среды, суспензию переносили в стеклянную пробирку для FACS и центрифугировали 5 мин при 300 × G, 4 °C. Супернатант аккуратно удаляли, клетки ресуспендировали в 200 мкл ПБС и хранили на льду. Живые клетки гейтировали от обломков и мертвых клеток по прямому (FSC-A) и боковому (SSC-A) рассеянию. Затем кокультурные клетки анализировали по каналу APC против FSC-A для разделения UM-SCC-17A и макрофагов по размеру. Анализировали 30 000 клеток на образец, среднюю флуоресцентную интенсивность на клетку рассчитывали и нормировали между частицами. Кроме того, после 24-часовой инкубации собирали супернатант, промывочный буфер (трижды для удаления остаточных частиц на поверхности) и клетки (трипсинизированные) для измерения флуоресцентной интенсивности на микропластинке (Infinite®F200, Tecan). Этот подход позволял определить процент частиц, поглощенных клетками. Например, при дозе 5 мкг частиц PLGA 100 нм на 30 000 частиц на клетку в 12-колбовой пластинке (250 000 клеток всего) в среднем 13 000 частиц интернализировались одной клеткой, что составляет около 43% от приложенной дозы. Этот процент доставки использовали для расчета количества частиц в кокультуре для каждого типа клеток по FACS.

Квантификация слияния клеток

Слияние макрофагов в многоядерные гигантские клетки (МГК) определяли как гигантские клетки, морфологически содержащие два или более ядер в обычном цитоплазме, что четко идентифицировалось в изображениях яркого поля и флуоресцентных изображениях после окраски [26]. Процент слияния рассчитывали как число ядер МГК (ручной подсчет), нормированное на общее число клеток, определенное автоматическим методом в ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Статистический анализ

Для статистического анализа и визуализации результатов использовали GraphPad V8.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). После одностороннего ANOVA применяли метод Холма-Шидака или t-критерий для сравнения множественных или двух групп соответственно. Все эксперименты проводили в трех независимых повторениях, данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (STD). Различия считали значимыми при p < 0,05 (*) и p < 0,01 (**).

Результаты и обсуждение

Характеристика частиц поли(лактид-ко-гликолид)

Флуоресцентные микрографий частиц PLGA (Рис. 1a,b,c) показали высокую флуоресцентную интенсивность и отсутствие значимого снижения сигналов в течение 14 дней после приготовления (Доп. файл 1: S1), что свидетельствует о относительно однородном распределении размеров и высокой флуоресцентной стабильности. По данным поставщика, частицы PLGA 100, 500 и 1000 нм имели размеры около 80,6 ± 19,3 нм, 542,6 ± 128,3 нм и 951,9 ± 237,5 нм (Рис. 1d,e,f) соответственно. По измерениям дзета-потенциала средние заряды на частицах составили −20,6 ± 5,3, −17 ± 4,6 и −16,5 ± 3,5 с индексами полидисперсности 0,057, 0,056 и 0,062 для частиц 100, 500 и 1000 нм соответственно, что указывает на их высокий монореперсность. Все частицы обрабатывали вихрем и ультразвуком в водяной бане 5 мин для устранения агрегации. Однако для частиц 100 и 1000 нм наблюдались небольшие пики при диаметрах 4–6 мкм из-за неизбежной агрегации в очень малых количествах (около 3–4%).

Оценка живучести и цитотоксичности клеток

Благодаря отличной биосовместимости и биоразлагаемости частицы PLGA одобрены FDA и Европейским агентством лекарственных средств для биомедицинских применений [27, 28]. PLGA широко используются в клинике и до клинических исследований как нанопереосчики для доставки препаратов в злокачественные области или опухоли. Однако таргетинговая эффективность и терапевтическая эффективность PLGA препятствует, по крайней мере частично, иммунная система. Например, высокий фагоцитоз частиц купферовыми клетками печени сильно ограничивает проникновение нанолекарственных переносчиков в опухоль [15]. Поэтому жизненно важно создавать продвинутые in vitro модели для изучения взаимодействия раковых клеток, иммунных клеток и частиц, чтобы лучше имитировать in vivo условия доставки лекарств. UM-SCC-17A — уникальная линия плоскоклеточного рака гортани, выделенная из первичного образца рака гортани [29]. Однако информации о ее in vitro эффективности поглощения в системах кокультуры (например, совместной инкубации макрофагов и раковых клеток) все еще недостаточно, что необходимо для улучшения прогнозирования in vivo ответов. Кроме того, доказано, что размер частиц и поверхностное покрытие играют важную роль в доставке в твердые опухоли, больные участки и раковые клетки в животных моделях и клеточных культурах [30–33]. Здесь мы применили три размера PLGA к карциномным клеткам UM-SCC-17A для изучения влияния размера частиц на клеточное поглощение и внутриклеточное распределение в моно- и кокультурах.

Живучесть клеток определяли методом WST-1 (4-[3-(4-йодофенил)-2-(4-нитрофенил)-2H-5-тетразолио]-1,3-бензолдисульфонат) для монокультур THP-1 и UM-SCC-17A, а также их кокультуры. Несмотря на отсутствие явной гибели клеток в группах, обработанных 100 и 500 нм PLGA при всех тестируемых концентрациях, частицы 500 нм и 1 мкм при наивысшей концентрации (20 мкг/мл) значительно снижали живучесть в монокультуре UM-SCC-17A (Рис. 2a). Как и ожидалось, живучесть THP-1 не менялась значительно после 24-часовой инкубации со всеми тремя типами PLGA при концентрациях 5–20 мкг/мл (≥ 95% живучести по сравнению с необработанными клетками, считаемыми 100%, Рис. 2b). В кокультуре результаты были идентичны монокультуре UM-SCC-17A: живучесть не менялась при наличии 100 и 500 нм PLGA в трех дозах, но значительно снижалась в группе с 20 мкг/мл 1 мкм PLGA (Рис. 2c).

Оценка цитотоксичности методом LDH основана на определении утечки клеточной мембраны путем измерения внеклеточного LDH [9]. Высвобождение этого цитоплазматического фермента в супернатант характерно для повреждения клеточной мембраны, ведущего к необратимой гибели клеток. Несмотря на незначительное повышение уровня LDH при более высоких дозах в монокультуре UM-SCC-17A, обработанной различными дозами 1 мкм PLGA, явной цитотоксичности не наблюдалось даже при 20 мкг/мл (Рис. 3a). Все три размера PLGA при различных дозах не индуцировали существенного высвобождения LDH в супернатант, указывая на незначительные токсические эффекты для монокультуры THP-1, что полностью согласуется с результатами живучести (Рис. 3b). В экспериментах кокультуры все частицы с разными концентрациями показали отличную биосовместимость по отношению к обеим клеткам в терминах высвобождаемого LDH (Рис. 3c). В целом, используемый здесь широкий диапазон размеров частиц от 100 нм до 1 мкм охватывает типичные размеры нанопереосчиков (50–200 нм), такие как липосомы, мицеллы, дендримеры, полимеры и мини-клетки. Этот диапазон также покрывает субмикронные частицы (500 нм все еще можно считать НЧ, например, частицы ~500 нм имеют те же пути клиренса в легких, что и НЧ 10–100 нм [34]) и микронные 1 мкм. Ни одна из этих частиц PLGA не проявляла явной цитотоксичности по отношению к THP-1 и/или UM-SCC-17A в моно- и кокультурах, за исключением 500 нм и 1 мкм PLGA при наивысшей концентрации против UM-SCC-17A и кокультуры (но выживало более 85% клеток), что свидетельствует о их пригодности для применения в системах доставки лекарств.

Способности к клеточному поглощению PLGA в моно- и кокультурах

Рис. 4 показывает морфологию клеток (Рис. 4a,d,g), ядра клеток и 100 нм НЧ (Рис. 4b,e,h) и объединенные увеличенные изображения (Рис. 4c,f,i) в моно- и кокультурах. В контрольной группе без частиц частиц не наблюдалось (Доп. файл 1: S2). Массивные агломераты крупных 100 нм PLGA НЧ обнаруживались в цитоплазме макрофагов монокультуры (Рис. 4c). В то же время монокультура UM-SCC-17A демонстрировала отличную способность к поглощению 100 нм PLGA, что подтверждается яркими зелеными флуоресцентными сигналами внутри клеточной мембраны (Рис. 4f). Для лучшей иллюстрации внутриклеточного накопления PLGA в THP-1 или UM-SCC-17A и внеклеточных частиц в кокультурах использовали наложение изображений яркого поля с флуоресцентными (Доп. файл 1: S3). В кокультуре оба типа клеток отличались по морфологии и размеру на изображениях яркого поля: макрофаги имели округлую форму и малый размер, тогда как раковые клетки — большой размер и удлиненную форму. Однако раковые клетки показывали недостаточное клеточное поглощение из-за высокого поглощения 100 нм PLGA макрофагами в кокультуре. Это ожидаемо, так как макрофаги являются эффективным и специфическим типом иммунных клеток, выполняющих фагоцитоз для очищения чужеродных микроорганизмов, аллергенов и частиц. Аналогично, Рис. 5 и 6 показывают качественный анализ клеточного поглощения 500 нм и 1 мкм PLGA в однотипных или смешанных культурах.值得注意的是, морфология обоих типов клеток не менялась после обработки разными размерами PLGA при концентрации 10 мкг/мл (Рис. 4a,d,g, 5a,d,g, 6a,d,g). Частицы 500 нм и 1 мкм PLGA демонстрировали более сильную флуоресцентную интенсивность в отдельных клетках UM-SCC-17A (Рис. 5e,f и 6e,f), чем в отдельных THP-1 (Рис. 5b,c и 6b,c). В кокультурах (Рис. 5h,i и 6h,i) наблюдалось явное снижение сигналов в раковых клетках: флуоресцентная интенсивность частиц была ниже, чем у макрофагов. Макрофаги быстро и эффективно фагоцитировали все типы частиц, так что раковые клетки не могли поглотить достаточно частиц в кокультуре. Для количественной оценки влияния фагоцитоза на поглотительную способность раковых клеток для разных размеров PLGA провели полуколичественный оптический анализ. Интенсивность флуоресценции частиц рассчитывали на основе, например, 50 отдельных клеток, содержащих частицы, для получения среднего значения для обоих типов клеток, а индекс поглощения раковых клеток определяли как среднюю внутриклеточную флуоресцентную интенсивность на раковую клетку, нормированную на макрофаги (Рис. 7). В монокультуре индекс поглощения раковыми клетками для 100 нм PLGA составил около 1,34 ± 0,19, что указывает на то, что раковые клетки поглотили больше частиц, чем макрофаги в однотипной культуре (Рис. 7). Это неудивительно из-за высокой вязкости частиц PLGA и большего размера клеток рака гортани. Аналогично, 500 нм и 1 мкм PLGA также активно интернализировались раковыми клетками с индексами поглощения примерно 1,5 ± 0,25 и 1,4 ± 0,31 соответственно в монокультуре. Индексы поглощения для крупных частиц существенно снижались (0,59 ± 0,12 и 0,47 ± 0,1) в присутствии макрофагов в кокультурах. При этом для 100 нм PLGA в смешанной культуре наблюдались идентичные клеточные поглотительные способности для обоих типов клеток. Накопленные результаты предполагают, что поглощение частиц раковыми клетками и макрофагами может зависеть от разных путей поглощения в моно- и кокультурах. Кроме того, присутствие макрофагов снижает клеточное поглощение частиц PLGA раковыми клетками, особенно крупных, — биологическое событие, наблюдаемое в in vivo исследованиях доставки нанолекарств [3, 15].

Квантификация клеточного поглощения методом потоковой цитометрии

Потоковая цитометрия широко используется для количественного определения взаимодействия частиц с клетками, например, размерозависимого поглощения полистироловых частиц 20–1000 нм дендритическими клетками in vivo [35]. FACS использовали для анализа процента НЧ-позитивных клеток и количества частиц в этих клетках в моно- и кокультурах. Затем среднее число НЧ в одной клетке рассчитывали, определяя общую флуоресцентную интенсивность в клетках, содержащих частицы, нормированную на флуоресценцию всей приложенной дозы. Например, около 70% 500 нм PLGA оседало в раковых клетках, а остаток оставался в супернатанте (Доп. файл 1: S4). Эта флуоресцентная интенсивность, измеренная на Tecan, сравнивали со средними/общими сигналами FACS (значения FITC сигналов P5 и P6 на Рис. 8) для оценки количества частиц в кокультуре. Поскольку в кокультуре примерно половина клеток определялись как макрофаги, а остальные — как раковые клетки. Наблюдалось, что примерно 13 000 одиночных частиц 100 нм PLGA накапливались в раковых клетках и 9700 — в макрофагах (Рис. 8i) в монокультуре, что согласуется с микроскопическими данными. Значительно меньшее число частиц (164 ± 30 и 45 ± 15) поглощалось монокультурными раковыми клетками для 500 нм и 1 мкм PLGA, с незначительно меньшим количеством в соответствующих макрофагах (Рис. 8i). Количество частиц, поглощенных одной клеткой, хорошо согласуется с литературными данными [24]; например, в среднем 2500 золотых НЧ, покрытых цетилтриметиламмониевым бромидом, оседало в эпителиальных клетках, тогда как ПЭГ-модифицированные золотые НЧ давали лишь несколько десятков на клетку [36]. В кокультурах неожиданно наблюдалось незначительное увеличение числа 100 нм частиц в раковых клетках, несмотря на более высокое усиление интернализации НЧ макрофагами. Сравнивая индекс поглощения в моно- и кокультурах, он снижался примерно на 25% для 100 нм PLGA. Индексы поглощения значительно снижались примерно в 2,5 и 3 раза в кокультуре для 500 нм и 1 мкм PLGA соответственно (Рис. 8i). В целом, установлено, что наличие макрофагов в значительной степени влияет на поглотительную способность раковых клеток, особенно для крупных частиц, что в полном соответствии с вышеприведенными наблюдениями.

В настоящее время в литературе описаны различные пути поглощения частиц разными размерами и поверхностными модификациями раковыми клетками: клатрин-зависимый эндоцитоз, кавеол-зависимый эндоцитоз, клатрин- и кавеол-независимый эндоцитоз, микропиноцитоз и макропиноцитоз [37]. Например, доказано, что агрегаты оксида железа < 200 нм поглощаются клетками MCF-7 через клатрин-зависимый эндоцитоз, в то время как более крупные агрегаты — через макропиноцитоз [38]. Другое исследование показало, что 100 нм простые полистироловые частицы поглощаются преимущественно через макропиноцитоз, тогда как интернализация карбоксилированных полистироловых частиц предпочтительно происходит через клатрин-зависимый эндоцитоз [25]. Фагоцитоз — классический путь поглощения для иммунных клеток: нейтрофилов, дендритических клеток и, что наиболее важно, моноцитов/макрофагов. Пути поглощения тесно зависят от различных параметров везикул доставки лекарств: размера частиц, химического состава, поверхностной модификации, белков в среде культивирования и типа клеток. Обычно в поглощении частиц могут участвовать несколько путей, например, кавеол-зависимый эндоцитоз, клатрин-зависимый эндоцитоз и макропиноцитоз, которые участвуют в клеточной интернализации 300–400 нм хитосановых НЧ в человеческих клетках HeLa [39]. Также наблюдалось, что 63 нм холестерин-модифицированные пуллановые НЧ проникают в человеческие гепатоцеллюлярные карциномы (HepG2) через макропиноцитоз и клатрин-зависимый эндоцитоз [40]. Несколько предыдущих исследований показали, что клеточное поглощение частиц PLGA включает разные эндоцитические пути, при этом клатрин-независимый эндоцитоз является основным маршрутом для интернализации PLGA in vitro [23, 24, 37]. Однако после проникновения в клетки частицы PLGA, используемые здесь, с высокой вероятностью захватывались эндолизосомной системой, состоящей из ранних эндосом, рециклирующих эндосом, поздних эндосом и лизосом [41]. Следует отметить, что существует дефицит исследований, показывающих механизмы клеточного поглощения в ко- или три-культурных системах in vitro, что необходимо изучить в будущем.

Индукция слияния клеток наночастицами PLGA

Обширные научные данные показывают, что слияние моноцитов/макрофагов в многоядерные гигантские клетки (МГК) происходит в широком спектре биологических процессов [42, 43]. Введение биоматериалов в организм вызывает реакцию на чужеродное тело, характеризующуюся слиянием макрофагов в МГК и фиброзной инкапсуляцией [44]. Широкий спектр человеческих и мышиных первичных клеток — альвеолярных макрофагов, селезенковых макрофагов, микроглии, костномозговых макрофагов, моноцитов крови, а также клеточных линий RAW264.7 и UG3 — также часто образуют МГК in vitro [26, 45]. Известно, что макрофаги формируют фусогенный фенотип, когда не способны поглотить чужеродные материалы фагоцитозом из-за крупного размера частиц или имплантов. До сих пор неясно, связано ли in vitro слияние макрофагов с размером частиц в диапазоне 100–1000 нм, которые легко фагоцитируются. Здесь слияние клеток наблюдалось во всех группах микроскопическим исследованием (Рис. 9). Клеточное слияние подтверждали только при обнаружении множественных ядер, разделяющих одно цитоплазму, как на флуоресцентных, так и на изображениях яркого поля. Спонтанное формирование гигантских клеток THP-1 происходило в контрольной группе без обработки частицами (Рис. 9a), с процентом слияния около 10% от общего числа клеток (Рис. 9h), как сообщается в литературе [46]. Размерозависимое клеточное слияние обнаружили для 100 и 500 нм частиц PLGA, тогда как 1 мкм PLGA не вызывал значимого усиления слияния в монокультуре. Это может быть связано с малым числом 1 мкм частиц PLGA, контактирующих с клетками (примерно 60 частиц на клетку при концентрации 10 мкг/мл). Когда макрофаги кокультивировали с раковыми клетками, проценты формирования МГК увеличивались во всех группах по сравнению с соответствующими монокультурными группами. В частности, отмечался значимый прирост слияния для 1 мкм PLGA (19%) в смешанной культуре. Наиболее выраженное увеличение слияния происходило в кокультуре с 500 нм PLGA, что может быть связано с крупным размером частиц и достаточным количеством поглощенных частиц на клетку.

Молекулярная машина, вовлеченная в слияние макрофагов, широко изучалась, достигнув существенного прогресса [43]. Например, образование рецепторов слияния макрофагов CD47 и CD44 вместе медиацию процесса слияния и последующей дифференцировки гигантских клеток [42], а доставка miR-223 наночастицей-везикулой позволяла ослабить этот процесс [47]. Следовательно, дальнейшие исследования должны сосредоточиться на определении ключевых молекул, регулирующих индуцированное частицами слияние макрофагов, и доминирующих рецепторов, экспрессируемых в мембране гигантских клеток. Другая важная проблема — судьба МГК. Считается, что МГК, сросшиеся с частицами или стимулами, могут впоследствии пройти апоптоз или некроз [48]. Это может привести к высвобождению непереваренных частиц или других крупных материалов другим клеткам in vitro или биологическим тканям in vivo, вызывая длительные воспалительные реакции или гранулемы. С другой стороны, само слияние макрофагов может быть полезным для доставки нанолекарств, например, в опухолевых тканях повторное высвобождение препаратов из макрофагов в раковые клетки может представлять усиленную способность к уничтожению опухоли. Что еще важнее, будущие исследования наномедицины должны решать вопрос о том, как использовать слияние макрофагов для доставки нанопереосчиков для улучшения диагностики и терапии заболеваний. Это потому, что макрофаги не только являются обширным типом иммунных клеток в организме с отличной способностью поглощения нанолекарств, но также могут использоваться в таргетированной генной доставке для восстановления поврежденных тканей.

Заключение

Насколько нам известно, это первое исследование, сообщающее о конкурентном клеточном поглощении частиц PLGA размерами от 100 нм до 1 мкм в кокультуре клеток рака гортани UM-SCC-17A и моноцитов/макрофагов THP-1. Полученные данные доказали, что иммунные клетки могут изменять/снижать интернализацию частиц раковыми клетками in vitro, что аналогично предыдущим выводам в in vivo исследованиях доставки нанопереосчиков. Также продемонстрировано размерозависимое и зависящее от условий клеточной культуры слияние макрофагов, индуцируемое частицами PLGA. Будущие исследования должны изучать механизмы поглощения в кокультурах и разрабатывать новые подходы для достижения более высокого индекса поглощения клетками рака гортани в присутствии фагоцитов. Кроме того, необходима детальная оценка внутриклеточного трафикинга и судьбы нанолекарственных переносчиков в ко- или три-культурных 3D-системах, которые лучше имитируют in vivo условия, перед использованием животных моделей in vivo и даже клинических испытаний.

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью [и ее дополнительные информационные файлы].

Аббревиатуры

PLGA:

Поли(лактид-ко-гликолид)

HNSCC:

Пластиноклеточный рак головы и шеи

EPR:

Эффект усиленной проницаемости и удержания

NPs:

Наночастицы

ICG:

Индицианин green

MPS:

Мононуклеарная фагоцитарная система

LDH:

Лактатдегидрогеназа

FACS:

Флуоресцентно-активированная клеточная сортировка

MGC:

Многоядерные гигантские клетки

DLS:

Динамическое световое рассеяние