Экологически чистая микроплазменная синтез желтосвечущих углеродных квантовых точек для визуализации раковых клеток и фотокаталитической инактивации

Аннотация

В последние годы многофункциональные наночастицы с комбинированными диагностическими и терапевтическими функциями показывают большой потенциал в наномедицине. В данном исследовании мы сообщаем об экологически чистом синтезе флуоресцирующих углеродных наноточек, таких как углеродные квантовые точки (CQDs), методом микроплазмы с использованием o-фенилендиамина. Полученные CQDs демонстрировали широкие пики поглощения при 380–500 нм и излучали яркую желтую флуоресценцию с пиком при 550 нм. CQDs быстро поглощались клетками гепатоцитарной аденокарциномы HeLa. При возбуждении синим светом эффективно производился яркий желтый флуоресцентный сигнал и интенсивные реактивные формы кислорода (ROS), позволяя одновременную флуоресцентную визуализацию раковых клеток и фотодинамическую инактивацию, с 40% снижением относительной жизнеспособности клеток. Кроме того, около 98% клеток были активны после инкубации с 400 мкг/мл CQDs в темноте, что выявило отличную биосовместимость CQDs. Таким образом, вновь полученные CQDs демонстрируются как материалы, которые могут быть эффективными и безопасными для использования в ин виво биообразовании и визуализационно-направленной раковой терапии.

Введение

Рак остается ведущей причиной смерти во всем мире [1]. Многофункциональные наночастицы с диагностическими и терапевтическими функциями имеют перспективные применения в наномедицине. Одновременная образ-направленная терапия — это новая концепция в лечении рака и показывает большой потенциал по оптимизации терапевтической эффективности. Она может предоставить полезную информацию относительно размера и локализации опухолей, оптимального временного окна для фототерапии и терапевтической эффективности [2–4]. Фотодинамическая терапия (PDT) использовалась для лечения многих видов рака и других заболеваний благодаря своей пространственно-временной селективности и неинвазивной природе [5, 6]. Идеальные фотосенсибилизаторы обычно обладают следующими характеристиками: (1) высокоэффективная генерация реактивных форм кислорода (ROS), (2) хорошая биосовместимость, и (3) водорастворимость [7]. Однако текущие применения PDT ограничены плохой водорастворимостью, нестабильностью и неоптимальными длинами волн возбуждения фотосенсибилизаторов. Поэтому генерация заместителей фотосенсибилизаторов с хорошей водорастворимостью и биосовместимостью экологически чистыми и низкозатратными методами необходима.

Углеродные квантовые точки (CQDs) получили огромное внимание благодаря своим уникальным полезным свойствам, таким как простой и экологически чистый синтез, низкая токсичность, замечательная биосовместимость, отличная водорастворимость и световая стабильность [8]. CQDs имеют потенциальное использование в клеточной визуализации, биосенсировании, адресной доставке лекарств и других биомедицинских применениях [9–13]. Существует два основных подхода для синтеза углеродных точек: нисходящий (top-down) и восходящий (bottom-up). Нисходящие методы включают электрохимическое окисление, лазерную абляцию, химическое окисление и ультразвуковые методы синтеза. Восходящие методы состоят из гидротермической обработки, микроволнового синтеза и термического разложения [14–17]. Однако высокие температуры, высокое давление и сильные кислоты, всегда требуемые, приводят к существенному энергопотреблению, сложным процессам и неизбежному вреду для окружающей среды. Поэтому новые экологически чистые синтетические методы возникают по требованию времени. Как сообщалось, CQDs могут быть произведены всего за несколько минут с использованием метода микроплазма-жидкость без условий высокой температуры, большого энерговвода и трудоемких процедур [18–20]. Микроплазмы обеспечивают уникальную физико-химическую среду для фундаментальных исследований и применений, включающих передовые материалы. Химические и электронные среды, предоставляемые микроплазмами, сильно неравновесны и могут накапливать энергию. В этой среде может быть произведено большое количество электронов, ионов, свободных радикалов и других возбужденных-ионизированных-активных веществ [21, 22]. Хотя o-фенилендиамин является сырьевым материалом для синтеза углеродных наноточек, он не использовался в микроплазменном синтезе [23–25].

В данном исследовании o-фенилендиамин использовался как сырье для синтеза CQDs методом микроплазмы. CQDs, сгенерированные этим методом, были равномерны по размеру (около 3,2 нм в диаметре) и демонстрировали пик эмиссии около 550 нм. Мы продемонстрировали, что вновь синтезированные CQDs могут производить большое количество ROS под световыми условиями. Ин витро, CQDs могли быть поглощены опухолевыми клетками HeLa и излучали желтый свет под возбуждением синей длины волны 420–500 нм с низкой токсичностью. Мы также наблюдали инактивацию опухолевых клеток HeLa под облучением 460 нм. Эти результаты указывают на то, что вновь полученные CQDs могут быть перспективными материалами для ин виво биообразования, визуализационно-направленной или адресной раковой терапии.

Результаты и обсуждение

Характеризация CQDs

Желтоэмиссионные CQDs в данном исследовании приготовлены простым и экологически чистым способом методом микроплазмы с использованием o-фенилендиамина как углеродного предшественника. Хотя метод микроплазменной обработки сообщался как используемый для синтеза углеродных наноточек, существует мало относительных исследований. На рис. 1A показаны изображения проходной электронной микроскопии (TEM) частиц CQD. Частицы, произведенные микроплазмой, были цикловидными или овальными с средним диаметром 3,2 нм. Как показано на высокоразрешающем изображении рис. 1A (вставка), решетчатое расстояние в CQDs составляет 0,21 нм, принадлежащее плоскости (1,1,0) графита. Рамановский спектр показывает, что D-мода, названная дефектно-индуцированной модой, находится около 1342 см⁻¹, а G-мода центрируется около 1507 см⁻¹ соответственно, в результате sp³ и sp²-гибридизации углерода (рис. 1E). Известно, что интенсивность D- моды по сравнению с G- модой зависит от размера графитовых микрокристаллов в образце. Чем выше беспорядок образца, тем выше интенсивное отношение ID/IG и тем меньше графитовый микрокристалл. Кроме того, D и G моды CQD порошков также могут рассматриваться как маленькие графитовые хлопья с относительно высоким интенсивным отношением ID/IG (0,77).

ФТИР и XPS — мощные инструменты для характеристики химического состава и структуры углеродных материалов. Данные ФТИР для CQDs записывались в диапазоне 400–4000 см⁻¹, как показано на рис. 1F. ФТИР-спектр выявил, что CQDs в основном содержат аминовые (3052 и 3324 см⁻¹), OH (3200 см⁻¹), C=O (1595 см⁻¹), C–N/C–O (1200 см⁻¹), C=C (1500 см⁻¹) и CH (748 см⁻¹) функциональные группы или химические связи [26, 27]. Поверхностные компоненты CQDs, определенные XPS, были согласованы с результатами ФТИР. Полный спектр, представленный на рис. 2A, показывал три типичных пика: C 1s (285 эВ), N 1s (400 эВ) и O 1s (531 эВ).

Как показано на рис. 2B–D, анализ C 1s выявил наличие sp²/sp³ углеродов (C–C/C=C, 284,8 эВ), нитрозных углеродов (C–O/C–N, 285,9 эВ) и карбонильных углеродов (C=O, 287,7 эВ). Полоса N 1s была деконволюционирована в три пика при 399,3, 400,3 и 401,7 эВ, соответствующие пирролическому N, графитному N и аминовому N соответственно. Полоса O 1s содержала пики при 531,6 и 533,1 эВ для C–O и C=O соответственно [28, 29]. Важно, существование этих функциональных групп наделило CQDs благоприятной растворимостью. Кроме того, оптические свойства CQDs исследовались с использованием флуоресцентной спектроскопии и UV-вис абсорбции. Флуоресцентные спектры эмиссии CQDs показаны на рис. 1C. Приготовленные CQDs демонстрируют зависящее от длины волны возбуждения поведение флуоресцентной эмиссии. При возбуждении длинами волн от 400 до 500 нм максимальный пик флуоресцентной эмиссии красново смещался с 473 до 519 нм, а флуоресцентная интенсивность резко снижалась [30]. Как показано на рис. 1D, UV-вис спектры CQD характеризовались сильным пиком поглощения в диапазоне длин волн 400–490 нм. CQDs демонстрировали две характерные пики поглощения при 280 и 420 нм, которые относились к π–π* (ароматические C=C) и n–π* (карбоксильные и/или C–N) переходам соответственно [31, 32]. Следовательно, эти оптические свойства CQDs обеспечивали возможность одновременной биологической визуализации и фотодинамической инактивации.

Биовизуализация и цитотоксичность CQDs

Для оценки способности CQDs к биовизуализации и маркировке клеток, ин витро клеточная визуализация с использованием CQDs исследовалась на клетках HeLa с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM). Клетки HeLa инкубировали с 200 мкг/мл CQDs в течение 6 ч, а затем подготавливали для детекции CLSM. В результате клетки HeLa показали яркую желтую флуоресценцию, равномерно распределенную по всей клетке (рис. 3A). Более важно, следует отметить, что низкая концентрация CQDs 200 мкг/мл была достаточной для маркировки клеток HeLa желтой флуоресценцией, что дополнительно подтвердило возможность CQDs в клеточной визуализации. Как сообщалось, углеродные наночастицы всегда демонстрировали сильную эмиссию только в области синего света, в то время как длинноволновые эмиссии обычно были слабыми. Под УФ возбуждением биологические ткани часто показывали синюю автофлуоресценцию и были уязвимы к получению фотоповреждений, что серьезно препятствует применениям биологической визуализации углеродных наночастиц с коротковолновыми эмиссиями [33]. Поэтому разработка углеродных наночастиц с длинноволновыми эмиссиями широко интересовала. В данном исследовании приготовленные CQDs показывали яркую желтую флуоресценцию под возбуждением света 400–450 нм. Возбужденная желтая флуоресценция тем самым может позволить CQDs использоваться для обнаружения глубоко расположенных опухолей. Однако все еще долгий путь до практических применений в человеческой онкологической визуализации.

Помимо люминесцентных характеристик, высокая биосовместимость и низкая токсичность всегда требуются, если CQDs предназначены для разработки как потенциальный биомаркирующий реагент. Для биомедицинских применений материалы должны быть высокобиосовместимыми на рекомендованных дозах. Для изучения цитотоксичности клетки HeLa обрабатывали CQDs в конечных концентрациях от 0 до 400 мкг/мл в течение 24 ч. Как показано на рис. 3B, более 95% клеток выжили, определенное тестами МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиевый бромид), что выявило, что CQDs практически нетоксичны.

Эти данные указывают на то, что вновь сгенерированные CQDs с возбужденной желтой флуоресценцией имеют низкую цитотоксичность и высокую биосовместимость, что способствует их перспективной перспективе биологической визуализации.

Эффективность фотодинамической терапии

Инактивация раковых клеток

Как показано на рис. 3C, жизнеспособность не отличалась между клетками HeLa, обработанными CQDs или только синим светом. Одновременная обработка CQDs и синим светом заметно снизила жизнеспособность клеток HeLa в зависимости от длительности фотовоздействия. После облучения 460 нм на 15 мин, CQDs демонстрировали замечательную противоопухолевую активность; жизнеспособность клеток HeLa снизилась примерно на 40% при концентрации 200 мкг/мл. Для дальнейшего обнаружения эффектов возбужденных CQDs, тесты МТТ были реализованы для оценки полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC50) возбужденных CQDs на клетках HeLa. В результате IC50 CQDs после возбуждения на клетках HeLa составил около 427,5 мкг/мл (95% ДИ 366,7–498,7 мкг/мл) после 10-минутного облучения и был примерно 255,1 мкг/мл (95% ДИ 220,9–249,8 мкг/мл) после воздействия синего света на 15 мин.

Эти результаты указывали на то, что возбужденные CQDs могут эффективно убивать опухолевые клетки как некоторые клинические противопухолевые препараты, такие как Фотофрин [34], что подсказало перспективную ценность CQDs в визуализационно-направленной противоопуховой терапии.

Генерация ROS CQDs

Во время PDT раковые клетки могут быть убиты цитотоксическими ROS, генерируемыми эндоцитированным фотосенсибизатором под подходящими условиями облучения [35, 36]. ROS могут инактивировать целевые клетки апоптозом или некрозом с малыми побочными эффектами через PDT в нескольких заболеваниях [37–40]. Инспекция рис. 4A показала, что реагент ROS излучает красную флуоресценцию, указывающую на генерацию ROS. Более того, красный сигнал ROS хорошо перекрывался с флуоресценцией CQDs, что означает, что генерация ROS тесно ассоциирована с поглощением CQDs опухолевыми клетками. Как показано на рис. 4B, по сравнению с контролем и группами без лазерного облучения, экспериментальные группы под 460 нм лазерным облучением на 15 мин показывали очевидную генерацию ROS. Наши результаты указывали на то, что CQDs могли значительно способствовать производству внутриклеточных ROS под облучением 460 нм лазером и имели большой потенциал для применения в PDT. В принципе, CQDs могут быть возбуждены из основного состояния (S0 на рис. 4C) в возбужденное состояние (Sn на рис. 4C), и эффективность этого процесса определяется интенсивностью источника света и коэффициентом затухания. После растворителем-опосредованной релаксации CQDs остаются на низком вибрационном уровне первого синглетного возбужденного состояния. Из-за быстрой вибрационной релаксации после возбуждения, энергия фотона, излученного из первого синглетного возбужденного состояния (S1 на рис. 4C), ниже энергии фотона возбуждения, приводя к увеличению длины волны. Флуоресцентная визуализация использует переход CQDs из S0 в Sn в S1 [41]. CQDs были поглощены клетками опухоли HeLa и излучали флуоресценцию при освещении подходящим источником длины волны, тем самым позволяя клеткам быть маркированными. S1 может вернуться в состояние S0 флуоресценцией или межсистемным переходом в не-флуоресцентное триплетное возбужденное состояние (T1 на рис. 4C) [7, 42]. Флуоресцентная группа T1 особенно активна в реакциях электронного переноса, генерируя супероксидные свободные радикалы и в конечном счете приводя к деградации флуоресцентной группы. Энергия от T1, перенесенная к молекулярному кислороду, произвела возбужденный синглетный окислительный агент, более сильный, чем основной молекулярный кислород. Супероксидные радикалы и синглетный кислород, а также другие ROS, включая OH и H₂O₂, реагируют с близкими биологическими молекулами для реализации фотокситочности, приводя к смерти клетки. После поглощения CQDs клетками HeLa, освещение привело к переносу синглетного состояния в триплетное через межсистемный переход, и процесс переноса энергии произвел ROS и в конечном счете привел к смерти клетки. Под подходящим источником длины волны CQDs претерпевают два типа переноса энергии. Флуоресценция излучалась для маркировки опухолевых клеток HeLa, и клетки HeLa убивались ROS. Наши экспериментальные данные выявили хорошую биосовместимость вновь произведенных CQDs в темноте и эффективность убийства опухолей под световыми условиями. Следовательно, CQDs могут использоваться как фотосенсибизатор для опухолевых клеток и тканей.

Кроме того, это все еще нерешенная проблема, как CQDs могут точно нацеливаться на опухоль и убивать опухолевые клетки более эффективно. Существующее изобилие поверхностных функциональных гидрофильных групп (карбоксильных, карбонильных, эпоксидных, гидроксильных, гидроксильных и т.д.) позволяет углеродным точкам конъюгироваться с специфическими антителами, которые могут точно нацеливаться на опухоли, и это требует, чтобы опухоль имела специфические биомаркеры. Одновременно углеродные точки также могут служить инструментом для доставки лекарств и генов благодаря их высокому соотношению площади поверхности к объему [43]. Учитывая отличную биосовместимость, малый размер для интернализации опухолевыми клетками, богатость поверхностными функциональными группами и потенциал биовизуализации, углеродные точки (включая CQDs) считаются перспективными тераностическими кандидатами для терапии опухолей. Однако все еще существуют проблемы и множество нерешенных вопросов для применений углеродных точек в наномедицине и биовизуализации. Больше усилий должно быть принято для продвижения перевода наномедицины, связанной с углеродными точками, от лаборатории к постели больного в будущем.

Заключение

В резюме, мы синтезировали фотолюминесцентные CQDs, используя o-фенилендиамин плазменным методом. Возбужденные синим лазером, CQDs с диаметром около 3,2 нм излучали желтую флуоресценцию. Рамановская, UV-вис, ФТИР и XPS результаты показали, что больше атомов углерода участвовали в sp² гибридизации, формируя новую органическую группу. CQDs, синтезированные плазменным методом, доказали быть эффективным зондом в экспериментах клеточной визуализации, и желтая флуоресценция, излучаемая CQDs, может четко маркировать клетки HeLa. Кроме того, синтезированные CQDs показали благоприятную растворимость, нетоксичность и высокую биосовместимость, что могло ускорить их способность к биообразованию. Кроме того, возбужденные CQDs могли эффективно убивать клетки HeLa генерацией ROS, что четко демонстрировало удовлетворительную фотодинамическую цитотоксичность CQDs ин витро и подтвердило их применения в PDT.

Экспериментальные методы

Синтез углеродных квантовых точек

Система микроплазменной обработки суммирована в Дополнительном файле 1: Рисунок S1. Полый нержавеющий трубка с внутренним диаметром 180 мкм была подключена к источнику высокого напряжения постоянного тока (Tianjin Dongwen High-Voltage Supply Co., Ltd., Тяньцзинь, Китай) и удерживалась на 2 мм над поверхностью раствора. Pt-электрод (DJS-1; Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd., Шанхай, Китай) был подключен к катоду источника питания и погружен в раствор. Затем 400 мг o-фенилендиамина (Шанхай, Китай) растворяли в 40 мл деионизированной воды, и 20 мл раствора o-фенилендиамина добавляли в Петриеву чашку и перемешивали с магнитным перемешивателем. Во время микроплазменной обработки аргон (Ar) газ тече через трубку со скоростью 60 ссм, и постоянный ток держали на 17 мА. После 10 мин плазменной обработки коричнево-черный продукт диализировали с использованием диализирующей мембраны (молекулярный весовой отсев, 500 Да) против 2 л деионизированной воды в течение 12 ч и последующе фильтровали через 0,22 мкм ультрафильтровальную мембрану. Наконец, чистые CQDs получали методом сухой лиофилизации.

Характеризация структуры, состава и оптических свойств CQDs

Размер и морфология CQDs характеризовались TEM с использованием системы JEM-2100F (JEOL, Токио, Япония). Флуоресцентная спектроскопия выполнялась с использованием спектрометра люминесценции Perkin Elmer LS 55 (Waltham, MA, США). UV/Вис спектры поглощения измерялись с использование спектрофотометра Varian Cary 50 UV–VIS (Palo Alto, CA, США). ФТИР спектры получались с использованием спектроскопа Nicolet 6700 (Thermo Scientific, Waltham, MA, США), и Рамановская спектроскопия выполнялась с использованием 800 UV микро-Рамановского спектрометра (Invia-reflex, UK). XPS эксперименты выполнялись с использованием системы Axis Ultra DLD (Shimadzu/Kratos Analytical Ltd., Киото, Япония).

Клеточная культура и тест цитотоксичности

Клетки HeLa (ATCC, Манассас, VA, США) культивировали в модифицированном среднем Эйгла Дюльбекко (DMEM), содержащем 10% ФСК и 1% пенициллин-стрептомицин при 37 °C в увлажненной атмосфере 5% CO₂. Для исследований цитотоксичности CQDs клетки считали и посевали в 96-колончатых пластинках, содержащих 200 мкл полной среды при плотности 6000 клеток на колодку. После 24 ч культуры клетки инкубировали с CQDs в концентрациях 0, 25, 50, 100, 200 и 400 мкг/мл на еще 24 ч, а затем жизнеспособность клеток определяли с использованием тестов МТТ для оценки цитотоксичности CQDs. Кратко, эти растворы заменяли на 100 мкл тестового раствора МТТ (0,5 мг/мл) и инкубировали 4 ч в инкубаторе в темноте. Супернатант удаляли, и кристаллы растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO). Наконец, абсорбция каждой колодки измерялась при 490 нм. Оптическая плотность связывалась с жизнеспособностью клеток, предполагая 100% жизнеспособность для контрольного образца без CQDs.

Тест МТТ также использовался для оценки IC50 возбужденных CQDs на клетках HeLa. Кратко, клетки HeLa в 96-колончатых пластинках инкубировали с CQDs в концентрациях 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200 и 6400 мкг/мл в течение 24 ч в инкубаторе, обрабатывали светом 460 нм на 10 мин или 15 мин раздельно, а затем культивировали еще 24 ч. Жизнеспособность клеток каждой колодки определялась тестом МТТ, и данные использовались для оценки IC50.

Клеточная визуализация

Клетки в концентрации 2 × 10⁴ мл⁻¹ посевали в конфокальную чашку (диаметр = 15 мм), культивировали 24 ч и промывали ПБС дважды для обеспечения отсутствия мертвых клеток. Раствор CQDs (200 мкг/мл; pH 7) добавляли, и клетки инкубировали 6 ч. Клетки затем промывали ПБС трижды для удаления несвязанных CQDs и фиксировали 4% параформальдегидом. Затем образцы наблюдали с использованием CLSM (LSM510, Zeiss, Германия) с возбуждением длинами волн от 400 до 450 нм.

Фотодинамическая терапия и измерение ROS

Для исследования противоопухолевых эффектов клетки HeLa инкубировали с 200 мкг/мл CQDs в течение 24 ч при 37 °C в темноте и обрабатывали светом 460 нм (30 мВт/см²) на 5, 10 и 15 мин. После 24 ч инкубации выполняли стандартный тест МТТ для определения относительной жизнеспособности клеток. Внутриклеточная генерация ROS детектировалась химически с использованием спектрофотометрического метода с набором Fluorometric Intracellular Ros Assay Kit (sigma, США). Клетки культивировали в конфокальной чашке (диаметр = 15 мм) ночью для адгезии клеток. Затем клетки инкубировали с 200 мкг/мл CQDs на 4 ч. Затем 100 мкл/колодка Master Reaction Mix добавляли. После инкубации на 1 ч клетки фиксировали 4% параформальдегидом на 10 мин, и флуоресцентные изображения клеток наблюдали CLSM. Для детекции производства ROS клетки культивировали в 96-колончатых пластинках с 200 мкл культурной среды. После 24 ч инкубации среда заменяли на 100 мкл раствора CQDs в концентрациях 0, 100, 200 мкг/мл, и клетки инкубировали еще 4 ч. Затем образцы промывали трижды ПБС, облучали на 15 мин или нет, и инкубировали с 100 мкл/колодка Master Reaction Mix на 1 ч. Наконец, интенсивность флуоресценции детектировалась с использованием флуоресцентного считывателя (возбуждение 520 нм, эмиссия 605 нм).

Статистические анализы

Эксперименты, участвовавшие в этом исследовании, повторялись три раза, и статистические анализы выполнялись с использованием SPSS19.0. Различия между двумя группами сравнивали с использованием теста Манна-Уитни U. IC50 возбужденных CQDs на клетках HeLa оценивали с использованием нелинейной регрессии. P < 0,05 считалось статистически значимым.

Доступность данных и материалов

Все данные и материалы текущего исследования доступны от соответствующего автора по разумному запросу.

Аббревиатуры

PDT:

Фотодинамическая терапия

ROS:

Реактивные формы кислорода

CQDs:

Углеродные квантовые точки

TEM:

Проходная электронная микроскопия

CLSM:

Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп

DMEM:

Модифицированное среднее Эйгла Дюльбекко

MTT:

3-(4,5-диметилтиазолил-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиевый бромид

DMSO:

Диметилсульфоксид

IC50:

Полумаксимальная ингибирующая концентрация