Мицеллы Si QD, связанные с CKAP4: новый таргетированный образовательный агент для рака легких

Аннотация

В настоящее время различные флуоресцентные наноматериалы проектируются и синтезируются как оптические контрастные агенты для хирургической навигации. Однако нет отчетов о подготовке флуоресцентных контрастных агентов для навигации при операции рака легких с использованием кремниевых квантовых точек (Si QD). В данном исследовании улучшены и модифицированы водорастворимые мицеллы Si QD, сообщенные Pi et al., для приготовления мицелл Si QD-CKAP4. Данные показали, что мицеллы Si QD-CKAP4 — сферические частицы со средним гидродинамическим диаметром ~78,8 нм. УФ-видимое поглощение мицелл Si QD-CKAP4 находится в диапазоне 200–500 нм. При длине волны возбуждения 330 нм в спектрах флуоресцентной эмиссии наблюдается сильная флуоресценция при 640 нм. Лазерная конфокальная и флуоресцентная микроскопия показали, что мицеллы Si QD-CKAP4 демонстрируют хорошую таргетирующую способность к клеткам и тканям рака легких in vitro. In vivo флуоресцентное изображения показало, что мицеллы Si QD-CKAP4 метаболизируются печенью и экскретируются почками. Кроме того, мицеллы Si QD-CKAP4 специфически таргетируют ткань рака легких in vivo по сравнению со здоровой тканью легких. Цитотоксичность и гистохимическое окрашивание гемоксилином и эозином (H&E) показали, что мицеллы Si QD-CKAP4 обладают высокой биобезопасностью in vitro и in vivo. Мицеллы Si QD-CKAP4 — специфический таргетированный образовательный агент для рака легких и ожидаются флуоресцентным контрастным агентом для навигации при операции рака легких в будущем.

Введение

Рак — одно из основных заболеваний, угрожающих здоровью человечества во всем мире [1]. Среди них заболеваемость и смертность от рака легких занимают первое место среди всех злокачественных опухолей и показывают растущую тенденцию ежегодно [2]. Хирургическая резекция — основное лечение солидных опухолей. Однако методы дифференциации злокачественной ткани от здоровой в основном ограничиваются тактильными и визуальными сигналами и опытом хирурга [3].

В последние годы флуоресцентно-направленная хирургия стала популярной в исследовательской сфере для реальной внутриоперационной навигации при ресекции опухолей [4]. С помощью флуоресцентного контрастного агента и флуоресцентной системы визуализации хирурги могут использовать навигацию в реальном времени для ресекции первичных опухолей и выявления остаточных опухолей в операционной полости. По сравнению с традиционными биомедицинскими методами визуализации, флуоресцентная система предлагает преимущества: отсутствие ионизирующего излучения и высокое пространственное разрешение [3, 5, 6].

В настоящее время исследователи сообщали о различных флуоресцентных наноматериалах для биологической визуализации [7, 8]. Среди них кремниевые квантовые точки (Si QD) стали популярны в области биологической визуализации [9-11]. Однако нет отчетов о подготовке флуоресцентных контрастных агентов для навигации при операции рака легких с использованием Si QD.

В 2014 г. Pi et al. сообщили метод синтеза новых водорастворимых мицелл Si QD [12]. Данные показали преимущества мицелл Si QD: контролируемый размер, высокая квантовая выход флуоресценции, отличная световая стабильность [12]. Данное исследование направлено на улучшение и модификацию водорастворимых мицелл Si QD, сообщенных Pi et al., для приготовления нового флуоресцентного контрастного агента, который ожидается использовать для навигации при операции рака легких в будущем.

В 2018 г. Yanagita et al. сообщили, что CKAP4 высоко экспрессируется в сыворотке и тканях рака легких пациентов и может использоваться как новый биомаркер для ранней диагностики рака легких [13]. Следовательно, анти-CKAP4 антитела-конъюгированные мицеллы Si QD могут быть новым флуоресцентным контрастным агентом для навигации при операции рака легких.

В данном исследовании DSPE-PEG-COOH использовался для приготовления мицелл Si QD с карбоксильными группами на поверхности. Затем антитело CKAP4 конъюгировали с мицеллами Si QD с использованием EDC. Результаты показали, что мицеллы Si QD-CKAP4 хорошо диспергируются в водном растворе. Под УФ облучением 365 нм мицеллы Si QD-CKAP4 излучают сильную красную флуоресценцию. Благодаря конъюгации антитела, мицеллы Si QD-CKAP4 показывают хорошую таргетирующую способность к клеткам и тканям рака легких как in vitro, так и in vivo. Кроме того, мицеллы Si QD-CKAP4 демонстрируют высокую биобезопасность in vitro и in vivo. В данном исследовании приготовлен потенциальный флуоресцентный контрастный агент для навигации при операции рака легких.

Методы

Реактивы

Бovine serum albumin (BSA) — Sigma (≥98%; Missouri, USA); тетрагидрофуран (THF) — Adamas-beta (99,9%; Basel, Switzerland); DSPE-PEG-COOH — Aladdin (Shanghai, China); антитело CKAP4 — Abcam (0,55 мг/мл; Cambridge, UK); DMEM и PBS — Hyclone (Utah, USA); fetal bovine serum (FBS) и трипсин — Gibco (New York, USA); параформальдегид (4%), буфер проницаемости для иммуноокраски с Triton X-100 и блокирующий буфер — Beyotime (Shanghai, China); глицерин — Solarbio (≥99%; Beijing, China); трипсин — Kingmorn (0,25%; Shanghai, China).

Приборы

ТЭМ — JEM-2100F (JEOL, Tokyo, Japan). Гидродинамический диаметр — JEM Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, UK). УФ-Vis абсорбция — Cary 50 (Varian, Palo Alto, CA, USA). Флуоресцентная эмиссия — F-182 4500 (Hitachi Ltd., Tokyo, Japan). XPS — RBD-upgraded PHI-5000C ESCA (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). PL квантовые выходы (QY) — FLS1000 (Edinburgh Instruments, Livingston, England). FTIR — Thermo IS50 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA). XRD — SmartLab (Rigaku Corporation, Tokyo, Japan).

Клетки

Клеточные линии A549 и 293T приобретены в Шанхайском институте клеточной биологии (Shanghai, China).

Приготовление мицелл Si QD

Сначала додецил-Si QD приготовили гидросилиляцией и растворили в THF для получения раствора додецил-Si QD (15 мг/мл) по ранее сообщенному методу [12]. Затем 20 мг DSPE-PEG-COOH растворили и смешали в 10 мл деионизированной воды для получения раствора DSPE-PEG-COOH (2 мг/мл, 10 мл). Последовательно раствор додецил-Si QD (15 мг/мл, 66 мкл) капельно добавляли к 10 мл раствора DSPE-PEG-COOH. После ультразвуковой агитации 3 мин получали прозрачный раствор. Раствор помещали в вытяжку и мешали 12 ч в темноте. Затем диализировали 24 ч и лиофилизировали 3 дня для получения мицелл Si QD.

Приготовление мицелл Si QD-CKAP4

Антитело CKAP4 конъюгировали с мицеллами Si QD активацией карбоксильной группы EDC [14]. Метод: 4 мг мицелл Si QD диспергировали в 900 мкл PBS. EDC (10 мг) растворили в 100 мкл PBS. 100 мкл EDC раствора медленно добавляли к 900 мкл мицелл Si QD с ультразвуковой агитацией 5 мин. Затем 20 мкл антитела CKAP4 медленно добавляли, смесь мешали 2 ч при комнатной температуре в темноте. Продукт ультрафильтровали при 4000 об/мин 15 мин. После трехкратного промывания PBS продукт называли мицеллы Si QD-CKAP4.

Цитотоксичность

Трипановый синий использовался для тестирования биобезопасности наноматериалов [15]. Клетки A549 и 293T инкубировали в 24-колбовых пластинках (1×10⁶/колба) при 37 °C 12 ч. После удаления среды добавляли серию концентраций мицелл Si QD или Si QD-CKAP4 (концентрация Si: 0–152 мкг/мл) и инкубировали 37 °C 2 ч. После удаления среды клетки собирали, промывали PBS дважды. Трипановый синий смешивали с суспензией клеток 1:1. Число живых и мертвых клеток подсчитывали Countstar. Выживаемость (%) = живые/(живые+мертвые)×100. Три биологических репликата. Статистический анализ — Prism 7.01 (GraphPad). Двухфакторный ANOVA с пост-тестом Даннета. Значимость P < 0,05. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.

Таргетирование наноматериалов к клеткам рака легких In Vitro

Таргетирующая способность мицелл Si QD и Si QD-CKAP4 к клеткам рака легких in vitro определялась так: A549 инкубировали в конфокальных блюдцах (3×10⁵ клеток/блюдце) 37 °C 12 ч. После удаления среды клетки промывали PBS трижды. Добавляли 1 мл параформальдегида (4%) на 10 мин при 25 °C. После удаления параформальдегида промывали PBS трижды. Добавляли 1 мл буфера проницаемости с Triton X-100 на 10 мин при 25 °C. После удаления промывали PBS трижды. Добавляли 1 мл блокирующего буфера на 10 мин при 25 °C. После удаления промывали PBS трижды. Затем 200 мкл мицелл Si QD или Si QD-CKAP4 (Si 150 мкг/мл) добавляли к клеткам на 2 ч при 37 °C. После удаления наноматериалов промывали PBS трижды. Фотографировали лазерным конфокальным микроскопом (Leica, Wetzlar, Germany). Длина волны возбуждения 405 нм, эмиссии 630 нм.

Таргетирующая способность к нормальным клеткам in vitro: 293T клетки собирали в 1,5 мл эппендорфов (1×10⁶ клеток/трубка). Центрифугировали 1000 об/мин 5 мин, удаляли супернатант. Добавляли 1 мл параформальдегида (4%) на 10 мин при комнатной температуре. Центрифугировали, удаляли супернатант, промывали PBS трижды. Добавляли 1 мл буфера проницаемости с Triton X-100 на 10 мин при 25 °C. Центрифугировали, удаляли супернатант, промывали PBS трижды. Добавляли 1 мл блокирующего буфера на 10 мин при 25 °C. Центрифугировали, удаляли супернатант, промывали PBS трижды. Затем 200 мкл мицелл Si QD или Si QD-CKAP4 (Si 150 мкг/мл) добавляли на 2 ч при 37 °C. Центрифугировали 1000 об/мин 5 мин, удаляли супернатант, осадок промывали PBS трижды. Клетки собирали, готовили стекла для микроскопии. Микроскопия лазерным конфокальным микроскопом. Возбуждение 405 нм, эмиссия 630 нм.

Три независимых эксперимента. Количественный анализ средней флуоресцентной интенсивности — ImageJ (Bethesda, MD, USA). Статистика — Prism 7.01. Одномерный ANOVA с пост-тестом Даннета. Значимость P < 0,05. ***P < 0,001.

Модель мышей с опухолями

10 самцов голых мышей (5–6 недель) приобретены у Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China). Все мыши содержались в SPF условиях в Центре экспериментальных животных Tongji University (Shanghai, China). Для модели мыши с опухолью подкожно инъекцировали 1×10⁶ клеток A549. Мышей использовали когда диаметр опухоли достиг 6 мм. Все эксперименты с мышами проводились согласно институциональным руководящим принципам и одобрены Комитетом по использованию и уходу за животными Tongji University.

Таргетирование Si QD мицелл-CKAP4 к тканям рака легких In Vitro

Мышей с опухолями усыпляли под анестезией. Опухоль и нормальная ткань легких собирали для парафиновых срезов. После дегидратации, извлечения антигенов и сывороточного блокирования, добавляли мицеллы Si QD или Si QD-CKAP4 (Si 150 мкг/мл) к тканям на 2 ч при 37 °C. После удаления наноматериалов ткани промывали PBS трижды. Окрашивали DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндол) 10 мин. После трехкратного промывания PBS добавляли антифэйд среду на 5 мин при 25 °C. После удаления промывали PBS трижды. Фотографировали флуоресцентным микроскопом (Nikon, Tokyo, Japan) с длиной волны возбуждения 405 нм и эмиссии 630 нм. Три независимых эксперимента. Количественный анализ средней красной флуоресцентной интенсивности — ImageJ. Статистика — Prism 7.01. Одномерный ANOVA с пост-тестом Даннета. Значимость P < 0,05. ***P < 0,001.

Флуоресцентное изображения In Vivo

9 мышей с опухолями разделили на три группы (инъекция Si QD-CKAP4, инъекция Si QD мицелл, инъекция физраствора). Группа Si QD-CKAP4: внутривенно 200 мкл Si QD-CKAP4 (Si: 4 мг/кг). Группа Si QD мицелл: 200 мкл Si QD мицелл (Si: 4 мг/кг). Группа физраствор: 200 мкл физраствора. Флуоресцентные изображения снимали в разные временные точки (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 ч). Значимых флуоресцентных сигналов в тканях рака легких среди всех мышей трех групп не наблюдалось (данные не показаны). Это может быть связано с слабым проникновением флуоресценции мицелл Si QD-CKAP4 и Si QD.

Мышей группы Si QD-CKAP4 усыпляли и утилизировали в 4 ч для детекции флуоресцентного сигнала в сердце, печени, селезенке, легких, почке и опухоли. Данные показали значительный флуоресцентный сигнал в печени, почке и тканях опухоли. В сердце, селезенке или здоровой ткани легких значимого сигнала не было (Рис. 6). Сигнал в печени и почке указывает на метаболизацию печенью и экскрецию почками. Флуоресцентный сигнал в тканях опухоли A549 значительно выше, чем в здоровой ткани легких. Это подтверждает таргетирующую способность мицелл Si QD-CKAP4 к тканям рака легких. Результаты показывают, что мицеллы Si QD-CKAP4 специфически таргетируют ткань рака легких, что ожидается флуоресцентным контрастным агентом для навигации при операции рака легких в будущем.

a Яркая фотография сердца, печени, селезенки, легких, почки и опухоли мышей с инъекцией Si QD-CKAP4. b Флуоресцентная фотография тех же органов. c Относительные флуоресцентные интенсивности (n=3; mean±SD; однофакторный ANOVA с пост-тестом Даннета; *P<0,05; **P<0,01)

Оценка биобезопасности Si QD мицелл-CKAP4 In Vivo

Исследуемая острая токсичность мицелл Si QD-CKAP4 in vivo. 12 мышей с опухолями внутривенно инъекцировали физраствора (200 мкл), мицелл Si QD (Si: 4 мг/кг, 200 мкл) или мицелл Si QD-CKAP4 (Si: 4 мг/кг, 200 мкл), через 24 ч утилизировали. H&E окрашивание сердца, печени, селезенки, легких, почек показано на Рис. 7. По сравнению с мышами, получившими физраствор, в основных органах мышей с мицеллами Si QD и Si QD-CKAP4 не наблюдалось явных патологических изменений. Данные указывают, что мицеллы Si QD (Si: 4 мг/кг) и мицеллы Si QD-CKAP4 (Si: 4 мг/кг) не показывают значительной токсичности in vivo.

H&E окрашивание сердца, печени, селезенки, легких, почек мышей с опухолями, инъецированных физраствором, мицеллами Si QD (Si: 4 мг/кг) и мицеллами Si QD-CKAP4 (Si: 4 мг/кг) через 24 ч (увеличение 200×)

Результаты

Приготовление и характеристика мицелл Si QD

Сначала додецил-Si QD приготовили гидросилиляцией по опубликованному отчету (Схема 1, Шаг 1) [12]. Аналогично данным, додецил-Si QD нашей группы хорошо диспергировались в метилбензене [12]. ТЭМ показал, что додецил-Si QD сферические с относительно однородными размерами. Диаметр измерен ImageJ: 4,1–5,3 нм, средний ~4,7 нм (Рис. 1a). На увеличенных изображениях видны явные решеточные фрижи (Рис. 1a). Расстояние между фрижами измерено ImageJ: среднее ~0,35 нм, почти как у ранее сообщенных додецил-Si QD (0,34 нм) — хорошая кристалличность [12]. Динамическое рассеяние света (DLS) показало гидродинамические диаметры 4,8–13,5 нм, средний 6,5 нм (Рис. 1b).

Схема приготовления мицелл Si QD-CKAP4 и таргетированной биологической визуализации в тканях рака легких

a ТЭМ додецил-Si QD; b распределение гидродиаметра додецил-Si QD; c ТЭМ мицелл Si QD; d распределение гидродиаметра мицелл Si QD; e ТЭМ мицелл Si QD-CKAP4; f распределение гидродиаметра мицелл Si QD-CKAP4; g C1s XPS спектры мицелл Si QD; h C1s XPS спектры мицелл Si QD-CKAP4

Для приготовления водорастворимых мицелл Si QD додецил-Si QD модифицировали самосборкой DSPE-PEG-COOH (Схема 1, Шаг 2) [12]. Здесь DSPE-PEG-COOH использовался вместо F127 для получения мицелл Si QD с карбоксильными группами на поверхности. Результаты: мицеллы Si QD хорошо диспергировались в воде. ТЭМ: сферические частицы с вставленными Si QD. Диаметр 22,7–54,6 нм, средний ~34,3 нм (Рис. 1c). DLS: гидродинамические диаметры 43,8–615,9 нм, средний 58,7 нм (Рис. 1d). Средний дзета-потенциал ~−20,7 мВ. FTIR (Доп. файл 1: Рис. S1A): пики растяжения N–H, C–H, O–H, C=O при 3430, 2920, 2850, 1640 см⁻¹; изгибание C–H, O–H при 1460, 1400 см⁻¹; растяжение Si–C, C–O, P–O–C при 1250, 1100, 951 см⁻¹; изгибание Si–H, O=C–N при 850, 526 см⁻¹. Характерные группы DSPE-PEG-COOH (N–H, O–H, C=O, C–O, P–O–C, O=C–N) и додецил-Si QD (Si–C, Si–H) найдены в FTIR мицелл Si QD — успешная инкапсуляция. XRD (Доп. файл 1: Рис. S1B): острая дифракционная пика — хорошая кристалличность. Пики при 2θ 27,073, 28,451, 56,598, 73,145 соответствуют (100), (002), (112), (203) кремния (PDF #80-0005) — Si QD успешно инкапсулированы. Пики при 31,692, 45,431, 66,200, 75,260, 83,955 — (200), (220), (400), (420), (422) NaCl (PDF #77-2064). Наличие NaCl объясняется растворением мицелл Si QD в PBS после приготовления.

УФ-Vis абсорбция (Рис. 2a): поглощение мицелл Si QD 200–500 нм. При возбуждении 330 нм сильная флуоресценция при 650 нм (Рис. 2b). Водный раствор мицелл Si QD (Si 80 мкг/мл) прозрачен в естественном свете, но излучает сильную красную флуоресценцию под УФ 365 нм (Рис. 2c). Абсолютный PL QY измерен FLS1000 при возбуждении 365 нм: ~14,49%.

a УФ-Vis абсорбция мицелл Si QD и Si QD-CKAP4; b флуоресцентная эмиссия мицелл Si QD и Si QD-CKAP4; c изображения в естественном свете (лево) и под УФ 365 нм (право)

Приготовление и характеристика мицелл Si QD-CKAP4

Антитело CKAP4 конъюгировали с мицеллами Si QD через EDC (Схема 1, Шаг 3) [14]. ТЭМ: сферические частицы с вставленными Si QD. Диаметр 24,4–67,7 нм, средний ~35,5 нм (Рис. 1e). DLS: гидродинамические диаметры 58,7–824,9 нм, средний 78,8 нм (Рис. 1f) — немного больше мицелл Si QD из-за конъюгации антитела. C1s XPS (Рис. 1g): шесть типов углерода: C(O)O (288,81 эВ), C=O (286,5 эВ), C–O (285,76 эВ), C–N (285,25 эВ), C–C (284,88 эВ), C–H (284,34 эВ). Пик C(O)O почти исчез в XPS мицелл Si QD-CKAP4 (Рис. 1h) — успешная конъюгация карбоксильных групп с первичными аминами, антитело CKAP4 успешно конъюгировано. Средний дзета-потенциал ~−10,7 мВ, выше чем у мицелл Si QD. Объяснение: на поверхности мицелл Si QD много карбоксильных групп — сильная отрицательная заряд. Конъюгация CKAP4 уменьшила карбоксильные группы на поверхности, дзета-потенциал увеличился.

УФ-Vis абсорбция мицелл Si QD-CKAP4 200–500 нм, аналогично мицеллам Si QD (Рис. 2a). При возбуждении 330 нм сильная флуоресценция при 640 нм (Рис. 2b). Конъюгация антитела не существенно влияет на флуоресцентные свойства. Раствор мицелл Si QD-CKAP4 (Si 80 мкг/мл) прозрачен в естественном свете, под УФ 365 нм излучает сильную красную флуоресценцию (Рис. 2c). PL QY: абсолютный PL QY мицелл Si QD-CKAP4 ~16,96%.

Цитотоксичность мицелл Si QD-CKAP4 In Vitro

Клеточные линии A549 (рак легких) и 293T (почечные эпителиальные) использованы для исследования биобезопасности мицелл Si QD и Si QD-CKAP4. Разные концентрации (Si 0, 2,375, 4,75, 9,5, 19, 38, 76, 152 мкг/мл) инкубировали с A549 или 293T при 37 °C 2 ч. Выживаемость определена трипановым синим (Рис. 3) [15]. ID50 получен GraphPad. ID50 мицелл Si QD >152 мкг/мл для A549 и 293T. ID50 мицелл Si QD-CKAP4: 25,94 мкг/мл для A549, 72,69 мкг/мл для 293T. Цитотоксичность мицелл Si QD-CKAP4 значительно выше мицелл Si QD, и в A549 выше чем в 293T. Это может быть комплемент-зависимой цитотоксичностью [17]. Мицеллы Si QD-CKAP4 показывают высокую биобезопасность в нормальных клетках по сравнению с клетками рака легких, закладывая основу для in vivo применения.

Выживаемость A549 a и 293T b при инкубации с разными концентрациями мицелл Si QD и Si QD-CKAP4 (Si 0–152 мкг/мл) 2 ч (n=3; mean±SD; двухфакторный ANOVA с пост-тестом Даннета; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001)

Таргетирование мицелл Si QD-CKAP4 к клеткам рака легких In Vitro

Для изучения таргетирующей функции мицелл Si QD-CKAP4 in vitro использовали A549 и 293T. Мицеллы Si QD и Si QD-CKAP4 инкубировали с A549 и 293T при 37 °C 2 ч. Таргетирующий эффект детектировали лазерной конфокальной микроскопией (Рис. 4). Результаты: красная флуоресценция в A549 с мицеллами Si QD-CKAP4 значительно выше, чем в группах Si QD-CKAP4+293T, Si QD+A549, Si QD+293T. Мицеллы Si QD-CKAP4 специфически таргетируют A549 in vitro.

Детекция способности мицелл Si QD-CKAP4 таргетировать A549 in vitro. a A549 и 293T инкубированы с мицеллами Si QD-CKAP4 и Si QD (Si 150 мкг/мл) 37 °C 2 ч. После удаления супернатанта и двух промывок клетки сфотографированы конфокальным лазерным микроскопом (Bar, 25 мкм). b Количественный анализ средней флуоресцентной интенсивности ImageJ (n=3; mean±SD; однофакторный ANOVA с пост-тестом Даннета; ***P<0,001)

Таргетирование мицелл Si QD-CKAP4 к тканям рака легких In Vitro

Для исследования таргетирования тканей рака легких, A549 клетки инокулировали подкожно мышам. После образования опухоли собирали ткани опухоли A549 и нормальные ткани легких, инкубировали с мицеллами Si QD и Si QD-CKAP4 при 37 °C 2 ч. Таргетирующий эффект детектировали лазерной конфокальной микроскопией (Рис. 5). Результаты: ткань опухоли A549 с мицеллами Si QD-CKAP4 излучает сильную красную флуоресценцию при возбуждении 405 нм. В тканях опухоли с мицеллами Si QD, нормальных легких с мицеллами Si QD-CKAP4 и Si QD наблюдается только слабая красная флуоресценция. Красная флуоресценция в ткани опухоли с мицеллами Si QD-CKAP4 значительно выше других групп. Данные указывают, что мицеллы Si QD-CKAP4 эффективно таргетируют ткани рака легких in vitro — потенциальный флуоресцентный контрастный агент для рака легких.

Детекция способности мицелл Si QD-CKAP4 таргетировать ткань A549 in vitro. a Ткань опухоли A549 и нормальная ткань легких инкубированы с мицеллами Si QD-CKAP4 и Si QD (Si 150 мкг/мл) 37 °C 2 ч. После двух промывок ткани окрашены DAPI для визуализации ядер. Фотографированы конфокальным лазерным микроскопом (Bar, 200 мкм). b Количественный анализ средней красной флуоресцентной интенсивности ImageJ (n=3; mean±SD; однофакторный ANOVA с пост-тестом Даннета; ***P<0,001)

Флуоресцентное изображения In Vivo

9 мышей с опухолями разделены на три группы (инъекция Si QD-CKAP4, инъекция Si QD мицелл, инъекция физраствора). Группа Si QD-CKAP4: внутривенно 200 мкл Si QD-CKAP4 (Si: 4 мг/кг). Группа Si QD мицелл: 200 мкл Si QD мицелл (Si: 4 мг/кг). Группа физраствор: 200 мкл физраствора. Флуоресцентные изображения в разные временные точки (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 ч). Значимых флуоресцентных сигналов в тканях рака легких среди всех мышей трех групп не наблюдалось (данные не показаны). Это может быть связано с слабым проникновением флуоресценции мицелл Si QD-CKAP4 и Si QD.

Мышей группы Si QD-CKAP4 усыпляли и утилизировали в 4 ч для детекции флуоресцентного сигнала в сердце, печени, селезенке, легких, почке и опухоли. Данные: значительный флуоресцентный сигнал в печени, почке и тканях опухоли. В сердце, селезенке или здоровой ткани легких значимого сигнала нет (Рис. 6). Сигнал в печени и почке указывает на метаболизацию печенью и экскрецию почками. Флуоресцентный сигнал в тканях опухоли A549 значительно выше здоровой ткани легких. Это подтверждает таргетирующую способность мицелл Si QD-CKAP4 к тканям рака легких. Результаты показывают, что мицеллы Si QD-CKAP4 специфически таргетируют ткань рака легких, ожидаются флуоресцентным контрастным агентом для навигации при операции рака легких в будущем.

a Яркая фотография сердца, печени, селезенки, легких, почки и опухоли мышей с инъекцией Si QD-CKAP4. b Флуоресцентная фотография тех же органов. c Относительные флуоресцентные интенсивности (n=3; mean±SD; однофакторный ANOVA с пост-тестом Даннета; *P<0,05; **P<0,01)

Оценка биобезопасности мицелл Si QD-CKAP4 In Vivo

Исследуемая острая токсичность мицелл Si QD-CKAP4 in vivo. 12 мышей с опухолями внутривенно инъекцировали физраствора (200 мкл), мицелл Si QD (Si: 4 мг/кг, 200 мкл) или мицелл Si QD-CKAP4 (Si: 4 мг/кг, 200 мкл), через 24 ч утилизировали. H&E окрашивание сердца, печени, селезенки, легких, почек показано на Рис. 7. По сравнению с мышами, получившими физраствор, в основных органах мышей с мицеллами Si QD и Si QD-CKAP4 не наблюдалось явных патологических изменений. Данные указывают, что мицеллы Si QD (Si: 4 мг/кг) и мицеллы Si QD-CKAP4 (Si: 4 мг/кг) не показывают значительной токсичности in vivo.

H&E окрашивание сердца, печени, селезенки, легких, почек мышей с опухолями, инъецированных физраствором, мицеллами Si QD (Si: 4 мг/кг) и мицеллами Si QD-CKAP4 (Si: 4 мг/кг) через 24 ч (увеличение 200×)

Обсуждение

В настоящее время различные флуоресцентные наноматериалы проектируются как оптические контрастные агенты для хирургической навигации [3, 4]. В 2020 г. On et al. приготовили флуорофор-конъюгированные (ICG или Cy5.5) гликол хитосан наночастицы (CNPs) как флуоресцентный контрастный агент для навигации при операции рака легких [18]. Однако нет отчетов о подготовке флуоресцентных контрастных агентов для навигации при операции рака легких с использованием Si QD.

Данное исследование успешно синтезировало мицеллы Si QD-CKAP4, способные к таргетированной визуализации тканей рака легких. Мицеллы Si QD-CKAP4 ожидаются оптическим контрастным агентом для навигации при операции рака легких в будущем. Преимущества мицелл Si QD-CKAP4: (1) Впервые синтезирован флуоресцентный контрастный агент для навигации при операции рака легких с использованием Si QD, расширяя инструментарий. (2) Оптимизированы водорастворимые мицеллы Si QD Pi et al. для добавления таргетирующей способности [12] — новая возможность применения Si QD в биомедицине. (3) Принцип таргетирования основан на высокой экспрессии CKAP4 в тканях рака легких. Благодаря конъюгации анти-CKAP4, мицеллы Si QD-CKAP4 активно таргетируют ткань рака легких. По сравнению с наноматериалами, пассивно таргетирующими опухоли через EPR эффект, мицеллы Si QD-CKAP4 показывают более высокую специфичность. (4) Мицеллы Si QD-CKAP4 показывают селективную токсичность к опухолевым клеткам в определенном диапазоне концентраций. Поэтому в рациональном диапазоне доз мицеллы Si QD-CKAP4 обладают высокой биобезопасностью, демонстрируя потенциальную клиническую ценность.

PL QY тесты: абсолютный PL QY мицелл Si QD ~14,49%, мицелл Si QD-CKAP4 ~16,96%. Pi et al. сообщали PL QY додецил-Si QD ~26% — очень высоко для Si QD с красной эмиссией (PL пик <700 нм) [12, 19, 20]. PL QY мицелл Si QD в данной работе ~14,49% — ниже додецил-Si QD. Это может быть из-за поверхностных дефектов, вводимых при эмульсионном процессе, почти согласуется с снижением PL QY в Si-QD мицеллах (додецил-пассивированные Si QD инкапсулированы в мицеллы, самособранные из F127 в эмульсии) в работе Pi et al. [12, 21]. PL QY мицелл Si QD-CKAP4 ~16,96% — немного выше мицелл Si QD (14,49%). Это может быть потому, что конъюгация CKAP4 антитела восстановила некоторые поверхностные дефекты мицелл Si QD, немного повысив PL QY.

Известна проблема биологических применений Si QD: хотя Si малоцитотоксичен, Si частицы могут проявлять цитотоксичность при уменьшении размера до определенного предела. В данном исследовании цитотоксичность показала, что мицеллы Si QD-CKAP4 демонстрируют селективную цитотоксичность к клеткам рака легких при 9,5–19 мкг/мл. Следовательно, благодаря конъюгации CKAP4 антитела, цитотоксичность мицелл Si QD-CKAP4 к нормальным клеткам значительно меньше, чем к клеткам рака легких, создавая мощное условие для биологического применения.

Для изучения таргетирующей способности использовали A549 и 293T. A549 — адгезивные, 293T — полуадгезивные. Во время эксперимента число 293T уменьшалось из-за повторных центрифугирований и промывок. Поэтому на Рис. 4 число 293T ниже A549.

Стоит отметить, что A549 — p53 wild-type клеточная линия рака легких. Только A549 не может полностью отразить таргетирующую способность мицелл Si QD-CKAP4 к раку легких. Дальнейшие исследования будут проводиться на p53-негативных линиях (например, H1299) для обеспечения твердой экспериментальной базы клинического применения [22].

Заключение

Данное исследование улучшило и модифицировало мицеллы Si QD, сообщенные Pi et al., для приготовления водорастворимых мицелл Si QD-CKAP4. Мицеллы Si QD-CKAP4 — сферические частицы со средним гидродинамическим диаметром ~78,8 нм. УФ-Vis абсорбция 200–500 нм. При возбуждении 330 нм сильная флуоресценция при 640 нм. Мицеллы Si QD-CKAP4 демонстрируют хорошую таргетирующую способность к клеткам и тканям рака легких in vitro и in vivo. In vivo флуоресцентное изображения показало метаболизацию печенью и экскрецию почками. Цитотоксичность и H&E окрашивание показали высокую биобезопасность in vitro и in vivo. Мицеллы Si QD-CKAP4 — специфический таргетированный образовательный агент для рака легких и ожидаются флуоресцентным контрастным агентом для навигации при операции рака легких в будущем.

Доступность данных и материалов

Данные и анализ текущей работы доступны у соответствующих авторов по разумному запросу.

Аббревиатуры

Si QD:

Кремниевые квантовые точки

Si QD мицеллы-CKAP4:

Анти-CKAP4 конъюгированные мицеллы кремниевых квантовых точек

Додецил-Si QD:

Додецил-пассивированные Si QD

BSA:

Бovine serum albumin

THF:

Тетрагидрофуран

DMEM:

Dulbecco's modified eagle's medium

PBS:

Фосфатно-буферный раствор

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

TEM:

Проходная электронная микроскопия

DLS:

Динамическое рассеяние света

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

FTIR:

Фурье-спектроскопия ИК

XRD:

Рентгеновская дифракция

SPF:

Specific pathogen free

DAPI:

4′,6-диамидино-2-фенилиндол

H&E:

Гемоксилин и эозин