Нацеленные одностенные углеродные нанотрубки для фототермической терапии в сочетании с подавлением иммунных контрольных точек для лечения метастатического рака молочной железы

Введение

Метастазы и последствия их лечения являются самой серьезной причиной смерти от рака [1]. Например, при метастазах рака груди 5-летняя выживаемость пациентов падает ниже 25%. Несмотря на то, что за последние 60 лет более 200 новых противоопухолевых препаратов улучшили исходы для пациентов, общая выживаемость остается низкой при метастатическом поражении [2]. Здесь изучается новая комбинация фототермической терапии с использованием биоконъюгата одностенных углеродных нанотрубок (SWCNT), нацеленных на опухоль, и ингибирования контрольной точки антицитотоксического Т-лимфоцит-ассоциированного белка 4 (анти-CTLA-4) для лечения метастатического рака молочной железы у ортотопическая модель на мышах.

Уникальные свойства SWCNT как наноматериала вызвали значительный интерес к их использованию в качестве потенциального инструмента в борьбе с раком. В то время как SWCNT обладают множеством биологических эффектов, использование SWCNT в лечении рака было сосредоточено в первую очередь на их взаимодействии с ближним инфракрасным светом (NIR) и возникающем фототермическом эффекте, когда SWCNT быстро нагревают опухоль в процессе, называемом фототермической терапией. (PTT). Многочисленные группы исследовали возможность использования SWCNT в стратегиях лечения на основе ЧТВ на нескольких моделях рака груди [3,4,5,6,7,8,9,10]. Эти работы были в основном сосредоточены на способности ЧТТ лечить первичные опухоли на глубине не более нескольких мм, где ослабление ближнего инфракрасного света почти полное.

Ранее мы показали, что первичные ортотопические опухоли молочной железы у сингенных мышей могут быть почти полностью устранены с помощью мягкого лазерного излучения NIR в сочетании с биоконъюгатом SWCNT, улучшающим фототермические свойства [11]. В этом биоконъюгате SWCNT были функционализированы с помощью белка аннексина A5 (ANXA5), который связывается с высоким сродством с анионным фосфолипидным фосфатидилсерином, экспрессируемым извне на опухолевых клетках и на эндотелиальных клетках сосудистой сети опухоли, но не на нормальных клетках сосудистой сети [ 12,13,14]. Этот конъюгат был визуализирован с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ), чтобы показать, что высота конъюгата составляла от 2,5 до 5,0 нм, что аналогично таковому для других конъюгатов SWCNT-белок [11]. Хотя фототермическая терапия способна уничтожать первичные опухоли в этой предыдущей метастатической модели, она лишь незначительно увеличивает выживаемость. Однако мы обнаружили предварительные доказательства того, что сопутствующее лечение иммуномодуляторами, такими как циклофосфамид, способно увеличить выживаемость.

В последнее время большой интерес вызвала возможность иммуномодуляторов, таких как циклофосфамид, синергетически усиливать ЧТВ, направленную на SWCNT. Одной из категорий многообещающих иммуномодуляторов являются ингибиторы контрольных точек. Ингибиторы контрольных точек - это антитела, такие как анти-CTLA-4, анти-PD-1 и анти-PDL-1, которые связывают критические клеточные белки, ответственные за модуляцию реакции организма на рак. Эти антитела блокируют ключевые биологические «контрольные точки», где организм может подавлять реакцию иммунной системы на рак. Эти белки обычно играют важную роль в контроле иммунологического ответа организма. Блокируя действие этих белков, ингибиторы контрольных точек устраняют механизм, с помощью которого иммунная система обычно подавляет свой естественный противоопухолевый ответ. Недавно несколько групп наблюдали, что комбинация ингибирования контрольной точки анти-CTLA-4 с усиленной SWCNT PTT может способствовать устойчивому иммунному ответу при раке груди [15, 16].

В текущем исследовании мы оцениваем комбинацию нашего нового метода PTT в сочетании с иммуностимулирующим агентом, антицитотоксическим T-лимфоцит-ассоциированным белком 4 (анти-CTLA-4). Первоначально одобренный для лечения метастатической меланомы [17], анти-CTLA-4 в настоящее время тестируется для лечения рака груди в клинических испытаниях в сочетании с другими иммуностимулирующими агентами [18]. Мы оцениваем механизм усиления противоопухолевого иммунитета при ЧТВ в сочетании с ингибированием контрольных точек анти-CTLA-4, а также более длительную судьбу SWCNT в органах-мишенях.

Материалы и методы

Материалы

Плазмида, кодирующая ANXA5, pET-30 Ek / LIC / ANX, была сконструирована ранее в этой лаборатории [11]. Бычий сывороточный альбумин (BSA), Triton X-100, EDTA, β-меркаптоэтанол, фенилметилсульфонилфторид (PMSF) и буфер Tris-ацетат-EDTA были от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Фосфат натрия и додецилсульфат натрия (SDS) были от Mallinckrodt Chemicals (Филлипсбург, Нью-Джерси). Этанол для ВЭЖХ был получен от Acros Organics (Уолтем, Массачусетс). Колонки для His-ловушки были от GE Healthcare (Чикаго, Иллинойс). Окрашивающий буфер для проточной цитометрии, буфер для фиксации / пермеабилизации, буфер для пермеабилизации, набор для количественного определения хромогенного эндотоксина и диализные кассеты Slide-A-Lyzer (3,5 кДа) были получены от Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Диализные мембраны 2 и 100 кДа были получены от Spectrum Laboratories (Ранчо Домингес, Калифорния). Клеточная среда Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) и сбалансированный солевой раствор Хэнка были получены от ATCC (Манассас, Вирджиния). Фетальная бычья сыворотка (FBS) была от Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). Триптон, дрожжевой экстракт и моносульфат канамицина были получены от Alfa Aesar (Ward Hill, MA). Гидроксид натрия, хлорид калия и хлорид натрия были от VWR Inc (Раднор, Пенсильвания). Протеаза HRV-C3 была от Sino Biologics (Портленд, Орегон). Мышиные моноклональные антитела против CTLA-4 (клон:9H10) и наборы для ELISA мышиных цитокинов (TNF-α, IFN-γ, IL-6) были получены от BioLegend (Сан-Диего, Калифорния). ОСНТ CoMoCAT (средний диаметр 0,8 ± нм, средняя длина 1,5 ± 0,5 мкм) были получены от CHASM (Бостон, Массачусетс). Известно, что метод CoMoCAT дает SWCNT небольшого количества ( n , м ) хиральности с высокой селективностью [19]. Образец, использованный в данном исследовании, сильно обогащен [5, 6] ОСУНТ, которые демонстрируют сильное поглощение света в ближнем ИК-диапазоне на длине волны 980 нм. Это поглощение соответствует S ₁₁ переход для этого типа нанотрубок между занятой сингулярностью Ван Хова и соответствующей незанятой. Следовательно, чтобы максимизировать поглощение излучения ОСУНТ, нанесенными на опухоли, длина волны лазера, используемого в этом исследовании, составляла 980 нм, что точно соответствует длине волны S ₁₁ оптический переход [20]. На рисунке S1 в дополнительном файле 1 показаны спектры флуоресценции, ясно показывающие S ₁₁ БИК-излучение после возбуждения перехода S22 видимым светом.

Культивирование клеток

Клетки рака молочной железы EMT6 из ATCC (Манассас, Вирджиния) культивировали в среде Waymouth's MB 752/1 с 2 мМ L-глутамином с добавлением 15% FBS. Все клетки выращивали при 37 ° C и 100% влажности в атмосфере 5% CO ₂ . . Все клетки пассировали с использованием 0,25% (мас. / Об.) Трипсина в 0,53 мМ EDTA. Клеточные линии и статус отсутствия микоплазм были подтверждены с помощью STR-тестирования (Charles River) и протестированы на отсутствие эндотоксинов с помощью анализа limulus.

Производство ANXA5 и SWCNT-ANXA5

Конъюгат SWCNT-ANXA5 был приготовлен с использованием ранее разработанной нами процедуры, которая дает 2,5 мг ANXA5 / мг SWCNT [11]. Вкратце, Э. coli трансфицированные плазмидой, кодирующей ANXA5, pET-30 Ek / LIC / ANX, выращивали и очищали с использованием аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом с иммобилизованным Ni ²⁺ для выделения ANXA5, который включает ферментативное расщепление для удаления (His) ₆ тег. Лиофилизированные ОСНТ CoMoCAT диспергировали в 1% додецилсульфате натрия (SDS), используя два цикла обработки зонда ультразвуком при 20 Вт и центрифугирования при 29 600 g в течение 30 минут каждый. Суспендированные ОСУНТ были охарактеризованы флуоресценцией NIR (дополнительный файл 1:Рисунок S1) и затем конъюгированы с линкером 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-полиэтиленгликоль-малеимид (DSPE-PEG-малеимид) в течение 30 мин. при комнатной температуре, чтобы обеспечить гидрофобное взаимодействие между SWCNT и функциональной группой DSPE. Затем следовали 8-часовой диализ в дистиллированной воде для удаления избытка линкера и SDS. Затем диализованный конъюгат подвергали реакции с ANXA5, который содержит одну цистеиновую группу, в течение 2 часов и блокировали 1,5 мг мл ^-1 L-цистеин. Конечный продукт, SWCNT-ANXA5, подвергали диализу против 20 мМ натрий-фосфатного буфера в течение 8 часов для удаления избытка ANXA5 и L-цистеина. Вес и чистоту белка характеризовали с помощью SDS-PAGE. Содержание SWCNT и ANXA5 в биоконъюгате было охарактеризовано с помощью флуоресцентной спектроскопии UV-Vis-NIR, спектроскопии комбинационного рассеяния в инфракрасной области с преобразованием Фурье (FT-IR) и анализа Брэдфорда (дополнительный файл 1:Рисунок S2).

Исследования In Vivo

Все процедуры соответствовали протоколу, утвержденному Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Оклахомы. Использовали самок мышей BALB / cJ в возрасте 6 недель (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Мышей кормили стандартной диетой. Во время фототермического облучения опухолей лазером NIR мышей анестезировали 2% изофлураном и 98% кислородом с помощью носового конуса.

Опухоли были вызваны ортотопической инъекцией 10 ⁶ Клетки рака молочной железы мыши EMT6 в 100 мкл PBS в жировую подушечку молочной железы внутривенно. Опухолям давали возможность расти в течение 12 дней, а когда они достигли объема 60 мм ³ (~ 5 мм в диаметре) мыши получали системную в.в. инъекция 1,2 мг / кг биоконъюгата SWCNT-ANXA5 (мг SWCNT на кг массы тела) через боковую хвостовую вену. Через 3 часа область на 5 мм выше границы опухоли облучали ближним инфракрасным светом (980 нм) при уровне энергии и мощности 175 Дж / см ² и 1 Вт / см ² соответственно (время 175 с; БИК-лазер Диодевет-50, B&W Tek Inc., Ньюарк, Делавэр). Блокировка КПП осуществлялась серийным i.p. введение 200 мкг антитела против CTLA-4 в 100 мкл PBS на 8, 11 и 16 дни после инокуляции опухоли. Объем опухоли рассчитывали по модифицированной формуле эллипсоида \ (V =\ frac {1} {2} \ times {\ text {length}} \ times {\ text {width}} ^ {2} \) с использованием кавернометрических измерений самый длинный размер и перпендикулярная ширина. Температуру опухоли контролировали портативной тепловизионной камерой FLIR TG165 Spot (Raymarine ITC, Fareham, UK), настроенной на автоматическое сканирование для определения максимальной обнаруженной температуры. Органы-мишени собирали для оценки токсичности и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, а затем готовили окрашенные формалином-фиксированные-залитые парафином (FFPE) слайды и окрашивали гематоксилином и эозином для анализа токсичности.

Обнаружение Ex Vivo SWCNT

Мышам вводили системную инъекцию 1,2 мг / кг SWCNT-ANXA5 (мг SWCNT / кг массы тела) через боковую хвостовую вену. В выбранные моменты времени мыши ( n =3) были усыплены, вскрыты и органы-мишени удалены для анализа. Образцы тканей готовили, как описано ранее [21]. Затем присутствие ОСУНТ в образцах тканей ex vivo определяли с помощью относительной ближней инфракрасной флуоресцентной спектроскопии с использованием NS3 NanoSpectralyzer (Applied NanoFluorescence, Хьюстон, Техас).

Проточная цитометрия

Мышей умерщвляли через 14 дней после лечения и количественно определяли противоопухолевые иммунные эффекторные клетки селезенки, как описано ранее [21].

Обнаружение цитокинов

После лечения, описанного выше, мыши ( n =4–5) были подвергнуты эвтаназии через 7 дней после фототермической терапии для сбора крови. Концентрация фактора некроза опухоли альфа (TNF-α), гамма-интерферона (IFN-γ) и интерлейкина 6 (IL-6) в разбавленных образцах сыворотки была определена количественно с помощью ELISA в соответствии с протоколом поставщика.

Статистический анализ

Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения Graphpad Prism. Статистическая значимость оценивалась с использованием однофакторного дисперсионного анализа и теста множественных сравнений Тьюки – Крамера. Статистическую значимость кривых выживаемости определяли с помощью лог-рангового критерия Мантеля – Хензеля. Статистическая значимость концентрации цитокинов в сыворотке была проанализирована с помощью однофакторного дисперсионного анализа и теста множественных сравнений Даннета. Множественные сравнения корректировались порогом Бонферрони. Ошибка представлена ​​графически как стандартная ошибка среднего, если только ошибка не превышала размер нанесенного на график символа средней точки; в этом случае столбцы были исключены для ясности.

Результаты

Температурная кинетика

Используя дозу 1,2 мг / кг SWCNT-ANXA5, максимальную температуру опухолей регистрировали в ходе лечения светом NIR, как показано на рис. 1. У мышей, которые получали SWCNT-ANXA5 перед облучением, температура опухоли была выше для полная обработка светом NIR по сравнению с мышами, получавшими физиологический раствор. Средняя температура опухоли у мышей, получавших SWCNT-ANXA5, значительно отличалась от температуры у мышей, получавших физиологический раствор (54 ° C против 37 ° C, p <0,05). В результате этой усиленной фототермической терапии только в группе SWCNT-ANXA5 произошла видимая абляция опухоли. Удаление опухоли характеризовалось быстрым обесцвечиванием с последующим контрактурой кожи и появлением морщин. В течение 48 ч на месте фототермической абляции образовался значительный струп. Полное восстановление кожи заняло несколько недель.

Тепловая кинетика в результате облучения опухолей ближним инфракрасным светом при длине волны 980 нм. Мышам BALB / cJ с опухолями EMT6 вводили внутривенно. в хвостовой вене с 1,2 мг / кг SWCNT-ANXA5. После ожидания 3 ч, пока ОСУНТ не вышли из кровообращения, опухоли облучали БИК-лазером с плотностью энергии и мощности 175 Дж / см ² и 1 Вт / см ² соответственно ( t =175 с). Регистрировали максимальную температуру опухоли как функцию времени. Температура опухолей у мышей, получавших SWCNT, была значительно выше, чем у мышей, получавших физиологический раствор в t =175 с ( p <0,05). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка ( n =3)

Фототермическая терапия и подавление контрольных точек

Результаты комбинирования фототермической терапии с ингибированием контрольных точек с использованием моноклональных антител против CTLA-4 показаны на рис. 2. Хотя фототермическая терапия сама по себе легко искоренила первичную неоплазию рака молочной железы, неспособность лазера NIR проникать за пределы нескольких мм ограничивала лечение метастазов рака груди. Чтобы преодолеть недостатки локализованного фототермического противоопухолевого лечения NIR, мы исследовали комбинацию этого уникального терапевтического метода лечения с системным ингибированием контрольных точек (рис. 2). В то время как фототермическая терапия преуспела в разрушении первичных опухолей EMT6 (рис. 2a), это лечение не смогло ликвидировать метастазы и лишь незначительно увеличило выживаемость мышей с ортотопическими опухолями EMT6 (рис. 2b). Напротив, ингибирование контрольной точки с помощью анти-CTLA-4 увеличивало общую выживаемость, но только временно задерживало рост первичной опухоли. Хотя ни одна терапия сама по себе не привела к увеличению общей выживаемости, комбинация фототермической терапии, усиленной SWCNT-ANXA5, и ингибирования контрольных точек против CTLA-4 улучшила общую выживаемость, что привело к выживаемости 55% через 100 дней после инокуляции опухоли.

Результаты комбинаторной фототермической терапии (PTT) и ингибирования контрольных точек (анти-CTLA-4) в опухолях EMT6. Мыши с хорошо развитыми ортотопическими сингенными опухолями ( d ≥ 5 мм) вводили внутривенно. системная доза 1,2 мг / кг SWCNT-ANXA5. а Затем объем опухоли контролировали после облучения (стрелка) лазером NIR в течение 175 с при плотности мощности 1 Вт / см ² на 12-й день после инокуляции. В дополнение к ЧТВ избранные группы получали анти-CTLA-4 (100 мкг) на 8, 11 и 16 дни. Мышам контрольной группы вводили внутривенно. с физиологическим раствором. Объем опухоли показан как среднее значение ± стандартная ошибка ( n =7). Значимость по сравнению с контролем обозначена * ( p <0,05). б Комбинация фототермической терапии и подавления иммунных контрольных точек значительно увеличила выживаемость по сравнению с контролем ( p <0,05, n =7). c , d Только когда мыши получали фототермическую терапию в сочетании с ингибированием контрольных точек анти-CTLA-4, относительное количество CD4 ⁺ значительно увеличивалось. и CD8 ⁺ спленоциты наблюдались через 2 недели после ЧТВ. Спленоциты показаны как среднее значение ± стандартная ошибка ( n =3). Значимость обозначена *** ( p <0,005)

Цитометрический анализ эффекторных клеток селезенки после лечения выявил предполагаемый механизм улучшения выживаемости у мышей, получавших комбинаторную фототермическую терапию и ингибирование контрольных точек. Мышам прививали ЕМТ6 и лечили, как описано ранее. Через две недели после обработки мышей умерщвляли и количественно определяли как процентное соотношение, так и относительное количество нескольких типов иммунных эффекторов. Были оценены популяции хелперных Т-клеток, цитотоксических Т-клеток, нейтрофилов, моноцитов миелоидных супрессорных клеток (MDSC), регуляторных Т-клеток FoxP3 и макрофагов (дополнительный файл 1:Рисунок S3). Анализ этих популяций выявил значительные различия между экспериментальными популяциями и контролем только у мышей, которые получали комбинацию фототермической терапии и ингибирования контрольной точки анти-CTLA-4 вместе. У тех животных, которые получали эту комбинацию, мы наблюдали увеличение относительного количества хелперных Т-клеток (CD4 ⁺ ) и цитотоксические Т-клетки (CD8 ⁺ ), (Рис. 2в, г). Повышает уровень CD4 ⁺ и CD8 ⁺ количество клеток коррелировало с резким увеличением размеров селезенки, наблюдаемым после аутопсии.

В дополнение к цитометрическому анализу эффекторных клеток селезенки определяли концентрацию цитокинов в сыворотке через 7 дней после ЧТВ, чтобы помочь выяснить механизмы противоопухолевого иммунитета. Уровни провоспалительных цитокинов IL-6, IFN-γ и TNF-α представлены на фиг. 3. Ни лечение SWCNT, ни лечение против CTLA-4 по отдельности значительно не увеличивали уровни цитокинов по сравнению с необработанной контрольной группой. Однако только лечение ЧТВ могло значительно повысить TNF-α. Дальнейшее добавление анти-CTLA-4 к лечению PTT значительно повысило уровни TNF-α, IL-6 и IFN-γ.

Концентрация цитокинов в сыворотке крови. Количественная оценка уровней цитокинов в сыворотке мышей через 7 дней после ЧТВ показала значительное увеличение уровней IL-6, IFN-γ и TNF-α у мышей после ЧТВ в сочетании с ингибированием контрольной точки (анти-CTLA-4). Результаты показаны для необработанного контроля, только лечения SWCNT, только лечения против CTLA-4, лечения PTT и лечения PTT + анти-CTLA-4. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка ( n =4–5). Статистическая значимость была проанализирована для обработанных групп по сравнению с необработанной контрольной группой с помощью однофакторного дисперсионного анализа с тестом множественных сравнений Даннета. Статистическая значимость обозначена * ( p <0,05) и **** ( p <0,0001)

Биораспределение и токсичность SWCNT-ANXA5

Биораспределение SWCNT-ANXA5 после введения для усиления фототермической терапии в различных органах отслеживали с помощью флуоресцентного количественного определения SWCNT в тканевых лизатах ex situ по сравнению со стандартами (дополнительный файл 1:Рисунок S4). Биораспределение в органах-мишенях отслеживалось в течение 4 месяцев после в / в. инъекция 1,2 мг / кг SWCNT-ANXA5 здоровым мышам (рис. 4а, б). Напротив, накопление SWCNT-ANXA5 у мышей с опухолью EMT6 после введения в соответствии с ранее описанным протоколом инъекции определяли через 3 часа после введения. (Время проведения фототермической терапии в исследовании лечения.) В течение 4-месячного периода, предшествующего извлечению органов, у мышей наблюдали за физическими побочными эффектами и ненормальным поведением. Никаких побочных эффектов не наблюдалось у мышей, которым вводили SWCNT-ANXA5 в течение этого периода времени. При исследовании окрашенных гематоксилином и эозином срезов FFPE из органов-мишеней по завершении исследования гистопатологической токсичности не наблюдалось (дополнительный файл 1:Рисунок S5).

Биораспределение SWCNT-ANXA5, измеренное в% от введенной дозы ( a ) и концентрации в тканях в г / л ( b ). Конъюгат SWCNT-ANXA5 был внутривенным. вводили мышам Balb / cJ в дозе 1,2 мг / кг. Концентрацию ОСУНТ измеряли в различных органах мышей без опухолей через 1, 2, 3 и 4 месяца (слева направо). Для мышей с опухолями концентрацию SWCNT измеряли во время, как это было бы непосредственно перед лечением фототермической терапией. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка ( n =3)

Обсуждение

Представленные здесь данные подтверждают эффективность сочетания таргетной фототермической терапии и подавления иммунных контрольных точек для лечения метастатического рака груди. Это явление известно как «эффект абсорбции», который описывает способность локализованного излучения вызывать противоопухолевый ответ, который подавляет рост опухоли на удалении от первичной мишени. Еще в 1950-х годах исследователи заметили, что локализованное облучение опухоли оказывает значительное влияние на удаленные опухоли [22]. Исследования установили, что системный характер абсопального эффекта обусловлен иммунным ответом хозяина [23,24,25]. В то время как гамма-облучение было основным направлением большинства исследований в области абсопии, все большее количество работ демонстрирует, что фототермическая терапия также может вызывать абсорбционный эффект. Многочисленные исследования показали, что термическая абляция в сочетании с ингибитором контрольной точки анти-CTLA-4 вызывает усиленный иммунный ответ [16, 26, 27, 28, 29]. Мы наблюдаем схожую абсопальную реакцию после целевой фототермической абляции и блокады анти-CTLA-4 в модели рака груди EMT6.

Эффект абсопии иллюстрируют данные на рис. 2а, б. Ортотопические опухоли EMT6 быстро растут и дают метастазы к моменту лечения фототермической терапией. Это причина того, что у мышей с опухолями, получавших только фототермическую терапию, выживаемость была лишь незначительной по сравнению с контрольными мышами, не получавшими лечения, даже несмотря на то, что первичная опухоль была полностью удалена. Введение одного анти-CTLA-4 задерживало рост опухоли по сравнению с контролем и увеличивало время выживания до 68 дней, но не привело к излечению. Подобный результат задержки роста опухоли EMT6 наблюдался Jure-Kunkel et al. при введении анти-CTLA-4 [30]. При сочетании фототермической терапии и анти-CTLA-4 55% мышей, получавших лечение, выжили через 100 дней после инокуляции опухоли и, вероятно, излечились.

Понимание механизма противоопухолевого иммунитета было оценено с помощью проточной цитометрии для количественного определения популяций иммунных эффекторных клеток в селезенке. По сравнению с фототермической терапией или только анти-CTLA-4, комбинированная терапия привела к семикратному увеличению вспомогательных CD4 ⁺ Т-клетки и трехкратное увеличение цитолитического CD8 ⁺ Т-клетки, оба этих результата имеют высокую статистическую значимость ( p <0,005). Эти результаты являются дополнительным доказательством потенциальной абсопной реакции на комбинацию фототерапии и терапии костимуляции Т-лимфоцитов с подавлением иммунных контрольных точек.

Повышает уровень CD4 ⁺ и CD8 ⁺ количество клеток коррелировало с увеличением размеров селезенки, наблюдаемым во время аутопсии. Увеличенный размер селезенки указывает на усиленный иммунный ответ. Селезенка состоит из нескольких типов клеток, наиболее распространенными из которых являются клетки CD4 ⁺ , CD8 ⁺ , и линии B-клеток [31, 32]. Хотя это и не рассматривается в этой работе, мы ожидаем, что количество B-клеток будет увеличиваться вместе с CD4 ⁺ . и CD8 ⁺ Подсчет Т-лимфоцитов [33]. Помощник CD4 ⁺ Т-клетки способствуют гуморальному иммунитету, облегчая работу других иммунных клеток за счет цитокиновой стимуляции и прямых межклеточных взаимодействий. Цитолитический CD8 ⁺ Т-клетки напрямую убивают опухолевые клетки. Повышает уровень CD4 ⁺ и CD8 ⁺ количество клеток свидетельствует о системном абсорбционном иммунном ответе.

Наличие системного абскопального иммунного ответа после комбинированного лечения дополнительно подтверждается увеличением уровней провоспалительных цитокинов в сыворотке мышей (рис. 3). TNF-α активирует ассоциированные с опухолью макрофаги, проявляя противоопухолевый эффект [34, 35]. IFN-γ играет важную роль в наблюдении за опухолью [36, 37]. IL-6 способствует пролиферации макрофагов и лимфоцитов [38]. Значительное увеличение этих эффекторных молекул в сыворотке мышей через 7 дней после лечения PTT в сочетании с анти-CTLA-4 дополнительно подтверждает существование противоопухолевого иммунного ответа.

По завершении облучения мышей, которым вводили SWCNT, средняя максимальная температура опухоли составляла 54 ° C; этой температуры было достаточно, чтобы полностью удалить опухоль (рис. 1). Это находится в диапазоне 45–60 ° C, в котором происходит инактивация ферментов и повреждение митохондрий [39]. Температура опухолей в контрольной группе с физиологическим раствором оставалась ниже 40 ° C, температура, которая обеспечивает минимальный терапевтический эффект [39,40,41].

Мы наблюдали, что большая часть накопления SWCNT-ANXA5, в зависимости от концентрации, была в основном в печени, сердце, селезенке, почках, легких и опухоли (рис. 4a). У мышей с опухолями EMT6 мы наблюдали, что концентрация SWCNT-ANXA5 была аналогична концентрации в печени и почках (рис. 4a, b). Следы SWCNT-ANXA5 были обнаружены в головном мозге, толстом и тонком кишечнике. Важно отметить, что биораспределение SWCNT на основе% введенной дозы (ID) плохо коррелирует с абсолютной концентрацией SWCNT в ткани-мишени. В первую очередь это связано с различиями в весе органов. Например, данный% ID внутри органа будет соответствовать более высокой концентрации в меньших органах и меньшим концентрациям в более крупных органах. Сравнение образцов на основе концентрации SWCNT показывает, что самая высокая концентрация находится в почках, за которыми следуют печень и селезенка (рис. 4a).

Имеются некоторые свидетельства деградации SWCNT в различных органах за период исследования биораспределения (рис. 4a, b). Деградация ОСУНТ в органах ожидается на основании предыдущего открытия, что многослойные углеродные нанотрубки разлагаются в макрофагах [42]. Используемые в нашем исследовании ОУНТ имеют средний диаметр 0,8 нм и среднюю длину 1500 мкм. Цитотоксичность такого размера не прогнозируется на основании исследования Zhu et al. [43], которые классифицировали возможность повреждения липидного бислоя токсичностью углеродных нанотрубок на основе длины и диаметра. Согласно этой классификации, SWCNT, которые мы использовали, относятся к категории «биологически мягких», минимизирующих цитотоксичность, что согласуется с нашими наблюдениями в исследованиях на мышах, где мы не наблюдали никаких побочных эффектов или гистопатологической токсичности в результате введения SWCNT. -ANXA5 конъюгат.

Выводы

Здесь мы демонстрируем новый комбинаторный метод лечения, при котором мы получаем относительно высокую выживаемость у мышей с агрессивным метастатическим раком молочной железы с использованием фототермической терапии с биоконъюгатом SWCNT-ANXA5 в сочетании с ингибированием контрольных точек на основе анти-CTLA-4. Использование нацеливающего на сосуды опухоли белка ANXA5 минимизировало количество системно доставляемых SWCNT, необходимых для уничтожения первичных опухолей в низкой одноразовой дозе. Интересно, что мы отметили увеличение выживаемости мышей с метастатическим раком, получавших комбинаторную терапию, даже несмотря на то, что была облучена только первичная опухоль. Механическое исследование количественного определения количества важных эффекторных противоопухолевых клеток селезенки показало, что только комбинация обоих методов лечения увеличивает количество CD4 ⁺ помощник и CD8 ⁺ цитотоксические Т-клетки. Мы предполагаем, что это увеличение Т-лимфоцитов отражает абсорбционный ответ, когда противоопухолевые эффекторные клетки подавляют метастазирование опухоли. Хотя через 4 месяца после введения в органах все еще обнаружено присутствие SWCNT, в ходе экспериментов не наблюдалось никаких побочных эффектов или явной тканевой токсичности.

Доступность данных и материалов

Все данные полностью доступны без ограничений.

Сокращения

SWCNT:

Одностенные углеродные нанотрубки

ANXA5:

Аннексин А5

анти-CTLA-4:

Антицитотоксический белок 4, связанный с Т-лимфоцитами

EDTA:

Этилендиаминтетрауксусная кислота

SDS-PAGE:

Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis

DSPE:

1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine

PTT:

Photothermal therapy