Нацеленная фототермическая терапия углеродных нанотрубок с ингибированием контрольных точек: новая стратегия для метастазирующего рака груди

Культивирование клеток

Клетки рака груди EMT6 от ATCC (Manassas, VA) культивировали в среде Waymouth's MB 752/1 с 2 мМ L-глутамином, добавленным 15% FBS. Все клетки выращивали при 37 °C и 100% влажности под 5% CO₂. Все клетки пассажировали с использованием 0,25% (м/об) трипсина в 0,53 мМ EDTA. Наследственность клетковой линии и статус без микоплазмы подтверждались через STR-тестирование (Charles River) и анализировались на отсутствие эндотоксинов лимулусовым анализом.

Производство ANXA5 и SWCNT-ANXA5

Конъюгат SWCNT-ANXA5 приготовляли с использованием процедуры, которую мы ранее разработали, дающей 2,5 мг ANXA5/мг SWCNT [11]. Кратко, E. coli, трансфецированные плазмидой, кодирующей ANXA5, pET-30 Ek/LIC/ANX, выращивали и очищали с использованием иммобилизованного металла аффинной хроматографии с иммобилизованным Ni²⁺ для изоляции ANXA5, что включало ферментативное расщепление для удаления (His)₆ тега. Сублимированные при вакууме SWCNT CoMoCAT диспергировали в 1% натрий додецилсульфат (SDS) с использованием двух циклов зондовой соникации при 20 Вт и центрифугировании на 29 600 g в течение 30 мин каждый. Взвешенные SWCNT характеризовали НИК флуоресценцией (дополнительный файл 1: рисунок S1), а затем конъюгировали с линкером 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-полиэтиленгликоль-малеимид (DSPE-PEG-малеимид) на 30 мин при комнатной температуре для гидрофобного взаимодействия между SWCNT и DSPE функциональной группой. Это следовало за 8-часовым диализом в дистиллированной воде для удаления избыточного линкера и SDS. Диализированный конъюгат затем реагировали с ANXA5, который содержит одну цистеиновую группу, на 2 ч и блокировали 1,5 мг мл⁻¹ L-цистеином. Финальный продукт, SWCNT-ANXA5, диализировали против 20 мМ натрий фосфат буфер на 8 ч для удаления избыточного ANXA5 и L-цистеина. Белковый вес и чистота характеризовались через SDS-PAGE. Содержание SWCNT и ANXA5 биоконъюгата характеризовалось УФ-Виз-НИК флуоресцентной спектроскопией, Фурье-преобразованием инфракрасной спектроскопии (FT-IR) Раман анализом и Брэдфордовым анализом (дополнительный файл 1: рисунок S2).

In Vivo исследования

Все процедуры соответствовали протоколу, одобренному Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Оклахомского университета. Самки мышей BALB/cJ 6 недель возраста использовались (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Мышей кормили стандартным кормом. Во время фототермического облучения опухолей НИК лазерным светом мышей анестезировали 2% изофлураном и 98% кислородом с использованием носового конуса.

Опухоли индуцировали ортотопической инъекцией 10⁶ клеток рака груди мыши EMT6 в 100 мкл PBS в IV молочную жировую подушку. Опухоли позволяли расти 12 дней, и когда они достигали объема 60 мм³ (~ 5 мм в диаметре), мыши получали системную в.в. инъекцию 1,2 мг/кг биоконъюгата SWCNT-ANXA5 (мг SWCNT на кг массы тела) через боковую хвостовую вену. Через 3 ч область 5 мм в избытке границы опухоли облучали НИК светом (980 нм) при энергии и уровне мощности 175 Дж/см² и 1 Вт/см² соответственно (время 175 с; Diodevet-50 NIR лазер, B&W Tek Inc., Newark, DE). Ингибирование контрольной точки осуществляли последовательной в.б. администрацией 200 мкг анти-CTLA-4 антитела в 100 мкл PBS на 8, 11 и 16 день после инокуляции опухоли. Объем опухоли вычисляли с модифицированной эллипсоидной формулой \(V = \frac{1}{2} \times {\text{length}} \times {\text{width}}^{2}\) с использованием измерений калипром самой длинной размерности и перпендикулярной ширины. Температура опухоли контролировала ручная термическая камера FLIR TG165 Spot (Raymarine ITC, Fareham, UK), установленная на автосканирование для максимальной обнаруженной температуры. Целевые органы собирали для токсикологической оценки и фиксировали в 10% нейтральном буферизованном формалине, и парафиновые срезы, зафиксированные формалином (FFPE), готовили и окрашивали гемоксилином и эозином для токсикологического анализа.

Ex Vivo детекция SWCNT

Мыши получали системную инъекцию 1,2 мг/кг SWCNT-ANXA5 (мг SWCNT/кг массы тела) через боковую хвостовую вену. В выбранные временные точки мыши (n = 3) эвтаназировали, некропировали и удаляли целевые органы для анализа. Тканевые образцы готовили как описано ранее [21]. Наличие SWCNT в экз vivo тканевых образцах затем определяли относительной НИК флуоресцентной спектроскопией с использованием NS3 NanoSpectralyzer (Applied NanoFluorescence, Houston, TX).

Цитометрия

Мышей эвтаназировали на 14-й день после лечения, и спленческие антиопухолевые иммунные эффекторные клетки квантовывали как описано ранее [21].

Детекция цитокинов

После лечения, как описано выше, мышей (n = 4–5) эвтаназировали через 7 дней после фототермической терапии для сбора крови. Концентрация фактора некроза опухоли альфа (TNF-α), интерферона гамма (IFN-γ) и интерлейкина 6 (IL-6) в разбавленных образцах сыворотки квантовывали ELISA согласно протоколу поставщика.

Статистический анализ

Данные анализировали с программным обеспечением Graphpad Prism. Статистическая значимость оценивалась с использованием однофакторного ANOVA и теста Тьюки-Крамера для множественных сравнений. Статистическая значимость кривых выживаемости определялась тестом Мантеля-Хензела лог-ранк. Статистическая значимость концентрации цитокинов в сыворотке анализировалась однофакторным ANOVA и тестом Даннета для множественных сравнений. Множественные сравнения корректировались порогом Бонферрони. Ошибка представляется графически как стандартная ошибка среднего, если ошибка не превышала размер отображенного символа средней точки, в этом случае столбцы исключались для ясности.

Результаты

Тепловая кинетика

Используя дозу 1,2 мг/кг SWCNT-ANXA5, максимальная температура опухолей записывалась в ходе лечения НИК светом, как указано на рис. 1. Мыши, получившие SWCNT-ANXA5 перед облучением, имели более высокие температуры опухолей на протяжении всего НИК лечения по сравнению с мышами, получившими физиологический раствор. Средняя температура опухоли для мышей, получавших SWCNT-ANXA5, была значительно отличающейся от мышей, получавших физиологический раствор (54 °C против 37 °C, p < 0,05). В результате этой усиленной фототермической терапии видимая аблиция опухоли происходила только в группе SWCNT-ANXA5. Аблиция опухоли характеризовалась быстрым изменением окраски, за которым следовало сокращение кожи и появление морщин. В течение 48 ч на месте фототермической аблиции формировался значительный ешар. Полное восстановление кожи занимало несколько недель.

Фототермическая терапия и ингибирование контрольной точки

Результаты комбинирования фототермической терапии с ингибированием контрольной точки с использованием моноoclonalного антитела анти-CTLA-4 показаны на рис. 2. В то время как фототермическая терапия в одиночно легко искореняла первичную неоплазию рака груди, неспособность НИК лазерного света проникать за несколько мм ограничивала лечение метастазов рака груди. Чтобы преодолеть недостатки локализованного НИК фототермического противоопухолевого лечения, мы исследовали комбинацию этой уникальной терапевтической модальности с системным ингибированием контрольной точки (рис. 2). В то время как фототермическая терапия превосходила в уничтожении первичных опухолей EMT6 (рис. 2a), это лечение не устраняло метастазы и лишь умеренно увеличивало выживаемость мышей с ортотопическими опухолями EMT6 (рис. 2b). Напротив, ингибирование контрольной точки с анти-CTLA-4 улучшало общую выживаемость, но лишь временно задерживало рост первичной опухоли. В то время как ни одна терапия в одиночку не давала увеличения общей выживаемости, комбинация обоих усиленной фототермической терапии SWCNT-ANXA5 и ингибирования контрольной точки анти-CTLA-4 улучшала общую выживаемость, приводя к 55% выживаемости на 100-й день после инокуляции опухоли.

Цитометрический анализ спленческих эффекторных клеток после лечения раскрыл предполагаемый механизм улучшенной выживаемости мышей, получавших комбинаторную фототермическую терапию и ингибирование контрольной точки. Мышей инокулировали EMT6 и лечили как описано ранее. Через две недели после лечения мышей жертвовали и квантовали как проценты, так и относительные числа множественных типов иммунных эффекторов. Популяции помощников Т-клеток, цитотоксических Т-клеток, нейтрофилов, моноцитов миелоидных супрессорных клеток (MDSC), регуляторных Т-клеток FoxP3 и макрофагов оценивались (дополнительный файл 1: рисунок S3). Анализ этих популяций раскрыл значительные различия между лечебными популяциями и контролями только в мышах, получивших комбинацию фототермической терапии и ингибирования контрольной точки анти-CTLA-4 вместе. В тех животных, получивших эту комбинацию, мы наблюдали увеличение относительных чисел помощников Т-клеток (CD4⁺) и цитотоксических Т-клеток (CD8⁺), (рис. 2c, d). Увеличения количества CD4⁺ и CD8⁺ клеток коррелировали с грубым увеличением размеров селезенки, наблюдаемым после некропии.

Помимо цитометрического анализа спленческих эффекторных клеток, концентрация цитокинов в сыворотке определялась через 7 дней после PTT для помощи вucidation механизмов антиопухолевого иммунитета. Уровни про-воспалительных цитокинов IL-6, IFN-γ и TNF-α представлены на рис. 3. Ни SWCNT, ни анти-CTLA-4 лечение в одиночку незначительно увеличивали уровни цитокинов по сравнению с необработанной контрольной группой. Однако PTT лечение в одиночку смогло значительно увеличить TNF-α. Дополнительное добавление анти-CTLA-4 к PTT лечению значительно увеличивало уровни TNF-α, IL-6 и IFN-γ.

Биораспределение и токсичность SWCNT-ANXA5

Биораспределение SWCNT-ANXA5 после администрации для усиления фототермической терапии в различных органах контролировалось флуоресцентным квантованием SWCNT в экз ситу тканевых лизатах по сравнению со стандартами (дополнительный файл 1: рисунок S4). Биораспределение в целевых органах следили в течение 4 месяцев после в.в. инъекции 1,2 мг/кг SWCNT-ANXA5 в здоровых мышах (рис. 4a, b). Напротив, накопление SWCNT-ANXA5 в мышах с опухолями EMT6 после администрации, согласно ранее описанному протоколу инъекции, определялось через 3 ч после администрации. (Время, когда фототермическая терапия выполнялась в лечебном исследовании.) В течение 4-месячного периода перед сбором органов мышей наблюдали за физическими побочными эффектами и ненормальным поведением. Никаких побочных эффектов не наблюдалось ни в одной мыши, инъецированной SWCNT-ANXA5 в этот период времени. Никакой гистопатологической токсичности не наблюдалось при осмотре гемоксилин-эозиновых окрашенных FFPE срезов из целевых органов по завершении исследования (дополнительный файл 1: рисунок S5).

Обсуждение

Представленные здесь данные подтверждают эффективность комбинирования таргетированной фототермической терапии и иммунного ингибирования контрольных точек для лечения метастазирующего рака груди. Это явление известно как «абскопальный эффект», который описывает способность локализованного облучения инициировать антиопухолевый ответ, подавляющий рост опухолей вдали от первичной цели. Еще в 1950-х годах исследователи замечали, что локализованное облучение опухоли имело значительный эффект на далекие опухоли [22]. Исследования установили, что системная природа абскопального эффекта обусловлена иммунным ответом хозяина [23,24,25]. Пока γ-облучение было основным фокусом большинства абскопальных исследований, растущее тело работ демонстрирует, что фототермическая терапия также может индуцировать абскопальный эффект. Множество исследований продемонстрировали, что термическая аблиция в комбинации с ингибитором контрольной точки анти-CTLA-4 производит усиленный иммунный ответ [16, 26,27,28,29]. Мы наблюдаем аналогичный абскопальный отклик после таргетированной фототермической аблиции и блокады анти-CTLA-4 в модели EMT6 рака груди.

Абскопальный эффект иллюстрируется данными на рис. 2a, b. Ортотопические опухоли EMT6 растут быстро и к моменту лечения фототермической терапией уже метастазировали. Это причина, почему мыши с опухолями, леченными только фототермической терапией, имели лишь незначительное увеличение выживаемости по сравнению с контрольной группой необработанных мышей, даже хотя первичная опухоль была полностью аблирована. Администрация анти-CTLA-4 в одиночку задерживала рост опухоли по сравнению с контролем и увеличивала время выживания до 68 дней, но не вела к исцелению. Аналогичный результат задержки роста опухоли EMT6 наблюдался Jure-Kunkel et al. при администрации анти-CTLA-4 [30]. Для комбинации фототермической терапии и анти-CTLA-4, 55% леченных мышей выжили на 100-й день после инокуляции опухоли и, вероятно, исцелены.

Понимание механизма антиопухолевого иммунитета оценивалось использованием цитометрии для квантования популяций иммунных эффекторных клеток в селезенке. По сравнению с фототермической терапией или анти-CTLA-4 в одиночку, комбинаторная терапия привела к семикратному увеличению помощников CD4⁺ Т-клеток и трехкратному увеличению цитолитических CD8⁺ Т-клеток, оба этих результата были высоко статистически значимыми (p < 0,005). Эти результаты предоставляют дополнительные доказательства потенциального абскопального ответа комбинации фототерапии и Т-клеточной ко-стимуляционной терапии с иммунным ингибированием контрольных точек.

Увеличения количества CD4⁺ и CD8⁺ клеток коррелировали с увеличением размеров селезенки, наблюдаемым во время некропии. Увеличение размера селезенки указывает на усиленный иммунный ответ. Селезенка состоит из множественных типов клеток, наиболее распространенными из которых являются линии CD4⁺, CD8⁺ и B-клеток [31, 32]. Хотя не исследовано в этой работе, мы ожидаем, что количество B-клеток увеличится вместе с количеством CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток [33]. Помощники CD4⁺ Т-клетки помогают в гуморальном иммунитете, облегчая другие иммунные клетки стимуляцией цитокинов и прямыми клетка-клетка взаимодействиями. Цитолитические CD8⁺ Т-клетки напрямую убивают опухолевые клетки. Увеличения количества CD4⁺ и CD8⁺ клеток указывают на системный абскопальный иммунный ответ.

Наличие системного абскопального иммунного ответа после комбинаторного лечения дополнительно подтверждается увеличением уровней про-воспалительных цитокинов в сыворотке мышей (рис. 3). TNF-α активирует опухоль-ассоциированные макрофаги для представления антиопухолевых эффектов [34, 35]. IFN-γ играет важную роль в опухолевой слежке [36, 37]. IL-6 способствует пролиферации макрофагов и лимфоцитов [38]. Значительное увеличение этих эффекторных молекул в сыворотке мышей через 7 дней после PTT лечения в комбинации с анти-CTLA-4 дополнительно подтверждает существование антиопухолевого иммунного ответа.

В конце облучения мышей, получивших SWCNT, средняя максимальная температура опухоли составляла 54 °C; эта температура была достаточной для полной аблиции опухоли (рис. 1). Это находится в диапазоне 45–60 °C, в котором происходит инактивация ферментов и митохондриальная травма [39]. Температура опухолей в контрольной группе с физиологическим раствором оставалась ниже 40 °C, температуры, дающей минимальную терапевтическую пользу [39,40,41].

Мы наблюдали, что большинство накопления SWCNT-ANXA5 на основе концентрации в основном было в печени, сердце, селезенке, почках, легких и опухоли (рис. 4a). В мышах с опухолями EMT6 мы наблюдали, что концентрация SWCNT-ANXA5 была похожа на ту, что в печени и почках (рис. 4a, b). Следы SWCNT-ANXA5 обнаруживались в мозге, толстом и тонком кишечнике. Важно отметить, что биораспределение SWCNT на основе % введенной дозы (ID) не коррелирует хорошо с абсолютной концентрацией SWCNT в целевой ткани. Это в основном связано с различиями в массах органов. Например, данный % ID внутри органа будет соответствовать более высокой концентрации в меньших органах и меньшим концентрациям в больших органах. Сравнивая образцы на основе концентрации SWCNT, раскрывается, что наивысшая концентрация в почке, за которой следуют печень и селезенка (рис. 4a).

Существует некоторое доказательство деградации SWCNT в различных органах за период биораспределения исследования (рис. 4a, b). Деградация SWCNT в органах ожидается на основе предыдущего обнаружения, что многослойные углеродные нанотрубки деградируют в макрофагах [42]. SWCNT, использованные в нашем исследовании, имеют средний диаметр 0,8 нм и среднюю длину 1500 мкм. Этот размер не предсказан как цитотоксичный на основе исследования Zhu et al. [43], который классифицировал потенциал повреждения липидного двуслойного слоя цитотоксичностью углеродных нанотрубок на основе длины и диаметра. Согласно этой классификации, SWCNT, которые мы использовали, находятся в категории «биологически мягких», минимизируя цитотоксичность, что согласуется с нашими наблюдениями в исследованиях на мышах, где мы не наблюдали никаких побочных эффектов или гистопатологической токсичности в результате администрации конъюгата SWCNT-ANXA5.

Заключения

Здесь мы демонстрируем новую комбинаторную модальность лечения, где мы получаем относительно высокую выживаемость у мышей с агрессивным метастазирующим раком груди, используя фототермическую терапию с биоконъюгатом SWCNT-ANXA5 в комбинации с ингибированием контрольной точки на основе анти-CTLA-4. Использование онкотаргетного белка ANXA5 минимизировало количество системно доставленных SWCNT, необходимых для искоренения первичных опухолей в низкой одноразовой дозе. Интересно, мы отметили увеличение выживаемости мышей с метастатическим раком, леченных комбинаторной терапией, даже хотя только первичная опухоль была облучена. Механистическое исследование, квантующее числа важных спленческих антиопухолевых эффекторных клеток, раскрыло, что только комбинация обеих модальностей лечения увеличивала количество CD4⁺ помощников и CD8⁺ цитотоксических Т-клеток. Мы предполагаем, что это увеличение Т-клеток отражает абскопальный ответ, где антиопухолевые эффекторные клетки подавляли метастазирование опухоли. Хотя SWCNT все еще находились в органах через 4 месяца после администрации, никаких побочных эффектов или явной тканевой токсичности не наблюдалось в ходе экспериментов.

Доступность данных и материалов

Все данные полностью доступны без ограничений.

Аббревиатуры

SWCNT:

Однослойные углеродные нанотрубки

ANXA5:

Аннексин A5

anti-CTLA-4:

Анти-цитотоксичный Т-лимфоцитарный ассоциированный белок 4

EDTA:

Этилендиаминтетрауксусная кислота

SDS-PAGE:

Натрий додецилсульфат-полиакриламидный гель электрофорез

DSPE:

1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин

PTT:

Фототермическая терапия