PLGA-липидные наночастицы с отслеживанием 131I как носители доставки лекарств для целевого химиотерапевтического лечения меланомы

Фон

Один из наиболее агрессивных видов рака кожи, меланома, возникает в результате злокачественной трансформации меланоцитов [1, 2]. Учитывая легкий рецидив и высокий потенциал метастазирования, 5-летняя выживаемость пациентов с метастазирующей меланомой составляет всего 10%. На сегодняшний день наиболее распространенным лечением пациентов с меланомой является химиотерапия, которая сопровождается нежелательными тяжелыми побочными эффектами, низкой биодоступностью, плохой селективностью опухоли и ограничивающей дозу системной токсичностью, что создает серьезные проблемы при химиотерапии опухолей [3, 4].

Паклитаксел (PTX), натуральный растительный экстракт, полученный из сушеных корней, ветвей, листьев и коры таксусов, рода хвойных деревьев [5, 6], проявляет эффективную противоопухолевую активность в отношении нескольких видов опухолей, включая рак яичников и легкие. рак [7,8,9]. Кроме того, PTX также был эффективен против меланомы человека [10, 11]. Тем не менее, помимо вышеупомянутых недостатков химиотерапевтических препаратов, Cremophor EL и дегидратированный спирт (1:1, v / v ) смесь используется в современной клинической практике в качестве среды для разведения PTX, что может привести к серьезным побочным эффектам, включая гиперчувствительность [12, 13]. Следовательно, первостепенное значение имеет разработка новых стратегий повышения растворимости в воде и накопления химиотерапевтических агентов в опухоли для уменьшения их периферического воздействия и минимизации их токсичности in vivo. Недавняя разработка наноносителей для биосовместимых лекарственных средств дает возможность повысить физиологическую стабильность PTX [14,15,16]. Кроме того, конъюгация целевых молекул с этими наноносителями позволит селективно доставлять химиотерапевтические агенты к участкам опухоли с уменьшенным периферическим воздействием за счет направленного действия, опосредованного рецепторами опухолевых клеток [17,18,19].

Здесь мы приготовили композицию поли (d, l-лактид-гликолид) (PLGA) -липид, который ковалентно конъюгирует фолиевую кислоту (FA:молекула, нацеленная на опухоль) и инкапсулирует PTX в качестве химиотерапевтического препарата для лечения меланомы. Кроме того, ¹³¹ I, радиоактивный маркер, использовали для радиоактивной метки наночастиц PLGA-липидов, чтобы четко оценить их поведение in vivo. Из-за отрицательного бета-излучения, физического периода полураспада и широкого диапазона свойств распада ¹³¹ I обычно используется в качестве радиоактивной метки в клинике [20,21,22]. Морфология, стабильность и дисперсность ¹³¹ Меченые I PLGA-липидные наночастицы (FA-PLP- ¹³¹ I) оценивали in vitro. Кроме того, поглощение клетками, кровообращение и биораспределение FA-PLP- ¹³¹ Я был исследован путем измерения радиоактивности ¹³¹ I. Кроме того, целевая противораковая эффективность FA-PLP- ¹³¹ Меня изучали in vitro и in vivo. Результаты показывают, что FA-PLP- ¹³¹ Я могу быть универсальной наноплатформой для использования в качестве потенциального наноносителя для доставки противоопухолевых лекарств для химиотерапевтических препаратов.

Методы

Материалы

Поли (d, l-лактид-гликолид) (PLGA, молекулярная масса:5000-15000, лактид:гликолид (50:50)) и хлорамин-T были приобретены у Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Na ¹³¹ Получен в компании Atomic Hitech (Пекин, Китай). PTX (99%) и 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) были приобретены у Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Лецитин сои, состоящий из 90–95% фосфатидилхолина, 1,2-дистеароил-sn-глицерин-3-фосфоэтаноламина- N - [фолат (полиэтиленгликоль) -2000] (DSPE-PEG ₂₀₀₀ -FA) и 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин- N - [карбокси (полиэтиленгликоль) -2000] (DSPE-PEG ₂₀₀₀ -COOH) были получены от Avanti (Alabaster, AL, USA). Все реагенты для клеточных культур были приобретены у Sigma Aldrich.

Приготовление наночастиц FA-PLP

Наночастицы FA-PLP были синтезированы методом нанопреципитации самосборки [23]. Более подробно, 10 мг PTX растворяли в 1 мл этанола и 2 мг PLGA растворяли в 1 мл дихлорметана. После их смешивания лецитин / DSPE-PEG ₂₀₀₀ -FA (4:1) водный раствор этанола (4 мас.%) Добавляли по каплям в раствор смеси в течение 4 часов при осторожном перемешивании при 25 ° C. Смесь фильтровали и трижды промывали деионизированной водой с использованием ультрафильтрационной центрифужной пробирки Millipore для удаления неинкапсулированного лекарственного средства и органического растворителя. В качестве контроля наночастицы без прививки молекулы ЖК получали тем же методом, заменяя DSPE-PEG ₂₀₀₀ -FA с DSPE-PEG ₂₀₀₀ -COOH. Очищенные наночастицы FA-PLP хранили при 4 ° C до дальнейшего использования.

Подготовка ¹³¹ Меченые I наночастицы FA-PLP

Радиоактивный FA-PLP (FA-PLP- ¹³¹ I) наночастицы получали методом окисления хлорамином-Т [24]. Смесь 1 мл FA-PLP (1 мг / мл), 500 мкКи Na ¹³¹ I (максимальная радиоактивность, которая может быть привита на FA-PLP) и 100 мкл 5 мг / мл хлорамина-Т реагировали в фосфатном буфере с pH 7,5 в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем реакцию гасят, добавляя 200 мкл метабисульфита натрия (5 мг / мл). ¹³¹ Меченые I PLP и PTX получали по той же процедуре. Их очищали с помощью центрифужной пробирки (Millipore) для удаления оставшегося свободного Na ¹³¹ . I до тех пор, пока в растворе фильтрата не обнаруживалась гамма-активность. Выход радиоактивной метки и чистота меченых наночастиц анализировали с помощью гамма-счетчика (LKB gamma 1261; LKB Instruments).

Характеристика

Спектры поглощения в УФ – видимой области регистрировали с помощью спектрофотометра УФ – видимой области (UV7502, Shanghai Advanced Photoelectric Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай). Изображения просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) получали на ПЭМ Zeiss LIBRA 120. Размер, дзета-потенциал и индекс полидисперсности (PDI) наночастиц определяли с помощью анализа динамического светорассеяния (DLS) с использованием Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). Оптические фотографии были сделаны цифровой камерой Nikon D3200.

Культура клеток

Клеточная линия меланомы мыши B16F10 была получена из банка клеток коллекции типовых культур Китайской академии наук (Шанхай, Китай) и культивирована в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 100 Ед / мл пенициллина / стрептомицина в увлажненной среде. 5% CO ₂ атмосфера при 37 ° C.

Анализы инкорпорации in vitro

Зависимые от времени анализы включения in vitro были выполнены для определения оптимального времени эффективности связывания клеток для ¹³¹ I-меченые соединения [25]. Клетки B16F10 высевали в 24-луночные планшеты в количестве 1 × 10 ⁵ . клеток на лунку и культивировали до слияния. Радиоактивные йодированные образцы ( ¹³¹ I, PL- ¹³¹ I, FA-PL- ¹³¹ I, PLP- ¹³¹ I, FA-PLP- ¹³¹ I) были приготовлены в среде DMEM и добавлены в лунки для культур клеток по отдельности. После 0,5, 1, 2, 4 и 6 ч инкубации клетки трижды промывали PBS и измеряли их радиоактивность с помощью гамма-счетчика (Научно-технический институт Китая, Jia Branch Innovation Co., Ltd.). Значения включения (%) рассчитывали, как описано в предыдущей литературе [25]. Кроме того, наночастицы метили флуоресцентным красителем флуоресцеинизотиоцианатом (FITC, Sigma), а затем инкубировали с клетками B16F10. Флуоресцентные изображения клеток получали с помощью коммерческого конфокального лазерного сканирующего микроскопа (FV1200, Olympus, Токио, Япония).

Анализ цитотоксичности in vitro

Анализ жизнеспособности клеток МТТ был использован для изучения цитотоксичности PL- ¹³¹ I и FA-PL- ¹³¹ У меня, как и у бесплатного PTX, PLP- ¹³¹ I, и FA-PLP- ¹³¹ I, против клеток B16F10. Вкратце, клетки B16F10 помещали в 96-луночные планшеты на 24 часа и подвергали воздействию PL- ¹³¹ . I и FA-PL- ¹³¹ I (с 0–100 мкг / мл PLGA-липида) или свободный PTX, PLP- ¹³¹ I, и FA-PLP- ¹³¹ I (в различных концентрациях 0–40 мкг / мл) в течение 24 ч. Эксперимент проводили в трех повторностях. Все данные выражены как среднее ± стандартное отклонение.

Модель животного

Мышей Balb / c в возрасте от трех до пяти недель приобретали у Shanghai Slack Laboratory Animal Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Фудань, который соответствует требованиям Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здравоохранения.

Ячейки B16F10 (1 × 10 ⁶ ) в PBS вводили подкожно в правый бок мышей. Объем растущей опухоли измеряли штангенциркулем, а объем опухоли рассчитывали по формуле:объем =(длина × ширина ² ) / 2. Когда объем опухоли достигнет примерно 80 мм ³ , мышей рандомизировали в экспериментальные группы.

Исследование кровообращения и биораспределения

Здоровым мышам Balb / c внутривенно вводили PTX- ¹³¹ I и FA-PLP- ¹³¹ I (100 мкл 10 мкКи на мышь, 5 мг / кг). Кровообращение измеряли путем взятия примерно 10 мкл крови из хвоста мышей. Радиоактивность крови измеряли с помощью гамма-счетчика. Чтобы определить биораспределение наночастиц, мышам с опухолью B16F10 вводили PTX- ¹³¹ I, FA-PL- ¹³¹ I, PLP- ¹³¹ I, и FA-PLP- ¹³¹ Я в той же дозе и умер через 24 ч после укола. Основные органы были взвешены и собраны для гамма-подсчета.

Химиотерапия опухолей in vivo

Мышам Balb / c с опухолями B16F10 вводили 150 мкл физиологического раствора, свободного PTX, PLP- ¹³¹ I, и FA-PLP- ¹³¹ I (при той же концентрации ПТХ 5 мг / кг). Размер опухоли и массу тела измеряли штангенциркулем каждые 4 дня. Относительные объемы опухоли были рассчитаны как V / V ₀ ( V ₀ был объем опухоли на момент начала лечения). Примерно после 40 дней лечения мышей умерщвляли и собирали основные органы, фиксировали в 4% формалине, залили парафином и нарезали ломтиками, окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали под цифровым микроскопом.

Результаты и обсуждение

Подготовка и характеристика ¹³¹ Меченые I наночастицы FA-PLP

Схема синтеза ФА-ПЛП- ¹³¹ Наночастицы I показаны на рис. 1. Вкратце, наночастицы FA-PLP были синтезированы с помощью метода самосборки наночастиц и радиоактивного FA-PLP (FA-PLP- ¹³¹ I) был получен методом окисления хлорамина-Т [23, 24]. PTX был инкапсулирован композитом PLGA-липид, который затем был привит ковалентно конъюгированным FA на поверхность оболочки посредством ПЭГилирования. Наконец, ¹³¹ Меня прививали на внешнюю поверхность наночастиц. Изображения ПЭМ показали, что FA-PLP- ¹³¹ Наночастицы I имели сферическую морфологию с узким распределением по размерам (от 165,6 до 181,2 нм), что подтверждалось динамическим светорассеянием (рис. 2а, б). Дзета-потенциал находился в диапазоне от -39,1 до -3,2 мВ (рис. 2с). УФ – видимые спектры свободного PTX и FA-PLP- ¹³¹ I (с такой же концентрацией PTX) показал тот же пик характеристики при 233 нм (рис. 2d), что указывает на то, что PTX был инкапсулирован в FA-PLP- ¹³¹ Я и эта инкапсуляция не влияли на интенсивность поглощения PTX. После расчета эффективность инкапсуляции PTX в FA-PLP- ¹³¹ У меня было 56,35 ± 1,6%. Выход PTX- ¹³¹ с радиоактивной меткой I, PL- ¹³¹ I, FA-PL- ¹³¹ I, PLP- ¹³¹ I, и FA-PLP- ¹³¹ Мне было 45,6 ± 2,3, 52,1 ± 4,1, 48,9 ± 1,9, 56,3 ± 2,5 и 54,8 ± 2,7 соответственно.

Синтез FA-PLP- ¹³¹ I наночастицы

а ТЕМ-изображение FA-PLP- ¹³¹ I. б Размер частиц и c дзета-потенциал FA-PLP- ¹³¹ Я анализировал методом динамического рассеяния света. г Спектры поглощения свободного PTX и FA-PLP- ¹³¹ Я

Стабильность важна для биомедицинского применения наночастиц [26]. После 4 недель хранения FA-PLP- ¹³¹ Я, растворенный в воде, клеточной среде, фетальной бычьей сыворотке и PBS, не показал изменений в среднем размере, дзета-потенциале, индексе PDI (рис. 3a – c), что указывает на высокую стабильность и дисперсность. Кроме того, устойчивость FA-PLP- ¹³¹ к радиоактивной метке Я был обнаружен в плазме мышей при 37 ° C (рис. 3d), показывая менее 15% деиодирования в течение 7 дней.

а , b Коллоидная стабильность и c Тест PDI FA-PLP- ¹³¹ I в различных средах, включая воду, DMEM, PBS и фетальную бычью сыворотку (FBS). г Кривая стабильности радиомаркировки FA-PLP- ¹³¹ I в плазме мышей при 37 ° C в течение 2 недель хранения

Использование клеток in vitro

На рисунке 4 показано in vitro включение ¹³¹ в зависимости от времени. I, PL- ¹³¹ I, FA-PL- ¹³¹ I, PLP- ¹³¹ I, и FA-PLP- ¹³¹ I в клетках B16F10, измеренных гамма-счетчиком. FA-PLP- ¹³¹ I, а также FA-PL- ¹³¹ I показал более высокие значения включения, чем у всех тестируемых временных точек, и со временем они увеличивались. Значения включения FA-PLP- ¹³¹ Я через 6 часов был в 3,12 и 23,4 раза выше, чем у ¹³¹ Я и PLP- ¹³¹ I, что согласуется с результатами конфокальной лазерной сканирующей микроскопии клеток B16F10, инкубированных с меченным флуоресцеином изотиоцианатом FA-PLP- ¹³¹ Я и PLP- ¹³¹ I наночастицы (дополнительный файл 1:рисунок S1). Эти результаты демонстрируют высокое поглощение клетками FA-PLP- ¹³¹ I, вероятно, из-за воздействия FA-опосредованного нацеливания на клетки B16F10.

Зависящее от времени включение ¹³¹ I, PL- ¹³¹ I, FA-PL- ¹³¹ I, PLP- ¹³¹ I, и FA-PLP- ¹³¹ Я на ячейках B16F10

Цитотоксичность in vitro

Цитотоксичность контрольных наноносителей, PL- ¹³¹ I, и FA-PL- ¹³¹ Я прошел тест на МТТ. Клетки, обработанные PL- ¹³¹ I и FA-PL- ¹³¹ Я в течение 24 часов имел жизнеспособность, аналогичную контролю (рис. 5а), что свидетельствует о хорошей биосовместимости. Дополнительно FA-PLP- ¹³¹ Я был гораздо более эффективным в подавлении пролиферации клеток B16F10, чем свободный PTX и PLP- ¹³¹ I при той же концентрации PTX (рис. 5b), что указывает на превосходную химиотерапию, нацеленную на клетки. Результаты показывают, что FA-PLP- ¹³¹ I обладает сильным химиотерапевтическим эффектом без радиотоксичности и цитотоксичности.

а Жизнеспособность клеток B16F10 после обработки PL- ¹³¹ I и FA-PL- ¹³¹ Я за 24 ч. б Жизнеспособность клеток B16F10 после инкубации с различными концентрациями свободного PTX, PLP- ¹³¹ I, и FA-PLP- ¹³¹ Я за 24 часа

Исследование кровообращения и биораспределения

Сообщается, что радиомечение более надежно, чем флуоресцентная визуализация, для количественного и точного отслеживания наночастиц in vivo [27, 28]. ¹³¹ Меченные I наночастицы FA-PLP были приготовлены для исследования их поведения in vivo, включая кровообращение и биораспределение, по данным гамма-счетчика. Период полувыведения свободного PTX из крови ( t _1/2 =5,4 ± 0,23 ч) был продлен до 18,5 ± 0,5 ч с помощью FA-PLP- ¹³¹ I (рис. 6a) из-за инкапсуляции наночастиц, что было благоприятным для целевого накопления опухоли [29,30,31]. Далее биораспределение бесплатного PTX- ¹³¹ I, PLP- ¹³¹ I, и FA-PLP- ¹³¹ I на мышах с опухолью B16F10 через 1 день после инъекции исследовали (фиг. 6b). FA-PLP- ¹³¹ I, а также FA-PL- ¹³¹ I, продемонстрировал очевидное увеличение поглощения опухолью, которое было в 4,41 и 12,8 раз, чем у PLP- ¹³¹ Я и бесплатный PTX- ¹³¹ I, соответственно, вероятно, из-за длительного кровообращения FA-PLP- ¹³¹ I, FA-PL- ¹³¹ I, и его эффект наведения на FA. Кроме того, печень и селезенка также демонстрируют относительно высокий уровень поглощения из-за метаболизма наночастиц, которые являются нормальными органами обмена веществ [32, 33].

а Кривая кровообращения FA-PLP- ¹³¹ Я после внутривенного введения. б Биораспределение PTX- ¹³¹ I, FA-PL- ¹³¹ I, FA-PLP- ¹³¹ I, и PLP- ¹³¹ I у мышей с опухолью B16F10

Химиотерапия опухолей in vivo

Бесплатные PTX-, PLP- ¹³¹ I- и FA-PLP- ¹³¹ У мышей, получавших I, наблюдалось ингибирование роста опухоли по сравнению с контрольной группой, получавшей физиологический раствор (фиг. 7a). Всего FA-PLP- ¹³¹ Я был наиболее эффективным в подавлении роста опухоли без рецидива по сравнению со всеми обработанными группами примерно после 40 дней лечения. Эти результаты соответствуют ожиданиям, учитывая значительно увеличенное кровообращение FA-PLP- ¹³¹ I и, следовательно, его способность стимулировать FA-опосредованное целевое накопление опухоли. Кроме того, целевое накопление опухоли также привело к снижению периферического воздействия PTX, тем самым минимизируя системную токсичность. Как и ожидалось, в течение всего процесса лечения не было заметной потери массы тела (рис. 7b), а основные органы, включая сердце, печень, селезенку, легкие и почки, не показали явных гистологических повреждений ни в одной группе ( Рис. 7c).

а Относительный объем опухоли и b масса тела мышей с опухолью после инъекции в хвостовую вену физиологического раствора (контроль), свободного PTX, PLP- ¹³¹ I, и FA- PLP- ¹³¹ I. б Масса тела мышей с опухолью после инъекции в хвостовую вену физиологического раствора (контроль), свободного PTX, PLP- ¹³¹ I, и FA- PLP- ¹³¹ I. c Типичные изображения окрашивания гематоксилином и эозином основных органов, включая сердце, печень, селезенку, легкие и почки. Шкала масштаба =100 мкм

Выводы

Таким образом, мы синтезировали ¹³¹ Меченые I PLGA-липидные наночастицы в качестве носителей для доставки лекарств для химиотерапии, направленной на меланому. Измеряя радиоактивность ¹³¹ I, поведение FA-PLP- ¹³¹ in vitro и in vivo Исследовались наночастицы I. Полученный FA-PLP- ¹³¹ Я показал высокую дисперсность и стабильность в отношении коллоидов и радиоактивных меток. Контрольные наноносители, PL- ¹³¹ I, и FA-PL- ¹³¹ Я также показал хорошую биосовместимость. После инкапсуляции PTX FA-PLP- ¹³¹ Я был наиболее эффективным в подавлении пролиферации клеток B16F10 без цитотоксичности, связанной с воздействием нацеливания на FA. Кроме того, FA-PLP- ¹³¹ Было продемонстрировано, что я значительно продлил кровообращение PTX и эффективно накапливал в целевой области опухоли. Таким образом, FA-PLP- ¹³¹ У меня было отличное подавление роста опухоли и отличная биосовместимость in vivo. Результаты подчеркивают многообещающий потенциал этих универсальных FA-PLP- ¹³¹ I наноносители как надежные агенты отслеживания лекарств, а также их применение в таргетной терапии опухолей.