¹³¹I-маркированные PLGA-липидные наночастицы для таргетированной доставки паклитаксела и визуализации в терапии меланомы

Аннотация

В настоящей работе фолиевой кислотой (FA) конъюгированные поли(d,l-лактид-ко-гликолид) (PLGA)-липидные композиты (FA-PL) были разработаны как наноносцы для таргетированной доставки нерастворимого противопухолевого препарата паклитаксела (PTX), в результате чего получились FA-PLP наночастицы. Кроме того, ¹³¹I как радиоактивный маркер использовался для маркировки FA-PLP наночастиц (FA-PLP-¹³¹I) для оценки их клеточного захвата, in vivo кровеносного циркулирования и биодистрибуции. FA-PLP-¹³¹I наночастицы имели сферическую морфологию с высокой стабильностью, узким распределением размера (165,6 и 181,2 нм) и средним дзета-потенциалом −22,1 мВ. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия указала, что таргетирующая молекула FA способствует захвату PLP-¹³¹I меланомными клетками B16F10, что было дополнительно подтверждено скоростью клеточной инкорпорации через измерение активности ¹³¹I гамма-счетчиком. FA-PLP-¹³¹I без PTX (FA-PL-¹³¹I) показывает незначительную цитотоксичность, хорошую биосовместимость, в то время как FA-PLP-¹³¹I продемонстрировало эффективное подавление жизнеспособности клеток по сравнению с свободным PTX и PLP-¹³¹I. После внутривенного введения полупериод выведения свободного PTX (t₁/₂ = 5,4 ± 0,23 ч) был продлен до 18,5 ± 0,5 ч FA-PLP-¹³¹I. Благодаря FA таргетированию, опухолевой захват FA-PLP-¹³¹I был примерно в 4,41 и 12,8 раз выше по сравнению с PLP-¹³¹I и свободным PTX-¹³¹I соответственно. Более того, после 40 дней лечения FA-PLP-¹³¹I показало улучшенный эффект ингибирования опухоли по сравнению со свободным PTX и PLP-¹³¹I, без рецидива и без заметной системной in vivo токсичности. Результаты демонстрируют, что ¹³¹I-маркированные PLGA-липидные наночастицы могут одновременно применяться для таргетированной доставки лекарств и надежного отслеживания препаратов in vivo.

Введение

Одна из самых агрессивных кожных раков, меланома, возникает из злокачественного превращения меланоцитов. Учитывая ее легкую рецидивируемость и высокий метастатический потенциал, 5-летнее выживание пациентов с метастазировавшей меланомой составляет только 10 %. На сегодняшний день наиболее распространенным лечением меланомы является химиотерапия, которая сопровождается нежелательными тяжелыми побочными эффектами, низкой биодоступностью, плохой опухолевой селективностью и дозограничивающей системной токсичностью, представляющими главные вызовы в химиотерапии опухолей.

Паклитаксел (PTX), натуральный растительный экстракт, полученный из сушеных корней, ветвей, листьев и коры таксуса, рода хвойных деревьев, показывает эффективную антипухолевую активность против нескольких видов опухолей, включая яичноклеточный рак и рак легких. Кроме того, PTX также сообщался как эффективный против человеческой меланомы. Тем не менее, помимо вышеупомянутых недостатков химиотерапевтических препаратов, смесь Cremophor EL и обезводенного спирта (1:1, v/v) используется в текущей клинической практике как среда разведения для PTX, что может приводить к серьезным побочным эффектам, включая гиперчувствительность. Поэтому разработка новых стратегий для повышения водного растворимости и опухолевого накопления химиотерапевтических агентов для снижения их периферического воздействия и минимизации их in vivo токсичности имеет первостепенное значение. Недавнее развитие биосовместимых наноносцев лекарств предоставляет потенциал для повышения физиологической стабильности PTX. Кроме того, конъюгация таргетирующих молекул к этим наноносцам позволит селективную доставку химиотерапевтических агентов к опухолевым локализациям с уменьшением периферического воздействия через рецептор-медированный таргетирующий эффект на поверхности опухолевых клеток.

В настоящей работе мы подготовили поли(d,l-лактид-ко-гликолид) (PLGA)-липидный композит, ковалентно конъюгирующий фолиевую кислоту (FA: таргетирующую молекулу опухоли) и инкапсулирующий PTX как химиотерапевтический препарат для лечения меланомы. Кроме того, ¹³¹I, радиоактивный маркер, использовался для радиомаркировки PLGA-липидных наночастиц для четкой оценки их in vivo поведения. Благодаря своей отрицательной бета-эмиссии, физическому полупериоду и широкому спектру свойств распада, ¹³¹I обычно используется как радиомаркер в клинике. Морфология, стабильность и дисперсность ¹³¹I-маркированных PLGA-липидных наночастиц (FA-PLP-¹³¹I) оценивались in vitro. Кроме того, клеточный захват, кровеное циркулирование и биодистрибуция FA-PLP-¹³¹I изучались путем измерения радиоактивности ¹³¹I. Более того, таргетированная антипухолевая эффективность FA-PLP-¹³¹I изучалась in vitro и in vivo. Результаты указывают на то, что FA-PLP-¹³¹I может быть универсальной наноплатформой для использования как потенциальный наноносец лекарств для химиотерапевтических препаратов.

Методы

Материалы

Поли(d,l-лактид-ко-гликолид) (PLGA, ММ: 5000–15000, лактид:гликолид (50:50)) и хлорамин-T приобрели у Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Na¹³¹I получен от Atomic Hitech (Beijing, China). PTX (99 %) и 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) приобрели у Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). Лецитин сои, состоящий из 90–95 % фосфатидилхолина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[фолат (полиэтиленгликоль)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀-FA) и 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[карбокси (полиэтиленгликоль)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH) получены от Avanti (Alabaster, AL, USA). Все реагенты для клеточной культуры приобрели у Sigma Aldrich.

Приготовление FA-PLP наночастиц

FA-PLP наночастицы синтезировали методом самосборки нанопреципитации. В деталях, 10 мг PTX растворяли в 1 мл этанола и 2 мг PLGA растворяли в 1 мл дихлорметана. После смешивания, лецитин/DSPE-PEG₂₀₀₀-FA (4:1) этанол-водный раствор (4 масс.%) капельно добавляли в смесь для 4-часового мягкого перемешивания при 25 °C. Смесь фильтровали и промывали три раза деионизированной водой с использованием ультрафильтрационного центрифужного тюбика Millipore для удаления неинкапсулированного препарата и органического растворителя. В качестве контроля наночастицы без графтирования молекул FA готовили тем же методом, заменяя DSPE-PEG₂₀₀₀-FA на DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH. Очищенные FA-PLP наночастицы хранили при 4 °C до дальнейшего использования.

Приготовление ¹³¹I-маркированных FA-PLP наночастиц

Радиоактивные FA-PLP (FA-PLP-¹³¹I) наночастицы готовили методом оксидации хлорамин-T. Смесь 1 мл FA-PLP (1 мг/мл), 500 мкКл Na¹³¹I (максимальная радиоактивность, которую можно приграфтировать на FA-PLP) и 100 мкл 5 мг/мл хлорамин-T реагировали в фосфатном буфере pH 7,5 10 мин при комнатной температуре. Реакцию затем катализировали добавлением 200 мкл натрийметабисульфита (5 мг/мл). ¹³¹I-маркированные PLP и PTX готовили по той же процедуре. Их очищали с использованием центрифужного тюбика (Millipore) для удаления оставшегося свободного Na¹³¹I до тех пор, пока гамма-активность не становилась неопределимой в фильтрате. Радиомаркировочная выход и чистота маркированных наночастиц анализировали гамма-счетчиком (LKB gamma 1261; LKB Instruments).

Характеризация

UV-vis поглощения спектры записывали с помощью UV-vis спектрофотометра (UV7502, Shanghai Advanced Photoelectric Technology Co., Ltd., Shanghai, China). Проходная электронная микроскопия (TEM) изображения собирали на Zeiss LIBRA 120 TEM. Размер, дзета-потенциал и индекс полидисперсности (PDI) наночастиц детектировали динамическим рассеянием света (DLS) с использованием Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). Оптические фотографии делали цифровой камерой Nikon D3200.

Клеточная культура

Линия меланомных клеток мыши B16F10 получена от Клеточного банка Типовой коллекции Культур Китайской академии наук (Shanghai, China) и культивировалась в DMEM, содержащем 10 % фетальной говяжьей сыворотки и 100 ЕД/мл пенициллин/стрептомицин в увлажненной атмосфере 5 % CO₂ при 37 °C.

In vitro инкорпорирующие тесты

Временнозависимые in vitro инкорпорирующие тесты выполняли для определения оптимальных времен клеточного связывания для ¹³¹I-маркированных соединений. Клетки B16F10 посевали в 24-колончатых пластинках по 1×10⁵ клеток на колодец и культивировали до конфлюенции. Радиоодированные образцы (¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I) готовили в среде DMEM и добавляли в колодцы клеточной культуры раздельно. После 0,5, 1, 2, 4 и 6 ч инкубации клетки промывали PBS три раза и их радиоактивность измеряли гамма-счетчиком (Научно-технический институт Китая, филиал Jia Branch Innovation Co., Ltd.). Инкорпорирующие значения (%) рассчитывали как описано в предыдущей литературе. Кроме того, наночастицы маркировали флуоресцентным красителем флуоресцеинизотиоцианатом (FITC, Sigma) и затем инкубировали с клетками B16F10. Флуоресцентные изображения клеток захватывали коммерческим конфакальным лазерным сканирующим микроскопом (FV1200, Olympus, Tokyo, Japan).

In vitro цитотоксичность тест

MTT тест жизнеспособности клеток использовали для изучения цитотоксичности контрольных наноносцев PL-¹³¹I и FA-PL-¹³¹I, а также свободного PTX, PLP-¹³¹I и FA-PLP-¹³¹I против клеток B16F10. Кратко, клетки B16F10 размещали в 96-колончатых пластинках на 24 ч и экспонировали PL-¹³¹I и FA-PL-¹³¹I (с 0–100 мкг/мл PLGA-липид), или свободный PTX, PLP-¹³¹I и FA-PLP-¹³¹I (при различных концентрациях 0–40 мкг/мл) на 24 ч. Эксперимент выполняли в трипликате. Все данные выражались как среднее ± SD.

Животная модель

3-5-недельные мыши Balb/c приобрели у Shanghai Slack Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China). Все животные эксперименты одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Фуданьского университета, соответствующего руководству NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

Клетки B16F10 (1×10⁶) в PBS инъецировали подкожно в правый бок мышей. Растущий объем опухоли измеряли штангенциркулем, и объем опухоли рассчитывали формулой: объем = (длина × ширина²)/2. Когда объем опухоли достиг приблизительно 80 мм³, мышей рандомизировали в экспериментальные группы.

Изучение кровеносного циркулирования и биодистрибуции

Здоровые мыши Balb/c внутривенно инъецировали PTX-¹³¹I и FA-PLP-¹³¹I (100 мкл 10 мкКл на мышь, 5 мг/кг). Кровеное циркулирование измеряли забором примерно 10 мкл крови из хвоста мышей. Радиоактивность в крови измеряли гамма-счетчиком. Для детектирования нанопартикулярной биодистрибуции мышей с B16F10 опухолями инъецировали PTX-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I и FA-PLP-¹³¹I при той же дозе и жертвовали 24 ч после инъекции. Основные органы взвешивали и собирали для гамма-счета.

In vivo опухолевая химиотерапия

Мыши Balb/c с B16F10 опухолями инъецировали 150 мкл физраствора, свободного PTX, PLP-¹³¹I и FA-PLP-¹³¹I (при той же концентрации PTX, 5 мг/кг). Размер опухоли и масса тела измеряли штангенциркулем каждые 4 дня. Относительные объемы опухоли рассчитывали как V/V₀ (V₀ был объемом опухоли при начале лечения). После примерно 40 дней лечения мышей жертвовали и основные органы собирали, фиксировали в 4 % формалине, парафин-встраивали, нарезали, окрашивали гемтоксилином и эозином и изучали под цифровым микроскопом.

Результаты и обсуждение

Приготовление и характеристика ¹³¹I-маркированных FA-PLP наночастиц

Схема синтеза FA-PLP-¹³¹I наночастиц показана на рис. 1. Кратко, FA-PLP наночастицы синтезировали через метод самосборки нанопреципитации и радиоактивные FA-PLP (FA-PLP-¹³¹I) готовили методом оксидации хлорамин-T. PTX инкапсулировали PLGA-липидным композитом, который затем графтировали ковалентно конъюгированной FA на поверхности оболочки через PEGиляцию. Наконец, ¹³¹I графтировали на внешней поверхности наночастицы. TEM изображения указывали, что FA-PLP-¹³¹I наночастицы имели сферическую морфологию узкого распределения размера (165,6 до 181,2 нм), что подтверждалось динамическим рассеянием света (рис. 2a, b). Дзета-потенциал варьировал от −39,1 до −3,2 мВ (рис. 2c). UV-vis спектры свободного PTX и FA-PLP-¹³¹I (с той же концентрацией PTX) показывали ту же характерную пик при 233 нм (рис. 2d), указывая на то, что PTX был инкапсулирован в FA-PLP-¹³¹I и инкапсуляция не влияла на интенсивность поглощения PTX. После расчета инкапсуляционная эффективность PTX в FA-PLP-¹³¹I составляла 56,35 ± 1,6 %. Радиомаркировочная выход PTX-¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I и FA-PLP-¹³¹I составляли 45,6 ± 2,3, 52,1 ± 4,1, 48,9 ± 1,9, 56,3 ± 2,5 и 54,8 ± 2,7 соответственно.

Стабильность существенна для биомедицинского применения наночастиц. После 4 недель хранения FA-PLP-¹³¹I, растворенные в воде, клеточной среде, фетальной говяжьей сыворотке и PBS, не показывали изменений в среднем размере, дзета-потенциале, индексе PDI (рис. 3a–c), указывая на отличную стабильность и дисперсность. Кроме того, радиомаркировочная стабильность FA-PLP-¹³¹I детектировали в мышьей плазме при 37 °C (рис. 3d), показывая менее 15 % де-йодирования в течение 7 дней.

In vitro клеточный захват

Рисунок 4 показывает in vitro временнозависимую инкорпорирующую ¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I и FA-PLP-¹³¹I в клетках B16F10, измеренную гамма-счетчиком. FA-PLP-¹³¹I, а также FA-PL-¹³¹I, показывали более высокие инкорпорирующие значения, чем все протестированные временные точки, увеличивающиеся со временем. Инкорпорирующие значения FA-PLP-¹³¹I при 6 ч были в 3,12 и 23,4 раза выше, чем у ¹³¹I и PLP-¹³¹I, в согласии с результатами конфокальной лазерной сканирующей микроскопии клеток B16F10, инкубированных с флуоресцеинизотиоцианатом-маркированными FA-PLP-¹³¹I и PLP-¹³¹I наночастицами (Дополнительный файл 1: Рисунок S1). Эти результаты демонстрируют высокий клеточный захват FA-PLP-¹³¹I, вероятно, благодаря FA-медированному таргетирующему эффекту на клетках B16F10.

In vitro цитотоксичность

Цитотоксичность контрольных наноносцев PL-¹³¹I и FA-PL-¹³¹I тестировали MTT тестом. Клетки, обработанные PL-¹³¹I и FA-PL-¹³¹I на 24 ч, имели похожую жизнеспособность с контролем (рис. 5a), указывая на хорошую биосовместимость. Кроме того, FA-PLP-¹³¹I было намного более эффективным в подавлении пролиферации клеток B16F10, чем свободный PTX и PLP-¹³¹I при той же концентрации PTX (рис. 5b), указывая на отличную таргетированную химиотерапию. Результаты демонстрируют, что FA-PLP-¹³¹I имеет высокую химиотерапевтическую эффективность без радиотоксичности и цитотоксичности.

Изучение кровеносного циркулирования и биодистрибуции

Радиомаркировка сообщалась как более надежная, чем флуоресцентная визуализация, для количественного и точного in vivo отслеживания наночастиц. ¹³¹I-маркированные FA-PLP наночастицы приготовили для изучения их in vivo поведения, включая кровеное циркулирование и биодистрибуцию, измеряемые гамма-счетчиком. Полупериод выведения свободного PTX (t₁/₂ = 5,4 ± 0,23 ч) был продлен до 18,5 ± 0,5 ч FA-PLP-¹³¹I (рис. 6a) благодаря наночастице инкапсуляции, что было благоприятно для таргетированного опухолевого накопления. Далее, биодистрибуция свободного PTX-¹³¹I, PLP-¹³¹I и FA-PLP-¹³¹I в мышах с B16F10 опухолями на 1 день после инъекции изучалась (рис. 6b). FA-PLP-¹³¹I, а также FA-PL-¹³¹I, демонстрировали очевидное усиление опухолевого захвата, которое было в 4,41 и 12,8 раз выше, чем у PLP-¹³¹I и свободного PTX-¹³¹I соответственно, вероятно, благодаря продленному кровеносному циркулированию FA-PLP-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I и его FA таргетирующему эффекту. Кроме того, печень и селезенка также демонстрировали относительно высокий захват из-за их наночастицевого метаболизма, которые были нормальными метаболическими органами.

In vivo опухолевая химиотерапия

Мыши, обработанные свободным PTX, PLP-¹³¹I и FA-PLP-¹³¹I, демонстрировали ингибирование роста опухоли по сравнению с контрольной солевой группой (рис. 7a). В целом, FA-PLP-¹³¹I было наиболее эффективным в подавлении роста опухоли без рецидива по сравнению со всеми обработанными группами после примерно 40 дней лечения. Эти результаты ожидались, учитывая значительно продленное кровеное циркулирование FA-PLP-¹³¹I и, следовательно, его способность способствовать FA-медированному таргетированному опухолевому накоплению. Более того, таргетированное опухолевое накопление также привело к снижению периферического воздействия PTX, тем самым минимизируя системную токсичность. Как ожидалось, на протяжении всего процесса лечения не наблюдалось заметной потери массы тела (рис. 7b), и основные органы, включая сердце, печень, селезенку, легкие и почки, не показывали очевидных гистологических поражений в любой группе (рис. 7c).

Заключение

Подводя итог, мы синтезировали ¹³¹I-маркированные PLGA-липидные наночастицы как наноносцы лекарств для таргетированной химиотерапии меланомы. Измеряя радиоактивность ¹³¹I, in vitro и in vivo поведение FA-PLP-¹³¹I наночастиц было изучено. Полученные FA-PLP-¹³¹I показали отличную дисперсность, коллоидную и радиомаркировочную стабильность. Контрольные наноносцы PL-¹³¹I и FA-PL-¹³¹I также показали хорошую биосовместимость. После инкапсуляции PTX, FA-PLP-¹³¹I было наиболее эффективным в подавлении пролиферации клеток B16F10 без цитотоксичности, приписываемой FA таргетирующему эффекту. Более того, FA-PLP-¹³¹I продемонстрировало значительное продление кровеносного циркулирования PTX и эффективное накопление в таргетированной опухолевой области. Таким образом, FA-PLP-¹³¹I имело отличное ингибирование роста опухоли и великолепную in vivo биосовместимость. Результаты подчеркивают перспективный потенциал этих универсальных FA-PLP-¹³¹I наноносцев как надежных агентов отслеживания лекарств, а также их применение в таргетированной терапии опухолей.