PEG-модифицированные CdTe квантовые точки доставляют доксорубицин для таргетированного лечения экстрамедуллярного множественного миелома

Аннотация

Экстрамедуллярное множественное миелома (ЭММ) остается терапевтической проблемой, с высокодозной химиотерапией, дающей скромные выгоды выживания, часто компенсируемыми тяжелой системной токсичностью. В этом исследовании доксорубицин (DOX) инкапсулировали в полиэтиленгликоль-модифицированные кадмий-телурид квантовые точки (PEG-CdTe КТ), создавая наноносой, который усиливает внутриклеточное накопление лекарства и высвобождает DOX в pH-контролируемом режиме. In vitro PEG-CdTe-DOX выраженно повысил апоптоз в клетках миеломы PRMI8226 по сравнению со свободным DOX, и модулировал экспрессию ключевых апоптоз-ассоциированных белков. Эти результаты демонстрируют, что PEG-CdTe-DOX предлагает высокоселективную и потенциальную терапевтическую стратегию для пациентов с ЭММ.

Введение

Множественное миелома (ММ) — второе по частоте гематологическое злокачественное заболевание, характеризующееся клональной пролиферацией плазматических клеток в костном мозге. Хотя прогресс в химиотерапии и таргетированных агентах продлил общее выживание, подмножество пациентов с экстрамедуллярным заболеванием (ЭММ) продолжает иметь мрачный прогноз, с медианным выживанием менее шести месяцев после рецидива. Текущие терапевтические опции, включая талидомид и бортезомиб, дают ограниченную пользу для ЭММ, в то время как высокодозная химиотерапия может улучшить исходы, но часто непереносима из-за кардиотоксичности и подавления костного мозга.

Доксорубицин остается краеугольным камнем в терапии ММ; однако его клиническое применение ограничено доза-зависимыми побочными эффектами, особенно в пожилой популяции, составляющей большинство пациентов ММ. Наночастица-базированные системы доставки лекарств предлагают перспективное решение, удлиняя системное циркулирование, обеспечивая контролируемое высвобождение и концентрируя терапевтические агенты в опухолевых зонах, щадя здоровые ткани.

Кадмий-телурид квантовые точки (CdTe КТ) демонстрируют уникальные оптические свойства и могут быть функционализированы полиэтиленгликолем (PEG) для достижения «иммунного уклонения», снижая опсонизацию и удлиняя пребывание в крови. PEGилированные CdTe КТ показывали эффективную интернализацию через жидкостную эндоцитоз и высвобождение полезной нагрузки в ответ на кислые микросреды, типичные для опухолей. В этой работе мы изготовили PEG-CdTe-DOX наноконъюгат и оценили его физико-химические характеристики, pH-реактивное высвобождение лекарства, клеточное улавливание, цитотоксичность и индукцию апоптоза в человеческой ЭММ клеточной линии.

Материалы и методы

Материалы

PEG-CdTe КТ, набор Pierce™ бинхониновой кислоты (BCA) белкового анализа и доксорубицин (DOX) приобретены у Sigma-Aldrich, Dalian Meilun Biology Technology Co. и других поставщиков, перечисленных в оригинальной рукописи. PRMI-1640, FBS, Annexin V-FITC, CCK-8 и связанные реактивы получены от стандартных коммерческих источников. Антитела против Bax, Caspase-3, Bcl-2 и β-актина получены от Cell Signaling Technology. Аналитическая инструментация включала ТЭМ (Japan Electron Optics Laboratory), Zetasizer NanoZs (Malvern), HPLC (Jasco), Nikon C-2 конфокальный микроскоп, BD Accuri C6 флоуцитометр и Tanon 5200 ECL детекционную систему.

Подготовка PEG-CdTe-DOX

DOX адсорбировали на PEG-CdTe КТ через электростатические взаимодействия смешиванием равных объемов (100 мкл) 1 мг/мл PEG-CdTe и 1 мг/мл DOX в 800 мкл деионизированной воды, перемешиванием 100 об/мин 24 ч при 37 °C в темноте. Смесь центрифугировали (30 мин, 4 °C, 30000 об/мин) для сбора PEG-CdTe-DOX, который промывали дважды для удаления несвязанного DOX. Инкапсуляционная эффективность (EE) и лекарственная загрузка (DL) рассчитывались:

$$\text{DL}=\frac{\text{Вес лекарства в НЧ}}{\text{Вес НЧ}}\times 100\%$$

$$\text{EE}=\frac{\text{Вес лекарства в НЧ}}{\text{Начальный вес лекарства}}\times 100\%$$

Характеризация

Морфология PEG-CdTe и PEG-CdTe-DOX изучалась ТЭМ. Гидродинамические диаметры и распределения размеров измеряли динамическим рассеянием света (ДРС) в ФСБ. Для оценки pH-реактивного высвобождения PEG-CdTe-DOX (1 мг/мл DOX) диализировали (MWCO 3,5 кДа) против ФСБ при pH 5,0, 6,0, 7,4 и 8,0, с выборками каждые 2 ч в течение 24 ч. Концентрацию DOX квантовали спектрофотометрией на 450 нм.

Конфокальная флюоресцентная микроскопия

Клетки PRMI8226 инкубировали с PEG-CdTe, свободным DOX или PEG-CdTe-DOX 4 ч, фиксировали DAPI и обрабатывали Nikon C-2 конфокальным микроскопом. Длины волн излучения: DAPI 450 нм; DOX 585 нм.

Клеточная культура

Клеточные линии PRMI8226 и 293T поддерживали в RPMI-1640 и DMEM соответственно, с добавлением 10 % FBS, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 °C, 5 % CO₂.

Анализ живучести клеток

CCK-8 использовали для оценки живучести PRMI8226 и 293T клеток после обработки ФСБ, PEG-CdTe, свободным DOX или PEG-CdTe-DOX при различных концентрациях и временных точках. Живучесть клеток выражалась как (1 – ODₜ/OD_c) × 100 %.

Клеточное улавливание

Флоуцитометрия квантовала внутриклеточную DOX флюоресценцию в PRMI8226 клетках после 24 ч инкубации с разными формуляциями. Относительная флюоресцентная интенсивность (FI) рассчитывалась как FI_обработанные / FI_PEG-CdTe.

Апоптоз анализ

Клетки PRMI8226 окрашивали Annexin V-FITC и PI, затем анализировали флоуцитометрией для определения раннего и позднего апоптоза.

Вестерн блоттинг

Белковые экстракты из обработанных PRMI8226 клеток разделяли 10 % SDS-PAGE, переносили на PVDF мембраны и зондировали для Bax, Bcl-2, Caspase-3 и β-актина. Полосы визуализировали ECL и квантовали Image J.

Статистический анализ

Данные представлены как mean ± SD. Статистическая значимость оценивалась Стьюдента t-тестом, с *p* < 0,05 значимым. Эксперименты выполняли в трипликате.

Результаты

Характеризация PEG-CdTe-DOX

ТЭМ изображения подтверждают кристаллическое ядро и равномерную дисперсию PEG-CdTe и PEG-CdTe-DOX (Рис. 2a,b). ДРС анализ показывает гидродинамические диаметры 8,20 нм для PEG-CdTe и 78,31 нм для PEG-CdTe-DOX (Рис. 2c). EE и DL составляли 77,20 % ± 1,12 % и 42,12 % ± 0,98 % соответственно (Рис. 2e). дзета-потенциалы –20,12 ± 2,45 мВ (PEG-CdTe) и –10,50 ± 1,26 мВ (PEG-CdTe-DOX).

Исследования высвобождения лекарства демонстрируют pH-триггерируемый профиль: ~92,5 % DOX высвобождается при pH 5,0 и 88 % при pH 6,0 в течение 24 ч, тогда как высвобождение заметно медленнее при физиологическом pH 7,4 и 8,0 (Рис. 2d). Это поведение обеспечивает предпочтительное высвобождение DOX в кислой микросреде опухоли.

Характеристики PEG-CdTe и PEG-CdTe-DOX. Примечания: a, b ТЭМ изображения; c ДРС; e EE и DL; d pH-зависимое высвобождение; f живучесть 293T клеток после воздействия PEG-CdTe.

Конфокальное изображение подтверждает надежную внутриклеточную доставку DOX PEG-CdTe-DOX, с заметно более высокой красной флюоресценцией в PRMI8226 клетках по сравнению со свободным DOX (Рис. 3).

Клеточное улавливание и цитотоксичность PEG-CdTe-DOX In Vitro

Флоуцитометрия раскрывает значительный рост внутриклеточной DOX флюоресценции в PEG-CdTe-DOX-обработанных клетках против свободного DOX (*p* < 0,01; Рис. 4a). CCK-8 анализы демонстрируют время-зависимую ингибицию живучести PRMI8226: 58 %, 70 % и 85 % на 24, 48 и 72 ч соответственно, превосходя эффект свободного DOX (*p* < 0,05). Важно, PEG-CdTe в одиночку не влияет на живучесть клеток, подчеркивая его биосовместимость. 293T клетки остаются незатронутыми при эквивалентных концентрациях PEG-CdTe, подтверждая селективную цитотоксичность к миеломным клеткам (Рис. 4b).

Флюоресцентные микроскопические изображения PRMI8226 клеток после воздействия PEG-CdTe, свободного DOX или PEG-CdTe-DOX. Красная флюоресценция указывает на доставку DOX (шкала: 50 мкм).

Средняя флюоресцентная интенсивность (a) и CCK-8 ингибиция роста (b) PRMI8226 клеток, обработанных ФСБ, PEG-CdTe, свободным DOX и PEG-CdTe-DOX.

Апоптоз PRMI8226 клеток

Annexin V/PI окраска показывает выраженный рост апоптотических клеток в группе PEG-CdTe-DOX (66,5 %) против свободного DOX (34,1 %) и контрольных (≤ 7 %) (Рис. 5). Эта значимая разница (*p* < 0,01) указывает, что PEG-CdTe-DOX усиливает апоптоз через механизм, зависящий от доставки.

Скорости апоптоза PRMI8226 клеток под разными обработками.

Вестерн блоттинг

Вестерн блот анализ раскрывает урегулирование про-апоптотического Bax и Caspase-3, и даунрегулирование анти-апоптотического Bcl-2 в PEG-CdTe-DOX-обработанных клетках относительно свободного DOX (Рис. 6). Выраженный сдвиг в Bax/Bcl-2 отношении подтверждает активацию митохондриального апоптотического пути.

Экспрессия апоптоз-связанных белков в PRMI8226 клетках.

Обсуждение

Низкая переносимость высокодозной химиотерапии — главный барьер к эффективному лечению ЭММ. Наш PEG-CdTe-DOX наноносой обходит это ограничение, доставляя DOX селективно к миеломным клеткам, достигая более высоких внутриклеточных концентраций, щадя нормальные ткани. Высокая EE (≈77 %) и DL (≈42 %) обеспечивают эффективную загрузку лекарства. PEGилирование придает стелс-свойства, снижая опсонизацию и удлиняя системное циркулирование, в то время как наномасштабный размер (~78 нм) позволяет усиленную проницаемость и удержание (EPR) в опухолевой ткани.

Кислая микросреда опухоли (pH 5–6) триггерит быстрое высвобождение DOX из PEG-CdTe-DOX, как демонстрируют кинетика высвобождения. Это локализованное высвобождение максимизирует цитотоксичность там, где нужно, и ограничивает системное воздействие, тем самым митигируя кардиотоксичность и подавление костного мозга — частые ограничения конвенциональной DOX терапии. In vitro PEG-CdTe-DOX произвело превосходную ингибицию роста и апоптоз в PRMI8226 клетках, сопровожденную сдвигом в Bax/Bcl-2 балансе и активацией Caspase-3, подтверждая вовлечение митохондриального пути.

Эти находки согласуются с предыдущими отчетами, что PEGилированные квантовые точки усиливают опухолевый таргетинг и снижают офф-таргет эффекты. Важно, PEG-CdTe в одиночку демонстрировал пренебрежимую цитотоксичность, подчеркивая его пригодность как лекарственного носителя. Будущие in vivo исследования необходимы для подтверждения фармакокинетики, биодистрибуции и терапевтической выгоды в животных моделях ЭММ.

Заключение

Мы успешно спроектировали PEG-модифицированную CdTe квантовую точечную систему, которая эффективно загружает и доставляет доксорубицин к клеткам экстрамедуллярного множественного миелома. Наноконъюгат достигает мощного, pH-триггерируемого высвобождения лекарства, усиливает апоптоз через митохондриальный путь и сохраняет живучесть нормальных клеток, предлагая перспективную платформу для более безопасной, более эффективной терапии ЭММ.

Аббревиатуры

DAPI

4′,6-диамидино-2-фенилиндол

DL

Лекарственная загрузка

DOX

Доксорубицин

EE

Инкапсуляционная эффективность

EMM

Экстрамедуллярное множественное миелома

FCM

Флоуцитометрия

HPLC

Высокоэффективная жидкостная хроматография

MM

Множественное миелома

PBS

Фосфатно-буферный салиновый раствор

PEG-CdTe-DOX

Полиэтиленгликоль-модифицированные кадмий-телурид квантовые точки, загруженные доксорубицином

SDS/PAGE

Натрия додецилсульфат полиакриламидный гель электрофорез

TEM

Трансмиссионная электронная микроскопия