Доступные зеленые флуоресцентные углеродные точки: улучшенная биовизуализация и целевая доставка лекарств

Аннотация

Подготовлены углеродные точки с доxorубицином (DOX-CDs) для биовизуализации и усиленной внутриклеточной доставки лекарства. CDs синтезированы гидротермальным методом из цитрата и мочевины при 200 °C в течение 1 ч. DOX успешно конъюгирован на CDs через физико-химические взаимодействия. DOX-CDs демонстрируют хорошую кристаллическую структуру, выдающуюся водную стабильность, отличные фоtolюминесцентные свойства и высокий квантовый выход 93%. Флуоресцентные изображения показывают, что DOX-CDs легко захватываются раковыми клетками для маркировки. Наблюдается pH-зависимое высвобождение DOX в эндо-лизосомах, цитотоксичность подтверждена MTS-тестом на клетках рака яичника HO-8910. CDs дают яркий флуоресцентный сигнал в in vivo визуализации и низкую токсичность после 7 и 21 дня администрирования. Подготовленные CDs — перспективные зонды для биомедицинской визуализации и внутриклеточной доставки лекарств.

Введение

Доксорубицин (DOX) — антрациклиновый химиотерапевтик, широко применяемый при лечении рака молочной железы, легких, желудка, яичника, щитовидной железы, мультипеломы, сарком и детских онкологий. Механизм действия — интерференция с синтезом и репарированием ДНК. DOX должен проникнуть через клеточную мембрану в ядро для нарушения ДНК-синтеза. Однако свободный DOX трудно достигает ядра и вызывает тяжёлую кардиотоксичность in vivo, ограничивая применение.

Мультифункциональные наноносчики (липосомы, мицеллы, наноэмульсии, полимерные наночастицы) привлекают внимание для доставки антиопухолевых препаратов. Среди них углеродные квантовые точки (CDs) — новое семейство квантовых точек, открытое в 2004 г., вызывают огромный интерес. Флуоресцентные CDs предпочитают для клеточной визуализации, фотокатализа, доставки лекарств, детекции загрязнителей и ионов тяжелых металлов, фотоэлектрических приборов благодаря превосходным свойствам: квазинулевой вес и размер (<10 нм), высокая фотостабильность, широкие и непрерывные спектры возбуждения, настраиваемая длина волны, биосовместимость, низкая токсичность, отличная флуоресценция. Янг и соавт. успешно конъюгировали DOX с CDs для усиленной антиопухолевой терапии, показывая значение CDs для ядерно-таргетированной доставки.

Ранее предлагались различные методы синтеза CDs: биомассовые материалы, карбонизация, пассивация, поверхностная функционализация. Классификация: «верх-вниз» (дуговая разрядка, лазерная аблиция, электрохимическое травление, оксидация — разрушение крупномасштабных углеродных структур на наночастицы) и «низ-вверх» (синтез из молекулярных предшественников: гидротермальный, ультразвуковой, волновой). Сюй и соавт. получали CDs дуговой разрядкой, оксидацией, экстракцией, гель-электрофорезом. Мин и соавт. — электролизом. Янг оптимизировал гидротермальный метод для CDs с разной флуоресценцией. Однако эти методы ограничены сложным синтезом, длительностью, строгими требованиями, дорогими сырьём. Органические растворители-пассиваторы повышают токсичность CDs. Большинство CDs светятся синим под UV, что мешает биомедицинской визуализации из-за сильной автофлуоресценции тканей.

Здесь синтезированы зелёные флуоресцентные CDs «зелёным» и эффективным одношаговым контролируемым термическим пиролизом цитрата натрия дигидрата и мочевины. DOX нековалентно конъюгирован на поверхность CDs для доставки через гидрофобное, электростатическое и π-π стакинг взаимодействия. Морфология и структура — ТЭМ и рентгеновская дифракция. Оптические свойства — UV-Vis и фоtolюминесценция (PL). Устойчивое высвобождение — диализ. Клеточный захват и внутриклеточное распределение — флуоресцентная микроскопия. Антираковый эффект — MTS. In vivo визуализация — на голых мышах Balb/c. Долгосрочная токсичность — гистологический анализ. Подготовленные CDs — потенциальные агенты для in vivo визуализации и таргетированной доставки.

Материалы и методы

Материалы

Цитрат натрия дигидрат, мочевина, L-аргинин, этилендиамин ацетон, сульфат хинина, PBS, уксусная кислота, фосфат динатрия, параформальдегид — Sinopharm. MTS, DMEM/высокий глюкоза, пенициллин-стрептомицин, трипсин-EDTA — Beyotime. FBS — Tianhang. Клетки HO-8910 (раковый яичник) и EA.hy926 (эндотелий пуповины) — Шанхайский институт питания и здоровья КНА. DOX·HCl — Sigma-Aldrich. Диализационные мешки (MWCO 1000 Da) — SpectrumLabs.

Синтез CDs и DOX-CDs

Цитрат натрия дигидрат (0,2 ммоль) и мочевина (5 ммоль) растворили в 1 мл ДИ воды. Смесь в стеклянный сосуд, карбонизация 200 °C, 1 ч. Затем 1 мл ДИ воды и ацетон (v/v 1/3), центрифугация 10000 об/мин, 10 мин, 3 раза.

DOX конъюгировали нековалентно. DOX·HCl (0,5 мг) добавили к 5 мл CDs (5 мг/мл), перемешивали 48 ч в темноте. Диализ против ДИ воды в мешке (MWCO 1000 Da) 24 ч — DOX-CDs. Сушкой вакуумной сублимацией, хранение при 4 °C.

Характеризация CDs и DOX-CDs

Размер и морфология — ТЭМ (FEI Tecnai G2 Spirit). PL-спектры — LS55 (PerkinElmer). Квантовый выход (QY) — по хининусульфату в H₂SO₄. Кристаллическая структура — Bruker Tensor27 ФТИР (Pike Corporation). XPS — ESCALAB250Xi (Thermo). Зета-потенциал — Malvern Panalytical.

In vitro изучение высвобождения лекарства

Диализационный мешок с DOX-CDs в PBS (pH 7,4 и 5,0), шейкер-инкубатор (37 °C, 100 об/мин). В заданные моменты отбирали 0,5 мл, заменяли тем же объёмом PBS. Высвобождённый DOX — по интенсивности флуоресценции при 590 нм.

In vitro цитотоксичность

MTS на HO-8910 и EA.hy926. Посев 0,5×10⁵ клеток/мл в 96-колодчатую пластинку, 24 ч для адгезии. DOX-CDs при разных концентрациях, 24 ч инкубация. Замена среды, 90 мкл среды + 10 мкл MTS, 4 ч. Абсорбция 490 нм (BioTek Epoch). Жизнеспособность в % от контрольных клеток, среднее из трёх измерений.

In vitro клеточная визуализация

HO-8910 в 6-колодчатую пластинку, 37 °C, 24 ч. Инкубация с DOX-CDs для захвата. 4 ч, удаление среды, 3-х кратная промывка холодным PBS, фиксация 4% параформальдегидом 10 мин. Морфология и флуоресцентное распределение — флуоресцентный микроскоп (Leica).

In vivo визуализация

Эксперiments одобрены Комитетом по уходу за животными Сычжуанского мед. университета. Голы мыши Balb/c. Подкожно вводили водный раствор CDs (50 мкл, 6 мг/мл) в точку инъекции после внутрибрюшинной анестезии 2% пентобарбиталом. Биораспределение — внутривенно хвостовой вене (5 мг/кг). Органы (сердце, почки, селезёнка, печень, мочевой пузырь) собирали в разные временные точки для флуоресцентной оценки. Визуализация — Tanon-5200Multi Gel, экспозиция 1,0 с.

In vivo токсичность

Мыши Куньминь (самки, 7 недель). Две группы: CDs и контроль. Внутривенно хвостовой вене PBS и CDs (6 мг/кг). Основные органы (сердце, лёгкие, почки, печень, селезёнка) собирали через 7 и 21 день. Фиксация 4% параформальдегидом, срезы, окраска гемоксилином и эозином (H&E). Оптическая микроскопия (Leica).

Результаты и обсуждение

Характеризация CDs и DOX-CDs

CDs одношаговым методом из цитрата дигидрата и мочевины (1/25) при 200 °C, 1 ч. DOX ковалентно конъюгирован на поверхность (схема 1). ТЭМ (рис. 1а): равномерные сферические CDs, средний диаметр 2,75 нм, узкое распределение. Высокоразрешающее ТЭМ (вставка) — хорошая кристалличность, заметные решёточные фринге.

ФТИР (рис. 1d): острые пики 3499 см⁻¹ (–OH) и 1729 см⁻¹ (–COOH); 780 и 1372 см⁻¹ — N–H. На поверхности CDs есть карбоксильные и амино группы — модификация биомакромолекул для дальнейших применений.

Оптические свойства UV-Vis и PL (рис. 1c): CDs — пик абсорбции 410 нм, DOX — 500 нм. DOX-CDs сохраняют оба пика — успешная конъюгация. Вставка рис. 1c: DOX-CDs водный раствор — светло-жёлтый прозрачный при обычном свете, ярко-зелёный под UV. Квантовый выход 93% (эталон хининусульфат QY=54%). При возбуждении 340–440 нм PL-пик почти не смещается — независимая от возбуждения эмиссия. Макс. длина волны возбуждения 400 нм, PL-пик 525 нм. Независимость от возбуждения — однородные поверхностные состояния CDs.

Элементный состав XPS (рис. 1f): C (78,39%), N (7,52%), O (14,1%). Пики C1s, N1s, O1s при 284,8, 399,5, 532,6 эВ. C1s — три пика: 284,8 (C–C), 286,7 (C–N, C–O), 288,3 эВ (C=O). N1s — 399,5 эВ (C–N). O1s — C=O (531,9) и C–O (532,6 эВ).

Флуоресцентная интенсивность стабильна при 4 °C и комнатной температуре (рис. S2А). Падение <10% за 2 недели при 4 °C — пренебрежимо. Ожидается длительная стабильность для биомедицинской визуализации.

PL интенсивность падает при pH >10 или <3, стабильна при pH 3–10 (рис. S2B). Биомаркинг/биовизуализация требуют ко-инкубации с клетками при pH ~6–8 — гарантированная PL стабильность в клетках.

Антифотоблекинг тест (рис. S2C): CDs превосходят квантовые точки (CdTe) и традиционные красители (DAPI) по интенсивности и стойкости к фотоблекингу. CDs хорошо диспергируются в ДИ воде, PBS, FBS, DMEM, CM1-1 (рис. S3) — отличная стабильность в кровеносной системе.

Зета-потенциал CDs –31,1 мВ (рис. S4) — из-за кислородных и карбоксильных групп. Положительно заряженный DOX физически адсорбируется через электростатическое взаимодействие с карбоксилом и гидрофобное. DOX-CDs — –9,7 мВ, подтверждает комплексацию. sp²-углеродная сеть CDs загружает ароматическую структуру DOX через сильные π-π взаимодействия. Оптимальная эффективность инкапсуляции и загрузки при разных концентрациях DOX (рис. S5): макс. инкапсуляция 50,82%, загрузка 6,82% при 0,1 мг/мл DOX.

In vitro высвобождение DOX из DOX-CDs

pH-зависимое высвобождение в PBS. Инкубация при pH 7,4, 6,0, 5,0, мониторинг высвобождения. Рис. 2: устойчивые профили высвобождения во всех pH. Только 13% DOX высвобождается за 8 ч при pH 7,4. При pH 6,0 — >35%, при pH 5,0 — >65% — чувствительность к низкому pH. Количество высвобождённого DOX растёт при понижении pH, из-за повышенной протонировки –NH₂ групп DOX в кислой среде. DOX-CDs предотвращают преждевременную утечку DOX в кровотоке и усиливают внутриклеточное высвобождение — великая польза для эффективной ракотерапии.

In vitro цитотоксичность

Биосовместимость критична для биомедицинских применений. Цитоксичность CDs при разных концентрациях на HO-8910 и EA.hy926. Рис. 3а: обе линии сохраняют высокую жизнеспособность >85% даже при 5 мг/мл — отличная биосовместимость, низкая цитотоксичность CDs.

С DOX: DOX-CDs показывают DOX-концентрационно-зависимую жизнеспособность HO-8910. Рис. 3b: жизнеспособность DOX-CDs значительно ниже, чем свободных CDs, особенно при DOX >0,05 мг/мл — отличный антиопухолевой эффект.

In vitro клеточный захват и маркировка

Внутриклеточный захват DOX-CDs на HO-8910. Рис. 4: яркие зелёная (CDs) и красная (DOX) флуоресценция внутри клеток. Интенсивный зелёный сигнал преимущественно в цитоплазме — внутриклеточное распределение CDs. Красный сигнал сильнее в ядрах — DOX отсоединяется от CDs и мигрирует в ядра благодаря высокой аффинности к ДНК. Объяснение: низкий pH (5,0) в эндосомах и лизосомах ассистирует высвобождение DOX из DOX-CDs. DOX-CDs — перспективные агенты для клеточной маркировки и внутриклеточной доставки.

In vivo животная визуализация

Голая мышь подкожно: CDs (50 мкл, 6 мг/мл). Анестезия 1% пентобарбитал внутрибрюшинно. Визуализация Tanon-5200Multi Gel при возбуждении 488 нм, эмиссионный фильтр 535 нм. Рис. 5а: сильная зелёная флуоресценция в точке инъекции — флуоресценция CDs эффективно проникает сквозь кожу и ткани мыши. Мышь оставалась здоровой — отличная биосовместимость и низкая токсичность. CDs — выдающиеся люминесцентные зонды для биообразования in vitro и in vivo.

Биораспределение и экскреция — внутривенно хвостовой вене. В разные моменты (0, 0,5, 1, 3 ч) органы для флуоресцентной визуализации. Рис. 5b: почки и мочевой пузырь — гораздо сильнее флуоресценция, чем сердце, селезёнка, печень. Флуоресценция в почках резко возрастает за 0,5 ч, постепенно падает после 1 ч. В мочевом пузыре растёт от 0,5 до 1 ч — CDs транспортируются из почек в пузырь. CDs экскретируются и клиренсуются почечно-пузырной системой.

In vivo долгосрочная токсичность

Полное изучение потенциала для клинических исследований. Куньминь мыши внутривенно: PBS и CDs. Органы через 7 и 21 день для гистологии. Микроскопия для оценки патологических различий. Рис. 6: никаких заметных повреждений органов и воспалительных поражений в основных органах мышей, получивших CDs. CDs безопасны для клинического использования и in vivo исследований. Синтезированные зелёные CDs биосовместимы как биомаркеры и зонды биообразования.

Заключение

Демонстрирована дешёвая подготовка зелёных флуоресцентных CDs с высоким QY 93% для биообразования и усиленной внутриклеточной доставки. DOX успешно конъюгирован на CDs — DOX-CDs с хорошей кристалличностью, водной стабильностью, отличной фоtolюминесценцией. DOX-CDs реагируют на внутриклеточный pH, способствуя кислотно-триггерному высвобождению. Благодаря pH-чувствительности DOX-CDs эффективно ингибируют пролиферацию HO-8910. Отличная клеточная маркировка и ответ на эндо/лизосомальный pH для высвобождения DOX в клетках. CDs — флуоресцентные зонды in vitro и in vivo. Гистологический анализ: нет заметного токсического эффекта у мышей, получивших CDs. CDs дешёвым методом имеют большой потенциал в биомедицинской визуализации и внутриклеточной доставке лекарств.

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе исследования, включены в опубликованную статью и её дополнительные файлы.

Аббревиатуры

CDs:

Углеродные точки

DOX:

Доксорубицин

DOX-CDs:

Доксорубицин-содержащие углеродные точки

FBS:

Сыворотка фетового теленка

MTS:

Набор для колориметрического анализа пролиферации клеток MTS

PBS:

Фосфатно-буферная соленая среда

QY:

Квантовый выход

ТЭМ:

Проходная электронная микроскопия

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия