Стабильные каркасы из карбонных точек с высокой антибактериальной эффективностью

Аннотация

Карбонные точки (КТ) широко применяются как антимикробные средства благодаря своей активной поверхности, однако некоторые КТ страдают от нестабильности. Поэтому такие приложения, как антибактериальная активность, могут быть ненадежными для длительного использования. В данной работе мы синтезировали КТ с синей флуоресценцией гидротермальным методом. Затем полиэтиленимин использовался для сборки КТ в каркасы на основе карбонных точек (КТК). КТК продемонстрировали подавленную флуоресценцию, но показали более стабильные свойства согласно данным растерного электронного микроскопа и измерений дзета-потенциала. Как КТ, так и КТК проявляют антибактериальную активность по отношению к грамотрицательной Escherichia coli (E. coli) и грамположительной Staphylococcus aureus (S. aureus), однако КТК демонстрируют лучшую антибактериальную эффективность: S. aureus полностью подавляется при минимальном ингибирующем концентрации 30 мкг/мл. Это показывает, что КТК одновременно повышают и стабильность, и антибактериальную активность, что делает их более перспективными для практических применений.

Введение

Бактериальные инфекции представляют серьезную угрозу для человеческой жизни, и разработка эффективных средств для дезинфекции бактерий является насущной задачей [1]. Различные антибиотики используются для лечения бактериальных инфекций, но их чрезмерное применение вызывает побочные эффекты и проблему лекарственной устойчивости [2]. Наноматериалы, включая антимикробные полимеры [3], металлические наноматериалы [4] и углеродные наноматериалы [5, 6], рассматриваются как альтернатива классическим антибиотикам [7]. Проблемы устойчивости и токсичности частично решаются [8]. В последнее время карбонные точки (КТ) [9, 10] и нанокластеры (НК) [11] успешно применяются для борьбы с бактериальными инфекциями благодаря своей биосовместимости [12], активности [13] и возможности легкого удаления из организма за счет ультрамалых размеров [14, 15]. Особенно установлено, что КТ обладают отличной способностью к захвату свободных радикалов, которая может превосходить многие традиционные противовоспалительные препараты [16,17,18]. Однако некоторые ультрамалые антимикробные средства страдают от низкой стабильности из-за большой окислительной поверхности [19]. Остребуется разработка более эффективных антибактериальных агентов для длительного использования.

Для удовлетворения требований практических применений антимикробные средства должны обладать следующими характеристиками: (а) отличная стабильность, сохраняющаяся в течение определенного времени в окружающей среде; (б) высокая биосовместимость и низкая токсичность; (в) высокая антибактериальная активность. Крупные наноматериалы, как правило, более стабильны, но могут иметь более слабую антибактериальную активность из-за меньшей активной поверхности. Учитывая недостатки малых и крупных наноматериалов, мы сообщаем о сборке малых КТ в крупные КТК простым добавлением полиэтиленимина (ПЭИ) (Рис. 1). КТ не сливались, а сохраняли свою морфологию в качестве строительных блоков. Таким образом, целые КТК имели большие размеры, но демонстрировали превосходную стабильность без потери активных свойств КТ. Кроме того, мы обнаружили, что КТК проявляют усиленную антибактериальную активность против грамотрицательной E. coli и грамположительной S. aureus по сравнению с КТ, что свидетельствует о их широком спектре действия, тогда как многие КТ эффективны только против грамположительных бактерий [20]. Дополнительно КТК стимулировали пролиферацию клеток PC12 (клеточная линия, полученная из феохромоцитомы надпочечника крысы), что указывает на их потенциал для применений в восстановлении нервов [21]. Данная работа показывает, что сборка малых КТ в крупные КТК не только повышает стабильность, но и усиливает антибактериальную активность.

Материалы и методы

Материалы и приборы

Рентгеновские фотоэлектронные спектры поверхности (XPS) записывались на приборе ESCALAB250Xi. Передаточная электронная микроскопия (ТЭМ) выполнялась на микроскопе JEM-2100 при 200 кВ. Флуоресценция материалов измерялась на спектрфлюорометре F97. Окрашивание бактериальных клеток FDA/PI регистрировалось в режиме таппинга на микроскопе Leica DFC450C. Время жизни флуоресценции измерялось на системе подсчета одиночных фотонов, коррелированных во времени (TCSPC), с использованием спектрфлюорометра Nanolog (Horbia JY, Япония). УФ-видимые спектры получались на приборе UV-1600. Изображения бактерий наблюдались на конфокальном микроскопе (Olympus FLUOVIEW FV1000 c). Все реактивы были аналитическогоgrades. В опытах использовалась деионизированная вода. Набор для подсчета клеток-8 получен от Beyotime Biotechnology.

Подготовка КТ и КТК

L-цистеин (1,0 г) растворили в 10,0 мл деионизированной воды и тщательно перемешали. Затем pH раствора отрегулировали до 9,0 с помощью 1,0 М NaOH. Раствор перенесли в гидротермальный реактор и нагревали при 160 °C в течение 24 ч. После охлаждения до комнатной температуры полученный раствор подвергли диализу с использованием диализационного мешка (MW 7000 cut off) в течение одного дня. Полученные КТ использовали для последующих характеристик и экспериментов. Для приготовления КТК к 1 мл КТ добавили 40 мкл 1% ПЭИ. Смесь выдерживали 1 ч. Продукт очищали диализом тем же методом, что и КТ. Для ХР-ТЭМ образцы концентрировали в малый объем, переносили на силикагелевую колонку и элюировали метанолом и дихлорметаном для получения более очищенных продуктов.

Оценка токсичности

Клетки PC12 посеяли в 96-колончатых пластинках на 12 ч, затем инкубировали с КТ и КТК различных концентраций. Число живых клеток определяли с помощью анализа набора Cell Counting Kit-8 (CCK-8). 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид (MTT) (5 мг/мл в ФСБ) добавляли в 1/10 объема культуры, и клетки возвращали в инкубатор. После этого супернатант удаляли, и в каждую ячейку добавляли 200 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Кристаллы растворяли встряхиванием пластинок в течение 10 мин. Абсорбцию на 490 нм измеряли на микрочитчиталке (Varioskan LUX Multimode Reader). Пустые контрольные колодцы включались во все измерения абсорбции.

Антибактериальные эксперименты

E. coli и S. aureus инкубировали в отсутствии и присутствии КТ и КТК при 37 °C с встряхиванием 250 об/мин. Рост бактериальных клеток в среде LB измеряли на микрочитчиталке на длине волны 600 нм (OD600). Среда LB использовалась как пустой контроль. OD600 отражает плотность клеток, а относительная жизнеспособность рассчитывалась путем сравнения культивированных бактериальных клеток в присутствии материалов с контрольной группой (OD600 бактериальных клеток в отсутствии КТ или КТК). Живые/мертвые бактерии оценивали по протоколу окрашивания FDA/PI [22].

Обнаружение реактивных форм кислорода (РФК)

Внутриклеточное образование РФК измеряли в бактериальных клетках до и после обработки КТ и КТК в течение 12 ч с помощью зонда 2′,7′-дихлорфлуоресциндацетата (DCFH-DA) согласно инструкции. Флуоресценция детектировалась на длине волны излучения 525 нм при возбуждении 488 нм.

Результаты и обсуждение

Характеризация материалов

Исследование размеров

На рис. 2 показаны СЭМ порошка КТК с относительно низким (рис. 2a0) и высоким увеличением (рис. 2b0) после экспозиции в воздухе в течение нескольких часов. Видно, что КТК хорошо распределены и имеют средний размер около 25 нм. КТ, судя по данным ТЭМ и АФМ (Дополнительный файл 1: Рисунок S1), должны были показывать монодисперсные малые размеры, но эти малые частицы демонстрировали агрегацию при наблюдении СЭМ после экспозиции в воздухе (Дополнительный файл 1: Рисунок S2). С другой стороны, КТК сохраняли свою морфологию даже после воздействия окружающей среды. Это указывает на то, что полученные КТК более перспективны для практических применений. КТК дополнительно характеризовали ТЭМ (рис. 2b1). Видно, что КТК имеют структуры сборки с малыми КТ в качестве строительных блоков. Анализ высокого разрешения ТЭМ (ХР-ТЭМ) (рис. 2b2) показал, что строительные блоки КТК демонстрируют решетчатые периодичности с d-расстоянием 0,21 нм, соответствующие плоскости решетки (100) графита, что похоже на классические КТ [23,24,25]. Следовательно, сборка КТ в КТК не приводит к потере свойств КТ, что позволяет объединить преимущества как целых крупных каркасов, так и внутренних малых строительных блоков.

Дзета-потенциал

Исследования дзета-потенциала использовались для измерения степени электростатического отталкивания КТ и КТК между смежными заряженными частицами в дисперсной системе (Рис. 3). Видно, что пик дзета-потенциала КТ не был четко выражен после экспозиции в окружающей среде. Кроме того, получались множественные пики дзета-потенциала с большими отклонениями (Таблица 1), что указывает на то, что КТ были довольно нестабильны и неповторимы. С другой стороны, пик дзета-потенциала для КТК был сосредоточен в относительно стабильном диапазоне. Мы также получали значительно меньшие отклонения дзета-потенциала на основе трех измерений, что свидетельствует о более высокой стабильности КТК и более высокой чистоте дисперсных систем.

Флуоресцентные свойства

Спектры флуоресцентной эмиссии использовались для мониторинга процесса сборки КТ в КТК (Рис. 4). При титровании ПЭИ флуоресцентная эмиссия на 350 нм постепенно гаснула (Рис. 4a). Однако значимого смещения флуоресцентных спектров не наблюдалось, что указывает на отсутствие агрегации. Структура сборки КТК меняет общий размер КТ, что влияет на флуоресценцию. Кроме того, близко расположенные КТ гасят флуоресценцию друг друга. Поверхностная химия также играет важную роль в флуоресцентных свойствах. Атомы азота и серы на поверхности КТ могут создавать энергетические ловушки. Яркая флуоресценция КТ обусловлена дефектной поверхностью с множеством карбонильных и аминогрупп. После функционализации ПЭИ поверхность КТК доминировала аминогруппами, которые вместе с увеличением размеров гасили флуоресценцию. Сравнение флуоресцентного поведения КТ и КТК дополнительно изучали методом TCSPC для понимания путей рекомбинации фотогенерированных зарядов (Рис. 4b). Эмиссия регистрировалась на 430 нм. Затухание флуоресценции требовало двухкомпонентной экспоненциальной аппроксимации. Константы времени и относительные амплитуды подобраны и суммированы в Таблице S1. Видно, что время жизни доминирующей компоненты для КТ составляло 2,45 нс, а другой компоненты — 7,47 нс. С другой стороны, время жизни доминирующей компоненты для КТК было 1,98 нс, а другой компоненты — 7,30 нс. Значимых изменений времени жизни между КТ и КТК не наблюдалось, что также указывает на то, что свойства КТ не менялись существенно при сборке в КТК [26].

Токсичность

Для оценки безопасности материалов исследовали токсичность КТ и КТК по отношению к клеткам PC12. Анализы MTT проводили для изучения влияния материалов на жизнеспособность клеток (Рис. 5). После инкубации PC12 с КТ и КТК жизнеспособность клеток не менялась существенно в течение 24 ч. Интересно, что оба углеродных материала стимулировали пролиферацию PC12, что играет важную роль в терапии повреждений нервов. Эти результаты указывают на низкую токсичность материалов и их перспективность для нейропротекции с участием клеток PC12 [27].

Антибактериальные исследования

Антибактериальная активность КТ и КТК первоначально оценивали путем измерения бактериальной плотности в присутствии этих агентов на 600 нм [28]. Рис. 6 показывает существенное антибактериальное действие как КТ, так и КТК против S. aureus и E. coli. Особенно, жизнеспособность клеток S. aureus была почти нулевой при использовании более 30 мкг/мл КТК. Аналогично, клетки E. coli дезинфицировались как КТ, так и КТК. КТ показывали множественные заряды (Рис. 3a). С другой стороны, КТК имели незначительные заряды (Рис. 3b), что может подавлять бактериальную адгезию при слабом отталкивании и тем самым облегчать взаимодействие с бактериальной поверхностью. В сравнении, КТК демонстрируют более высокую антибактериальную активность, так как большая доля клеток погибает при использовании более 6 мкг/мл материалов. Усиленная антибактериальная активность КТК, возможно, обусловлена синергетическим эффектом КТ как строительных блоков, а также более стабильными поверхностными зарядами. Для глубокого понимания антибактериального механизма измеряли РФК, которые могут окислять нефлуоресцирующий DCFH в флуоресцирующий DFC (Рис. 6c). Оба углеродных материала не индуцировали значимого образования РФК после обработки E. coli. Однако КТК значительно усилили внутриклеточное образование РФК при взаимодействии с S. aureus. Поскольку РФК могут повреждать бактериальную ДНК, РНК и белки, усиленное значение способствовало дезинфекции бактерий. Кроме того, образование РФК стимулировалось H₂O₂. Стоит отметить, что образование РФК драматически возрастало по сравнению с обработкой только H₂O₂, при этом КТК показывали наибольшее усиление. Это указывает на то, что комбинация H₂O₂ с этими двумя углеродными материалами может еще больше усилить антибактериальную активность, особенно для КТК.

Некоторые КТ ранее сообщались для дезинфекции S. aureus, они перечислены в Таблице 2 для сравнения. Текущие КТК показывают конкурентоспособную МИК. Кроме того, вместо простого снижения жизнеспособности изучаемых клеток, КТК стимулировали пролиферацию PC12, что свидетельствует о их универсальности при лечении бактериальных инфекций.

Целостность бактериальной мембраны после обработки КТ и КТК исследовали экспериментом живого/мертвого окрашивания (Рис. 7). Зеленая флуоресценция FDA окрашивает только живые клетки, в то время как красная флуоресценция PI специфически окрашивает мертвые бактерии с поврежденными мембранами, но живые с неповрежденными мембранами остаются неокрашенными [30, 31]. Как показано на флуоресцентных изображениях, явная красная флуоресценция наблюдалась в образцах, обработанных КТ, а гораздо более высокая плотность мертвых клеток видела в образцах, обработанных КТК.

Основываясь на вышеприведенных сравнениях, мы заключаем, что КТK перспективны для уничтожения как грамположительных, так и грамотрицательных бактериальных клеток. Поэтому E. coli и S. aureus до и после обработки 30 мкг/мл КТК характеризовали СЭМ (Рис. 8). Как показано на рис. 8a, c, бактерии до обработки КТК имеют регулярную поверхность. Однако после инкубации с КТК морфология бактериальных клеток, включая S. aureus (Рис. 8b) и E. coli (Рис. 8d), изменилась кардинально. Кроме того, мембраны многих бактериальных клеток разрушились. На поверхности бактерий наблюдались некоторые малые материалы, происходившие от прикрепленных КТК. Это указывает на то, что КТК могут дезинфицировать бактериальные клетки, повреждая их мембраны [32].

Поскольку и КТ, и КТК флуоресцируют, 6 мкг/мл агентов исследовали для бактериальной визуализации в процессе дезинфекции. Изображение S. aureus исследовали и показано на рис. 9. Интересно, что и КТ, и КТК могли использоваться для визуализации S. aureus. Однако КТК показывают более высокую эффективность захвата, так как бактериальные клетки, наблюдаемые в светлом и темном полях, почти полностью перекрывались. С другой стороны, только часть клеток S. aureus окрашивалась КТ. Кроме того, плотность бактериальных клеток была меньше при обработке КТК, что свидетельствует о том, что КТК дезинфицировали S. aureus более эффективно по сравнению с КТ при одинаковых дозах. Эти результаты также раскрывают, что КТК могут использоваться как альтернативные красители для визуализации различных бактериальных клеток.

Заключения

Сборка КТ в КТК приводит к более надежной антибактериальной активности. Сделан вывод, что структура сборки обеспечивает более стабильные свойства, но усиливает антибактериальную активность КТ. Данная работа также открывает новый путь сборки малых наноматериалов в каркасы для более практических применений.

Доступность данных и материалов

Все данные, поддерживающие выводы данной статьи, включены в статью.

Аббревиатуры

КТ:

Карбонные точки

КТК:

Каркасы на основе карбонных точек

ПЭИ:

Полиэтиленимин

E. coli:

Escherichia coli

S. aureus:

Staphylococcus aureus

ТЭМ:

Передаточная электронная микроскопия

ХР-ТЭМ:

ТЭМ высокого разрешения

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия поверхности

МИК:

Минимальная ингибирующая концентрация

НК:

Нанокластеры

TCSPC:

Подсчет одиночных фотонов, коррелированных во времени

CCK-8:

Анализ набора для подсчета клеток-8

РФК:

Реактивные формы кислорода

СЭМ:

Растерная электронная микроскопия

ZP:

Дзета-потенциал