Гидрофильный HBP-модифицированный rGO обеспечивает двойное pH/NIR-управляемое высвобождение DOX для синергестической химио-фототermalной терапии опухолей

Аннотация

Сообщается простой путь к синтезу гидрофильного восстановленного оксида графена (NrGO) восстановлением оксида графена (GO) амино-терминированным гиперразветвленным полимером (NHBP). NrGO демонстрирует отличную водную дисперсионность, сильное поглощение в ближнем инфракрасном (NIR) диапазоне, эффективную фотotermalную конверсию и химическую стабильность. Загрузка химиотерапевтического агента доксорубицина (DOX) на NrGO дает двухреактивный лекарственный носитель, высвобождающий DOX быстрее в кислых опухолеподобных условиях или при NIR лазерной облучке. In vitro исследования подтверждают биосовместимость NrGO, а DOX@NrGO достигает превосходной ингибиции опухолевых клеток по сравнению со свободным DOX, демонстрируя эффективную химио-фототermalную синергию. Эти находки подчеркивают DOX@NrGO как перспективную платформу для комбинированной раковой терапии и других биомедицинских применений.

Введение

Фототermalная терапия (ФТТ) в ближнем инфракрасном (NIR) диапазоне стала минимально инвазивной стратегией лечения рака, так как NIR свет (700–1100 нм) проникает в ткани с низким поглощением, щадя здоровые клетки и позволяя локальный нагрев. Для ФТТ терапевтический агент должен сочетать высокую фотotermalную конверсионную эффективность, хорошую биосовместимость и коллоидную стабильность в водных средах.

Графеновые материалы привлекли внимание как ФТТ-агенты благодаря двумерной структуре, большой площади поверхности и настраиваемым оптическим свойствам. Однако конвенциональный rGO, полученный химическими или гидротермальными методами, часто сохраняет гидрофобный характер, ограничивая биологическую применимость.

Мы решили это ограничение, используя водорастворимый, восстанавливающий амино-терминированный гиперразветвленный полимер (NHBP) для превращения GO в гидрофильный, стабильный rGO (NrGO). Предыдущая работа демонстрировала способность NHBP функционализировать металлические наночастицы, сохраняя дисперсионность.

Кроме того, загрузка цитоксичных лекарств на фотotermalные носители может синеризировать химиотерапию с ФТТ, так как тепло не только аблирует опухолевые клетки, но и ускоряет высвобождение лекарства. Здесь описываем синтез NHBP-модифицированного rGO, его фотotermalные свойства, загрузку DOX, pH/NIR-триггерируемое высвобождение лекарства и результирующую химио-фототermalную эффективность против клеток HeLa.

Материалы и методы

Материалы

Оксид графена (GO, 0,8–1,2 нм толщиной, 0,5–5 мкм шириной) получен от XFNANO Co., Ltd. Доксорубицин (DOX) куплен у HuaFeng United Technology Co., Ltd. Модифицированное среднее Дюльбекко (DMEM), фетовое сывороточное сироват (FBS), трипсин, пенициллин (100 Ед/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл) поставлены Thermo Fisher Scientific. MTT, DAPI и PI реактивы от Beyotime Biotechnology. Все остальные химикаты аналитического чистоты от Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.

Подготовка амино-терминированного гиперразветвленного полимера (NHBP)

Амино-терминированный гиперразветвленный полимер (NHBP) синтезировали по нашему предыдущему протоколу. Кратко, тетраэтиленпентамин (94 мл, 0,5 моль) перемешивали под азотом в 250-мл трехшейном круглодонном колбе. Метанольный раствор метакрилата (43 мл, 0,5 моль) добавляли капельно, затем смесь нагревали и охлаждали поочередно, за чем следовало 4 ч перемешивания при комнатной температуре. Продукт изолировали ротационной эвапорацией при 150 °C, получая желтовато-вязкий полимер со средней молекулярной массой ~7759.

Подготовка NHBP-восстановленного GO (NrGO)

GO диспергировали в деионизированной воде и ультразвуковыми обрабатывали с NHBP в массовых соотношениях 1:10, 1:20 и 1:30 в течение 10 мин, затем перемешивали при 90 °C 1 ч. Полученные суспензии (NrGO-10, NrGO-20, NrGO-30) центрифугировали и трижды промывали водой.

Подготовка DOX-загруженного NrGO (DOX@NrGO)

Суспензия NrGO смешивали с раствором DOX в массовом соотношении 1:1 и перемешивали при комнатной температуре 24 ч. Композит собирали центрифугированием и промывали для получения DOX@NrGO.

Характеризация и измерения

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ, JEOL JEM-2100) использовалась для изучения морфологии. Фурье-преобразование инфракрасной спектроскопии (ФТИР, Nicolet iS10) записывали в диапазоне 400–4000 см⁻¹ (разрешение 4 см⁻¹). дзета-потенциал и гидродинамический размер измеряли на NanoBrook 90plus Zeta анализаторе. УФ-виз-NIR поглощение (400–900 нм, 1 см⁻¹ разрешение) записывали на Thermo Fisher Evolution 300. Фототermalная производительность оценивали 808-нм лазером (SFOLT Co.) и термопарным термометром (DT-8891E). Образец (0,2 мл) в пятне 0,25 см² облучали при 1 Вт см⁻² 5 мин, температурные изменения записывали в реальном времени.

Анализ высвобождения лекарства

DOX@NrGO помещали в диализационный мешок (MWCO 8000) с ФСБ (pH 7,4 или 4,0) и инкубировали при 37 °C с 100 об/мин агитацией. Для NIR группы мешок облучали 5 мин после каждой точки выборки. На каждом интервале 10 мл ФСБ забирали, заменяли свежим буфером, концентрацию DOX определяли УФ-виз спектрофотометрией.

Клеточная цитотоксичность и химио-фототermalная оценка

Клетки HeLa посевали 5×10³ клеток на колбу в 96-колбовых пластинках и инкубировали до ~80 % конфлюэнтности. Клетки обрабатывали NrGO (3,125–50 мкг мл⁻¹) 24 и 48 ч, затем живучесть измеряли MTT анализом по Уравнению (1). После 4 ч инкубации с DOX@NrGO (3,125–50 мкг мл⁻¹) клетки HeLa облучали 808-нм лазером (0,5 Вт см⁻²) 5 мин и культивировали еще 20 ч. Живучесть оценивали MTT, морфологию клеток исследували DAPI и PI окраской под конфокальной микроскопией.

Живучесть клеток (%) = (OD_образец / OD_контроль) × 100%.

Результаты и обсуждение

Физико-химическая характеристика

Восстановление GO с NHBP превратило коричневую суспензию в черную вододиспергируемую, подтверждая успешную конвертацию. ТЭМ-изображения (Рис. 2) показывают, что NrGO-30 сохраняет монослойную структуру без агрегации, указывая, что NHBP не нарушает морфологию графена. ФТИР-спектры (Рис. 3) раскрывают исчезновение 1725 см⁻¹ C=O пика GO и появление 1633 см⁻¹ C-N амидного сигнала, подтверждающего ковалентное присоединение NHBP. Измерения дзета-потенциала (Рис. 4) демонстрируют сдвиг от отрицательных (GO) к положительным значениям (NrGO), дальнейшая поддержка поверхностной функционализации. УФ-виз-NIR спектры (Рис. 5) показывают сильное поглощение по всему NIR окну для всех образцов NrGO, тогда как GO и NHBP в одиночку демонстрируют пренебрежимый NIR отклик. Гидродинамический размер (Рис. 6) остается консистентным при разных соотношениях NHBP, указывая на размерную стабильность.

Фототermalные свойства

Под 808-нм облучением вода показывала незначительный нагрев, GO поднимал <5 °C. В противовес, образцы NrGO достигали 40–45 °C при 200 мкг мл⁻¹, с более высокими соотношениями NHBP дающими большие температурные подъемы (Рис. 7). Температура росла пропорционально концентрации NrGO и мощности лазера, достигая терапевтического окна (~41–43 °C) без повреждения нормальных клеток. Фототermalное циклирование (Рис. 7d) и после-облучения УФ-виз (Рис. 8) подтверждают отличную стабильность и сохранение оптических свойств.

Лекарственная доставка

Высвобождение DOX из DOX@NrGO было выраженно усилено в кислых (pH 4,0) и NIR-облученных условиях (Рис. 9). Кислый pH ионизирует аминовые группы NHBP, снижая электростатическую связь с DOX и способствуя высвобождению. NIR нагрев ускоряет молекулярное движение, дальнейшее ускоряя диффузию лекарства. Таким образом, DOX@NrGO предлагает двойную реактивность, подходящую для микросреды опухоли.

Цитотоксичность NrGO

MTT анализы (Рис. 10a) показывают >80 % живучести клеток при 50 мкг мл⁻¹ через 24 ч, подтверждая низкую интринсическую токсичность и пригодность как лекарственного носителя.

Синергестическая ингибиция опухолевых клеток

Лечение DOX@NrGO в одиночку снижало живучесть HeLa дозо-зависимо (Рис. 10b). При комбинации с NIR облучением (0,5 Вт см⁻², 5 мин) живучесть клеток снижалась значительно сильнее, свидетельствуя о химио-фототermalной синергии. Конфокальные изображения (Рис. 11) показывают дисперсию ядер при DOX@NrGO, тогда как облучение вызывает экстенсивное отшелушивание клеток. PI окраска (Рис. 12) раскрывает увеличение мертвых клеток после комбинированной терапии, подтверждая усиленный цитотоксический эффект.

Заключение

Подводя итог, мы разработали прямолинейный, водорастворимый NHBP-модифицированный rGO с надежной фотotermalной конверсией и коллоидной стабильностью. Загрузка DOX придает pH- и NIR-триггерируемое высвобождение, и система DOX@NrGO достигает превосходной химио-фототermalной ингибиции опухолевых клеток in vitro. Эти результаты демонстрируют перспективность DOX@NrGO как универсальной платформы для раковой терапии и других биомедицинских применений.

Аббревиатуры

CLSM

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

DAPI

4′,6-диамидино-2-фенилиндол

DOX

Доксорубицин

DOX@NrGO

DOX-загруженный NrGO

FTIR

Фурье-преобразование инфракрасной спектроскопии

GO

Оксид графена

HBP

Гиперразветвленный полимер

MTT

Метилтиазолилтетразолий

NHBP

Амино-терминированный HBP

NIR

Ближний инфракрасный

NrGO

Амино-терминированный гиперразветвленный полимер восстановленный оксид графена

PI

Пропидиев йодид

PTT

Фототermalная терапия

rGO

Восстановленный оксид графена

SEM

Раскладная электронная микроскопия

TEM

Трансмиссионная электронная микроскопия