Наночастицы, доставляющие артезунат, усиливают противоопухолевую эффективность через активацию митохондриального апоптоза

Аннотация

Артемизинин и его производные считаются обладающими широким спектром противоопухолевой активности и индуцирующими значительные противоопухолевые эффекты в опухолевых клетках. Артемизинин и его производные быстро абсорбируются и широко распределяются, селективно убивая опухолевые клетки. Поскольку низкие концентрации артезуната в основном зависят от онкоза для индукции смерти опухолевых клеток, его противоопухолевые эффекты нежелательны и ограничены. Для получения лучших противоопухолевых эффектов в этом исследовании мы использовали новую нанотехнологию для проектирования новых наночастиц из сывороточного альбумина говядиньего (BSA), загруженных артезунатом, для достижения митохондриальной аккумуляции артезуната и индукции митохондриально-медированного апоптоза. Результаты показали, что по сравнению с зависимостью свободного артезуната от онкотического смерти, наночастицы BSA, загруженные артезунатом, демонстрировали более высокую цитотоксичность, а их значительные апоптотические эффекты индуцировались через распределение артезуната в митохондриях. Это обнаружило, что наночастицы BSA, загруженные артезунатом, повреждали митохондриальную целостность и активировали митохондриально-медированный клеточный апоптоз путем повышения экспрессии апоптоза-связанных белков и содействия быстрому выбросу цитохрома C.

Введение

Артемизинин и его производные широко использовались в лечении малярии благодаря их высокой противомалярийной активности и низкой токсичности. Исследователи также обнаружили, что артемизинин и его производные демонстрируют значительную противоопухолевую активность благодаря малым токсическим побочным эффектам и большей переносимости пациентами [1]. Сообщалось, что артезунат (Ats) определенно ингибировал рост опухолевых клеток и дальше индуцировал значительные противоопухолевые эффекты в опухолевых клетках [2,3,4]. Некоторые эксперименты указывали, что Ats вызывал разные степени апоптоза и онкоза в опухолевых клетках через 48 ч, и что степени апоптоза и онкоза зависели от дозы Ats. При низких концентрациях Ats не индуцировал явного апоптоза в опухолевых клетках, и Ats-индуцированная смерть клеток сопровождалась онкозо-подобной смертью [5,6,7,8]. Для получения больших противоопухолевых эффектов применялась более высокая доза Ats, но это дополнительно подтвердило ее серьезную токсичность и подавление костного мозга. Поэтому необходимо найти эффективное лечение для снижения эффективной дозы Ats и усиления ее противоопухолевой эффективности [9,10,11]. Было выяснено, что митохондрии играют важную роль в регуляции апоптотических и онкотических эффектов Ats. Митохондрии также участвовали в регуляции процесса трандукции широкого спектра апоптотических сигналов [12,13,14,15,16,17]. Когда митохондрии атакуются лекарствами, их проницаемость повышалась, а мембранный потенциал снижался, что приводило к отеку внутренней мембраны митохондрий и быстрому выбросу цитохрома C из митохондрий в цитоплазму [18,19,20]. Кроме того, некоторые белки каспазного семейства активировались, и каскадная реакция клеточного апоптоза индуцировалась.

Для усиления противоопухолевых эффектов Ats предпринималось множество попыток увеличить распределение препарата в опухолевых клетках или улучшить целевую доставку препаратов в клеточные органеллы для индукции смерти клеток [21,22,23]. Наночастицы (НЧ) как ключевой инструмент в таргетированной раковой терапии широко изучались и показали перспективный потенциал. Поскольку НЧ имели меньший размер частиц и большую удельную площадь, они могли входить в кровяное течение через капилляры и проходить через эндотелиальные щели и мигрировать к месту опухоли, тем самым достигая таргетированного распределения препарата и повышая биодоступность препарата. Более того, НЧ могли контролировать высвобождение препарата через деградацию биоматериала в долгом и гладком паттерне, в конечном счете удлиняя полупериод элиминации, улучшая эффективную кровную концентрацию и снижая частоту дозирования. Главное, препараты, загруженные в НЧ, могли доставляться в специфические места внутри клеток, улучшая эффективность лечения [24,25,26].

Для усиления противоопухолевых эффектов Ats при низких концентрациях мы пытались спроектировать новые наночастицы BSA, загруженные Ats. Из-за низкого pH в опухолевых клетках, аккумуляция большого количества протонов водорода присутствует на внешней митохондриальной мембране или в промембранном пространстве, напротив, внутренняя митохондриальная мембрана богата отрицательным зарядом из-за своего химического состава и секреции матрикса митохондрий, что создает трансмембранный потенциал с электро положительной наружностью и отрицательной внутренностью, что способствует доставке BSA. Тогда массивная аккумуляция Ats в митохондриях может эффективно запустить митохондриально-медированный апоптоз. Результаты показали, что по сравнению с типичной онкотической смертью, индуцируемой свободным Ats, Ats специфически переносился в митохондрии с посредничеством наночастиц BSA и способствовал митохондриально-медированной активации апоптоза-связанных каспазных белков. Это поджегло значительный клеточный апоптоз, тем самым подчеркивая более высокую цитотоксичность.

Методы

Материалы

BSA был приобретен у Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, USA), а Ats — у Guilin Pharmaceutical Corporation (Guilin, Китай). Клетки SMMC-7721 и Plc были приобретены в Институте биохимии и клеточной биологии Китайской академии наук (Шанхай, Китай). Все остальные приобретенные химикаты были аналитического класса; они были получены от различных поставщиков.

Приготовление и характеристика наночастиц BSA, загруженных Ats

Согласно ранее опубликованной литературе [27], наночастицы BSA, загруженные Ats, приготавливались методом дезольвации. Кратко, наночастицы BSA, загруженные Ats, приготавливались быстрой капельной инъекцией 1.0 мл безводного спирта, содержащего определенное количество Ats, в 0.5 мл раствора BSA при 37 °C до опалесценции. С удалением этанола ротационной эвапорацией, наночастицы BSA, загруженные Ats, дополнительно выпадали в осадок из среды, а затем добавляли 8% глютаральдегид в воде (0.5 мкл/мг BSA) для индукции перекрестного связывания частиц под перемешиванием взвеси в течение 24 ч. Наконец, НЧ собирали и вымывали три раза деионизированной водой для дальнейшего анализа их физических характеристик, включая гидродинамический диаметр, индекс полидисперсности (PDI), дзета-потенциал и морфологию, используя Brookhaven Zetasizer (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, USA) и передаточный электронный микроскоп (JEM-1200EX; JEOL, Tokyo, Japan). Определение эффективности инкапсуляции Ats в наночастицах BSA оценивалось по ранее опубликованному методу [27].

МТТ-тест

Два типа линий опухолевых клеток, SMMC-7721 и Plc, отдельно инкубировали с 20% фетальным говяжьим сывороточным альбумином (FBS). Плотность роста клеток корректировали до 1 × 10⁶ клеток/мл путем подсчета клеток, а затем клетчатые взвеси разбавляли до 1 × 10⁵ клеток/мл. Разбавленные взвеси дополнительно отдельно добавляли в 96-колодчатую пластинку (100 мкл на колодку, около 1 × 10⁴ клеток/колодку) для непрерывной инкубации 24 ч при 37 °C в условиях 5% CO₂ и 95% O₂. Среду заменяли на бессывороточную в присутствии либо свободного Ats, либо наночастиц BSA, загруженных Ats, с разными концентрациями Ats, и далее инкубировали 24 ч. Всего 50 мкл 3-(4,5-диметилтиазол-2-il)-2,5-дифенилтетразолиевого бромида (МТТ) (5 мг/мл) добавляли в каждую колодку и инкубировали 4 ч для завершения культивирования. Когда тетразолиевый краситель МТТ восстанавливался до нерастворимого формазана, 96-колодчатые пластинки центрифугировали на 1000 об/мин в течение 5 мин, над supernatант откачивали из каждой колодки, за которым следовало добавление 150 мкл диметилсульфоксида (DMSO), который полностью растворял кристаллы. Абсорбция раствора измерялась с помощью микропластинчатого считывателя (Syneray-2; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) при 490 нм.

Внутриклеточное распределение группы наночастиц BSA в клетках

Клетки SMMC-7721 и Plc в логарифмической фазе выбирали и обрабатывали трипсином; концентрацию клеток корректировали до 1 × 10⁶ клеток/мл. Затем культурные клетки добавляли в 6-колодчатую пластинку для адгезии, культурную среду удаляли с последующим добавлением наночастиц BSA, маркированныхродамином B. Ядро окрашивали Hoechst (синий) в течение 15 мин при 37 °C, а митохондрии окрашивали MitoTracker Green FM. Локализация наночастиц BSA в клетках отслеживалась внутри клеток с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (FluoView FV10i; Olympus Corporation, Tokyo, Japan).

Изменение митохондриального мембранного потенциала

JC-1 можно использовать для определения изменений в митохондриальном мембранном потенциале. Когда митохондриальный мембранный потенциал был высоким, JC-1 мог свободно проходить через клеточную мембрану и формировать агрегаты внутри митохондрий, демонстрируя красную флуоресценцию (длина волны возбуждения 525 нм; длина волны эмиссии 590 нм); когда митохондриальный мембранный потенциал снижался, JC-1 переносился из митохондриальной матрицы в цитоплазму клетки, образуя зеленый флуоресцирующий мономер (длина волны возбуждения 490 нм; длина волны эмиссии 530 нм). Клетки SMMC-7721 и Plc соответственно посевали в конфокальные блюдца для достижения плотности 1 × 10⁶ клеток/мл для непрерывной инкубации 12 ч. Затем культурную среду утилизировали и добавляли бессывороточную культурную среду, содержащую дисперсию Ats или наночастиц BSA, загруженных Ats, в блюдце. Через 9 ч среду утилизировали и клетки вымывали дважды PBS, за которым следовало добавление 2 мл JC-1 в концентрации 2 мкмоль/л; клетки затем инкубировали 30 мин при 37 °C в темноте. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (FluoView FV10i; Olympus Corporation) использовалась для наблюдения изменений образа митохондриальной мембраны.

Измерение продукции ROS и окрашивание эндоплазматического ретикулума (ЭР)

Клетки инкубировали с 20% FBS и плотность роста клеток корректировали до 1 × 10⁶ клеток/мл путем подсчета клеток; затем клетчатые взвеси разбавляли до 1 × 10⁵ клеток/мл. Разбавленные взвеси дополнительно добавляли в 96-колодчатые пластинки (100 мкл на колодку, около 1 × 10⁴ клеток/колодку) для непрерывной инкубации 24 ч при 37 °C под 5% CO₂ и 95% O₂. Во-вторых, свободный Ats и наночастицы BSA, загруженные Ats, инкубировали с клетками 6, 12 и 24 ч, за чем следовала непрерывная инкубация с 10 мкМ 2,7-дихлорфлуоресцеидиацетатом (DCFH-DA; Sigma-Aldrich Co.) около 30 мин. Ледяной PBS-буфер использовали для вымывания клеток три раза для удаления неинтернализированных НЧ. Внутриклеточная интенсивность флуоресценции DCF, которая возбуждается при 485 нм и эмитируется при 530 нм, детектировалась с помощью микропластинчатого считывателя (Synergy-2; BioTek Instruments) для исследования степени оксидативного стресса. Тестовые группы обрабатывали клетками SMMC-7721 и Plc в течение 24 ч, и зонд ER-Tracker Blue–White DPX (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) добавляли в клетки для инкубации 30 мин. После удаления загрузочного раствора и вымывания клеток PBS, морфологические изменения ЭР наблюдали конфокальной лазерной сканирующей микроскопией.

Оценка онкоза и апоптоза клеток методом потоковой цитометрии

Согласно протоколу нашего предыдущего исследования [28], анализ окрашивания Annexin V-флуоресцеинизотиоцианатом (FITC)/пропидиевым йодидом (PI) использовался для оценки онкоза и апоптоза клеток, индуцированных свободным Ats и наночастицами BSA, загруженными Ats. Клетки лизировали трипсином и посевали в шестиколодчатые пластинки в концентрации 1 × 10⁶ клеток/мл для 24 ч непрерывной инкубации. Затем культурную среду удаляли и бессывороточную среду, содержащую свободный Ats и наночастицы BSA, загруженные Ats, добавляли в колодки. После обработки клетки собирали и взвешивали в буфере Nicoletti (Beijing 4A Biotech Co., Ltd., Beijing, Китай), содержащем PI- и FITC-маркированный Annexin V (AV-FITC). Морфологические изменения клеток наблюдали конфокальной лазерной сканирующей микроскопией. Для верификации скоростей апоптоза и онкоза, индуцированных наночастицами Ats, проценты раннего апоптоза (Q4), онкоза (Q2), некроза (Q1) и живых клеток (Q3) kvantифицировали потоковой цитометрией.

Вестерн-блот анализ апоптоза-связанных белков и цитохрома C в клетках

Анализ вестерн-блот выполнялся для определения уровней относительных белков при инкубации свободного Ats или наночастиц, загруженных Ats, с клетками SMMC-7721 в течение 24 ч. Клетки лизировали ледяным радиоиммунопреципитационным анализом (RIPA) буфером, содержащим коктейль ингибиторов протеаз и фосфатаз (Roche, Basel, Швейцария). Концентрации белков определяли с использованием модифицированного набора BSA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и нормализовывали перед загрузкой на 10% натрий-додецилсульфат (SDS)–полиакриламидный гель электрофорез (PAGE). Уровни целевых белков фотографировали и анализировали с помощью системы анализа гелей UVP (iBox Scientia 600; UVP, LLC., Upland, CA, USA).

Результаты

Характеристики наночастиц BSA, загруженных Ats, и исследование клеточной жизнеспособности

На рис. 1a, b наблюдалось, что наночастицы BSA, загруженные Ats, имели сферическую форму и были однородно диспергированы с низким PDI 0.016. Средний размер частиц наночастиц BSA, загруженных Ats, составлял около 99.9 ± 2.3 нм, а дзета-потенциал был отрицательным и оценивался около –25.6 ± 4.3 мВ. Профиль высвобождения показывал гладкое и устойчивое высвобождение, показанное на рис. 1c. По сравнению с быстрым высвобождением свободного Ats в среде in vitro, Ats, инкапсулированный в ядре наночастиц BSA, медленно диффундировал из интерьера НЧ в среду и показывал гладкий и устойчивый паттерн высвобождения благодаря непрерывной деградации BSA. Более 85% свободного Ats высвобождалось полностью в течение первых 6 ч, в то время как общее накопленное количество препарата, высвобожденного из НЧ в среду в течение 48-часового периода, составляло 78.9%. Это указывало на то, что НЧ могли контролировать высвобождение препарата через деградацию биоматериалов в долгом и гладком паттерне, тем самым удлиняя полупериод элиминации, улучшая эффективную кровную концентрацию и снижая частоту дозирования.

МТТ использовали для изучения ингибирующих эффектов свободного Ats и наночастиц BSA, загруженных Ats, в клетках SMMC-7721 и Plc при разных временных интервалах. Результаты (рис. 1d, e) показали, что цитотоксичность свободного Ats увеличивалась с увеличением концентрации препарата, и наночастицы BSA, загруженные Ats, демонстрировали постепенное усиление цитотоксичности. Это доказывало, что Ats и наночастицы BSA, загруженные Ats, ингибировали рост опухолевых клеток и что коэффициент ингибирования зависел от дозы Ats. По сравнению с свободным Ats, наночастицы BSA, загруженные Ats, демонстрировали более высокую цитотоксичность и более высокую чувствительность в обеих клетках, и они приводили к большему ингибированию клеток. Как показано на рис. 1d, e, обработка обеих клеток наночастицами BSA, загруженными Ats, вызвала значительное снижение жизнеспособности клеток при 24 ч по сравнению с свободным Ats. Значения 50% максимальной ингибирующей концентрации (IC50) для клеток SMMC-7721 и Plc, обработанных наночастицами BSA, загруженными Ats, составляли 50.1 и 44.9 мкг/мл при 24 ч соответственно, что сравнивается со значениями 69.2 и 74.9 мкг/мл при 24 ч в клетках, обработанных свободным Ats. Это указывало на то, что когда Ats загружен в наночастицы BSA, он может изменить свое внутриклеточное местоположение, посредничеством НЧ, и в конечном счете убить больше клеток.

In vitro клеточное поглощение наночастиц BSA

Внутриклеточное распределение и локализация наночастиц BSA в обоих типах опухолевых клеток наблюдали конфокальной лазерной сканирующей микроскопией, как показано на рис. 2. После ко-культивированияродамина B-маркированных НЧ с клетками в течение 3 ч, красная флуоресценция четко видна в цитоплазме; с течением времени большинство наночастиц BSA интернализировались внутриклеточно и диффундировали в цитоплазму, демонстрируя усиленную время-зависимую красную флуоресценцию. Также наблюдалось, что наночастицы BSA, локализованные в цитоплазме, ко-локализовались с митохондриями, что было очевидно по появлению желтой флуоресценции, указывающей на то, что внутренняя красная флуоресценцияродамина B-маркированных НЧ и зеленая флуоресценция, эмитируемая митохондриальным индикатором MitoTracker® green FM, слились. Это доказало, что интернализированные наночастицы BSA могли специфически аккумулироваться внутри митохондрий, подчеркивая возможность доставки Ats в митохондрии с посредничеством наночастиц BSA.

Анализ митохондриального мембранного потенциала

Для выяснения того, мешают ли наночастицы BSA, загруженные Ats, митохондриальной функции после доставки Ats в митохондрии, определяли изменения в митохондриальном мембранном потенциале. Рис. 3 демонстрировал, что после окрашивания JC-1 большинство митохондрий в опухолевых клетках, обработанных свободным Ats, демонстрировало сильную красную флуоресценцию и слабую интенсивность зеленой флуоресценции. Это предполагало, что большинство JC-1 существовало в агрегированном состоянии, укрепляя целостность митохондриальной мембраны и более высокий потенциал. Напротив, когда JC-1 окрашивал клетки, обработанные наночастицами BSA, загруженными Ats, митохондрии в обеих опухолевых клетках демонстрировали более сильную зеленую флуоресценцию, указывая на то, что митохондриальная мембрана была серьезно повреждена и ее потенциал значительно снижен. В совокупности это доказывало, что Ats успешно доставлялся в митохондрии с посредничеством наночастиц BSA, приводя к деполяризации митохондриальной мембраны.

Измерение продукции ROS и окрашивание ЭР

Было широко подтверждено, что генерация большого количества ROS может вызывать перекисное окисление фосфолипидов во внутренней митохондриальной мембране и также может индуцировать снижение митохондриального мембранного потенциала, тем самым приводя к быстрому выбросу цитохрома C. Мы использовали DCFH-DA как флуоресцентный зонд для обнаружения изменения ROS. DCFH-DA свободно проходил через клеточную мембрану в клетку и превращался в DCFH гидролизом эстеразы. Сгенерированный DCFH не мог проходить через клеточную мембрану и легко загружался в клетки. Внутриклеточные ROS окисляли не-флуоресцирующий DCFH в DCF с зеленым флуоресцирующим цветом. Поэтому детекция флуоресценции DCF может указывать на уровень внутриклеточных ROS.

Когда обе клетки обрабатывали свободным Ats и наночастицами BSA, загруженными Ats, в течение определенного периода времени, количество внутриклеточных ROS также увеличивалось, показывая время-зависимую связь. По сравнению с свободным Ats, генерация ROS в клетках SMMC-7721 и Plc, обработанных наночастицами BSA, загруженными Ats, была значительно усилена. Рис. 4a демонстрировал, что уровни ROS в клетках SMMC-7721 и Plc, экспонированных наночастицам BSA, загруженным Ats, в течение 48 ч увеличились в 1.53 и 1.28 раза соответственно по сравнению с клетками SMMC-7721 и Plc, обработанными свободным Ats. Это поддерживало идею, что НЧ ускоряли продукцию внутриклеточных ROS. По сравнению с контрольной группой и свободным Ats, и после обработки наночастицами BSA, загруженными Ats, интенсивность флуоресцентного окрашивания от ER-Tracker Blue–White DPX как ЭР-специфического красителя была значительно увеличена, предполагая, что ЭР-стресс также запускался в клетках, обработанных наночастицами Ats, с соответствующим увеличением уровня ROS. Это обнаружение подчеркивало, что Ats специфически локализовывался в митохондриях, посредничеством наночастиц BSA; это привело к значительному увеличению уровня свободных радикалов кислорода внутри клеток, тем самым запуская индукцию ЭР-стресса и активируя митохондриальный путь для индукции каспаз-зависимого клеточного апоптоза.

Оценка апоптоза и некроза клеток

Клетки обрабатывали анализом окрашивания Annexin V-FITC/PI. Живые клетки не связывались с Annexin V-FITC/PI, поэтому флуоресценция не появляла. Апоптотические клетки не связывались с PI, но окрашивались Annexin V-FITC, давая зеленую флуоресценцию. Напротив, для онкотических клеток их клеточные мембраны были повреждены до некоторой степени, и клеточные ядра расширялись, разрушаясь на куски, тем самым показывая и зеленую, и красную флуоресценцию. Как показано на рис. 5a, по сравнению с контрольной группой, когда свободный Ats и наночастицы, загруженные Ats, инкубировали с клетками 24 ч, сильная зеленая и красная флуоресценция наблюдалась в клетках, указывая на то, что свободный Ats и наночастицы BSA, загруженные Ats, индуцировали онкоз и апоптоз опухолевых клеток. Особенно после обработки наночастицами BSA, загруженными Ats, интенсивности флуоресцентного окрашивания, полученные от Annexin V-FITC и PI, были значительно увеличены, предполагая, что степени онкоза и апоптоза были значительно усилены в клетках, обработанных наночастицами Ats.

Проценты раннего апоптоза (Q4), онкоза (Q2), некроза (Q1) и живых клеток (Q3) показаны на рис. 5b. Это обнаружение демонстрировало, что когда клетки обрабатывали свободным Ats, скорости онкоза постепенно увеличивались до 24.4 и 4.6%, а скорость апоптоза оставалась на уровне 4.9 и 7.1% в клетках SMMC-7721 и Plc соответственно, предполагая, что свободный Ats запускал возникновение онкоза и апоптоза для приведения к смерти клеток. Напротив, наночастицы BSA, загруженные Ats, значительно улучшили скорость апоптоза и онкоза клеток. Апоптотические соотношения значительно увеличились до 10.9% в клетках SMMC-7721 и до 11.5% в клетках Plc. Онкотические соотношения увеличились до 29.0% в клетках SMMC-7721 и до 21.6% в клетках Plc. Это указывало на то, что митохондриальная доставка Ats с посредничеством наночастиц BSA ускоряла смерть опухолевых клеток путем усиления онкотических и апоптотических эффектов. Наночастицы BSA, загруженные Ats, запускали процесс трандукции апоптотического сигнала и способствовали митохондриально-медированной каскадной реакции клеточного апоптоза.

Вестерн-блот анализ

Для изучения зависимости смерти клеток от апоптоза, индуцированного свободным Ats и наночастицами, загруженными Ats, анализ вестерн-блот выполнялся для обнаружения экспрессии апоптотических белков. Было обнаружено, что в клетках SMMC-7721, обработанных наночастицами, загруженными Ats, внутриклеточный уровень экспрессии белка Bax был значительно увеличен (рис. 6). Это обнаружение предполагало, что с помощью наночастиц BSA, Ats аккумулировался в митохондриях и вызывал митохондриальную дисфункцию. Цитоплазматический мономерный белок Bax переносился на внешнюю мембрану митохондрий и прошел олигомеризацию, формируя белковый канал во внешней мембране митохондрий, тем самым дальше ведущий к увеличению проницаемости мембраны. Уровень экспрессии цитохрома C в цитоплазме также был особенно и значительно усилен, а экспрессии каспазы-3 и каспазы-9 демонстрировали восходящую тенденцию. Поэтому благодаря более высокой проницаемости мембраны митохондрий, цитохром C быстро высвобождался в цитоплазму, активируя белки сигнального пути смерти клетки (каспазы) и способствуя каскадной реакции клеточного апоптоза. В противоположность, свободный Ats не имел значительной разницы в экспрессии апоптоза-связанных белков и цитохрома C, предполагая, что свободный Ats не запускал митохондриально-медированный клеточный апоптоз и в основном полагался на онкоз для приведения к смерти клеток. Наночастицы BSA усилили аккумуляцию препарата в митохондриях и активировали митохондриально-медированные апоптотические эффекты, тем самым приводя к значительному апоптозу и повышая экспрессию первичных апоптоза-релевантных белков, как показано в наших вестерн-блот анализах.

Обсуждение

Онкоз и апоптоз представляют два разных пути, которыми клетки претерпевают смерть. Апоптоз — это активный процесс запрограммированной клеточной смерти, происходящий в мультиклеточных организмах. Онкоз, с другой стороны, описывает каспаз-независимую клеточную смерть, характеризующуюся отеком, повышенной проницаемостью и разрывом мембраны, что часто называют некрозом. Эта форма клеточной смерти считается случайной и неконтролируемой. На основе нашего исследования мы обнаружили, что Ats ингибировал рост опухолевых клеток и что коэффициент ингибирования зависел от дозы Ats. Ats в основном зависел от степени онкоза и приводил к смерти клеток; он также активировал каспаз-независимую смерть клеток в форме онкоза. Напротив, и отдельно от возникновения явного онкозо-подобного смерти, когда опухолевые клетки обрабатывали наночастицами BSA, загруженными Ats, наночастицы BSA, загруженные Ats, интернализировались в цитоплазму и быстро локализовались внутри митохондрий для высвобождения Ats, посредничеством НЧ. Ats в митохондриях генерировал ROS и запускал ЭР-стресс; он дальше активировал митохондриально-медированный каспаз-зависимый клеточный апоптотический путь путем снижения митохондриального мембранного потенциала, выброса цитохрома C и повышения белковых экспрессий Bax, клевой каспазы 3 и каспазы 9. В совокупности, наночастицы BSA, загруженные Ats, увеличили митохондриальную доставку Ats и усилили степень онкоза и апоптоза для индукции смерти клеток, тем самым увеличивая цитотоксичность препарата и индуцируя значительную смерть клеток.

Заключение

Кратко, мы прояснили, что свободный Ats в опухолевых клетках сильно зависел от степени онкоза для ингибирования пролиферации опухолевых клеток в форме онкозо-подобной смерти; таким образом, цитотоксичность препарата была ограничена и нежелательна. Напротив, наночастицы BSA, загруженные Ats, активировали митохондриальный апоптотический путь и одновременно запустили онкотические эффекты; вместе они усилили синергетическую противоопухолевую эффективность Ats. Результаты этого исследования подчеркнули значимость наночастиц BSA, загруженных Ats, в усилении цитотоксических и апоптотических эффектов Ats, и они дальше означают роль наночастиц BSA в диверсификации путей смерти клеток, индуцированных Ats. По сравнению с свободным Ats, наночастицы BSA, загруженные Ats, индуцировали большую цитотоксичность и значительные эффекты клеточного апоптоза в опухолевых клетках.