Зеленые белково-покрытые золотые наночастицы из Tricholoma crassum: антимикробные, апоптотические и генные доставки потенциалы

Аннотация

Мы сообщаем о первом зеленом синтезе белково-покрытых золотых наночастиц (AuНЧ) с использованием съедобного микоризного гриба Tricholoma crassum. AuНЧ, 5–25 нм в диаметре и различных форм, формируются за один час при 28 °C. UV-vis спектроскопия показывает характерный SPR пик при 552 нм, сдвигающийся со временем реакции и pH. Детальная характеристика SEM, TEM, AFM, XRD и DLS подтверждает монодисперсность и натуральную 40 кДа белковую корону. Частицы демонстрируют мощную антимикробную активность против грамотрицательных, грамположительных и грибковых патогенов, включая многолекарственно-резистентные штаммы, и ингибируют споровое прорастание. Кометные тесты раскрывают доза-зависимую индукцию аоптоза в растительных клетках, в то время как 40 кДа белковый покров обеспечивает эффективную доставку генов в клетки Саркомы 180, подтвержденную GFP экспрессией. Тесты на гемолиз показывают пренебрежимую кровную токсичность ниже 20 мкл/мл, указывая на безопасное терапевтическое окно. Масштабируемое производство в ферментерах реализуемо, позиционируя эти AuНЧ как универсальные агенты для антимикробных, антираковых и генных доставки приложений.

Введение

Быстрое внедрение наночастиц в сельское хозяйство, медицину и потребительские продукты усилило необходимость понимания их профиля безопасности. Зеленый синтез, использующий живые организмы или их ферменты, предлагает эко-безопасный, стоимостно-эффективный путь, исключающий опасные химикаты. Нитеобразующие грибы, с их высокой секрецией ферментов, особенно пригодны для производства внеклеточных металлических наночастиц. Хотя несколько грибов давали золотые наночастицы (AuНЧ), мало отчетов описывают натуральные белковые оболочки на этих частицах, которые критичны для коллоидной стабильности и функционализации. Золотые наночастицы привлекательны для терапевтического использования, так как не вызывают резистентность и могут быть спроектированы для таргетирования опухолевых клеток через эффект усиленного проникновения и удержания (EPR). Белково-обложенные AuНЧ улучшают клеточное поглощение и предоставляют сайты для стыковки лекарств или генов, устраняя необходимость дополнительных химических стадий обложения. Тем не менее, биосовместимость, цитотоксичность и риски агломерации должны быть тщательно оценены перед клиническим применением.

Методы

Грибы, бактерии и условия роста растений

Tricholoma crassum культивировали для синтеза наночастиц. Антимикробные тесты использовали E. coli (DH5α), A. tumefaciens (LBA4404) и их многолекарственно-резистентные производные, а также фитопатогены M. oryzae и A. solani. Рассада томата и табака выращивали в контролируемых условиях (28 ± 1 °C, 16:8 ч свет/темнота, 50 мкмоль м⁻² с⁻¹).

Синтез AuНЧ

Мицелиальные коврики инкубировали в картофельно-декстрозном бульоне (PDB) 7 дней при 28 °C. После 24, 48 или 72 ч, 1 г мицелия взбалтывали с 10 мл деионизированной воды 24 ч при 50 об/мин. Фильтрат (pH 5,2) смешивали с 1 мМ HAuCl₄ и перемешивали при 28 °C в темноте 1 ч. Корректируя pH фильтрата (3,5–9) и температуру реакции (0–100 °C), мы настраивали размер и форму частиц. Вариации объема фильтрата (×0,5–×2) и концентрации Au³⁺ (0,5–2 мМ) дополнительно уточняли синтез.

Методы характеризации

• UV-Vis спектроскопия (450–750 нм) для SPR анализа.
• SEM, TEM и AFM для морфологии и распределения размеров.
• XRD для подтверждения кристаллической фазы.
• DLS для гидродинамического размера.
• SDS-PAGE для идентификации белковой короны.

Антимикробные и антигрибковые тесты

Диск-диффузия и кривые роста количественно оценивали ингибирование бактериальных и грибковых штаммов. Грибковое споровое прорастание оценивали при варьирующих концентрациях AuНЧ. Метод включал стандартную инкубацию и микроскопическое наблюдение.

Оценка аоптоза

Кометные тесты на ядрах листьев табака и томата измеряли фрагментацию ДНК после экспозиции AuНЧ. Тестировали разные концентрации (0–30 % об/об) и времена инкубации (15–30 мин).

Доставка генов в клетки Саркомы 180

Плазмида pCAMBIA1302 (GFP маркер) комплексировали с AuНЧ и инкубировали с клетками Саркомы 180. GFP экспрессия подтвердила успешную трансфекцию. Гемолиз тесты с человечными эритроцитами оценивали кровную совместимость.

Результаты и обсуждение

Формирование AuНЧ и спектроскопические особенности

Переход от бледножельтого к фиолетовому за 1 ч указывает на формирование AuНЧ. UV-Vis спектры показывают SPR пик при 552 нм для 24-ч фильтрата, сдвигающийся в красную сторону при более длительной инкубации и в синюю — при более высоком pH. Оптимальный синтез происходит при 28 °C с 1 мМ HAuCl₄, давая монодисперсные частицы, стабильные >30 дней.

Влияние параметров синтеза

Увеличение объема фильтрата или концентрации Au³⁺ повышает интенсивность цвета и абсорбцию, с легким синим сдвигом при ×2 фильтрате. Более высокие температуры (75–100 °C) производят более крупные, менее стабильные частицы. Светооблучение увеличивает размер частиц и расширяет SPR пик.

Морфология и распределение размеров

SEM и TEM раскрывают 5–22 нм AuНЧ в формах от сфер и ромбоидов до гексагонов и треугольников. AFM подтверждает суб-10 нм высоты, а XRD подтверждает лицетреугольную кубическую золото с доминирующей {111} дифракцией при 38,23°.

Антимикробная активность

AuНЧ ингибировали рост E. coli, A. tumefaciens и M. oryzae с доза-зависимыми зонами ингибирования. Многолекарственно-резистентные штаммы также подавлялись, указывая на широкий спектр эффективности. Анализ кривых роста показал задержку лог-фазы и снижение плотности клеток при лечении AuНЧ.

Грибковое споровое прорастание

Увеличение концентраций AuНЧ прогрессивно снижало споровое прорастание и длину прорастающей трубки A. solani, демонстрируя антигрибковую потенцию.

Апоптогенные свойства

Кометные тесты выявили значительное повреждение ДНК при >20 % экспозиции AuНЧ, в то время как 5–10 % вызывали пренебрежимую аоптозу. Таким образом, существует терапевтическое окно для антимикробных или генных доставки применений без цитотоксичности.

Идентификация белковой короны

SDS-PAGE кипяченых наночастиц показывает единичную 40 кДа полосу, идентичную внеклеточному белку от T. crassum. Белковый покров стабилизирует частицы и предоставляет сайты связи для ДНК.

Доставка генов и гемолиз

AuНЧ-плазмидные комплексы достигли GFP экспрессии в клетках Саркомы 180, тогда как голая плазмида нет. Гемолиз оставался ниже 8 % при концентрациях до 20 мкл/мл, подтверждая низкую кровную токсичность.

Заключение

Съедобный микоризный гриб Tricholoma crassum позволяет быстрый, зеленый синтез белково-покрытых AuНЧ с разнообразными формами и надежными антимикробными, апоптотическими и генными доставки свойствами. Натуральная 40 кДа белковая корона обеспечивает коллоидную стабильность и функционализацию, а данные гемолиза поддерживают безопасное терапевтическое использование. Масштабируемое производство в ферментерах реализуемо, предлагая масштабируемую платформу для антимикробных, антираковых и наномедицинских приложений.