Исследование ROS и остановки клеточного цикла в генотоксических эффектах нанородиков с золотым ядром и серебряной оболочкой

Аннотация

Для понимания генотоксичности, индуцируемой в печени серебряными наночастицами (AgNP) и серебряными ионами, в исследовании использовали инжинирированные нанородики с золотым ядром и серебряной оболочкой (Au@Ag NR) и гуманизированные гепатоциты HepaRG. Участие окислительного стресса и остановки клеточного цикла в повреждении ДНК и хромосом, индуцируемом 0,4–20 мкг/мл Au@Ag NR, изучали комет-тестом, γ-H2AX тестом и микронуклеус-тестом. Дополнительно анализировали распределение Au@Ag NR. Результаты показали, что и Ag⁺, и Au@Ag NR вызывают разлом ДНК и хромосомальные повреждения (кластогенность) в клетках HepaRG, а Au@Ag NR, задерживающиеся в ядре, могут дальнейшим высвобождать Ag⁺, усугубляя повреждения, вызванные преимущественно остановкой клеточного цикла и образованием ROS. Результаты раскрывают корреляцию внутриклеточного накопления, высвобождения Ag⁺ и потенциальной генотоксичности AgNP.

Введение

Серебряные наночастицы (AgNP), 1–100 нм, проявляют широкий спектр антимикробных свойств, проникая в патогены и инактивируя внутренние сульфидрильные группы их метаболических ферментов. Показали мощные бактериостатические и бактерицидные эффекты против E. coli, N. gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, широко применяются как медицинские покрытия, товары быта и повязки для ран. Доказательства показывают, что наночастицы способны проникать в ядро и мешать синтезу и транскрипции ДНК. В нашем пред. исследовании одна внутривенная доза 5 мг/кг AgNP вызвала замечательные хромосомные разрывы в клетках костного мозга крыс Sprague-Dawley. Одна внутрибрюшинная инъекция 10 мг/кг и выше AgNP индуцировала и ДНК, и хромосомные повреждения. Flower с соавт. предложили, что AgNP в дозах 50 и 100 мкг/мл могут вызвать повреждение ДНК в течение 5 минут, подчеркивая генотоксичность быстро высвобождаемого серебра (Ag). Учитывая риск избыточного воздействия, наногенотоxicология — ДНК повреждение и канцерогенный потенциал инжинирированных наноматериалов — привлекла внимание.

Основные механизмы генетических повреждений AgNP: сверхпродукция реактивных кислородных форм (ROS), воспаление, нарушение клеточного цикла. AgNP могут либо напрямую взаимодействовать с ДНК через окислительное повреждение, вмешиваться в интерфазу на уровне ДНК и митозу на хромосомном уровне, либо взаимодействовать с нуклеопротеином и митотическим спаindel аппаратом, нарушая чекпоинты клеточного цикла. Однако неясно,归因于 генотоксичность AgNP частично наночастицам или полностью высвобожденным Ag⁺ ионам.

Исследование генотоксичности AgNP затруднено из-за нестабильного и прерывистого высвобождения серебра в тканях, что затрудняет локализацию AgNP и дифференциацию наноядра от Ag. Наша группа недавно разработала нанородик с золотым ядром и серебряной оболочкой (Au@Ag NR) для изучения токсичности наночастиц. Золотое ядро Au@Ag NR физиологически инертно в ткани и может служить внутренним стандартом для мониторинга высвобождения Ag⁺ ионов из стержня отслеживанием изменения Ag/Au отношения, измеряемого ИСП-МС (ICP-MS). Этот метод позволяет идентифицировать разные происхождения токсичности. Предыдущие работы показали, что высвобожденные Ag⁺ из оболочки Au@Ag NR вызывают окислительное повреждение почек, ведущее к морфологическим изменениям и нарушению фильтрационной функции клубочка. Jiang с соавт. предложили, что и частице-специфическая активность, и внутриклеточное высвобождение Ag⁺ Au@Ag NR вносят вклад в токсический ответ гранулезных клеток. Мы также использовали Au@Ag NR как модель для изучения in vivo генотоксического потенциала AgNP и показали, что кластогенность, а не мутагенность, — первичная форма генотоксичности, индуцируемой и Ag оболочкой, и высвобожденными Ag⁺ ионами, без разницы в паттернах токсичности.

Печень — один из основных органов, склонных к накоплению AgNP, признается мишенью для генотоксичности AgNP. Наше пред. исследование показало, что некоторое количество серебра (8,26±3,90 мкг/г) и золота (80,07±64,72 мкг/г) оставалось в печени крыс SD через 8 недель после внутривенного введения одной дозы Au@Ag NR. В этом исследовании мы пытались определить роли остановки клеточного цикла и реактивного окислительного стресса в хромосомных и ДНК повреждениях AgNP, используя Au@Ag NR в человеческих гепатома-производных клетках HepaRG. Генотоксические тесты (комет-тест, γ-H2AX тест, микронуклеус-тест) выполнялись параллельно с очистителем окислительных радикалов для зондирования вклада ROS в ДНК/хромосомные повреждения, а апоптоз, клеточный цикл и связанные белки определялись для изучения механизмов, которыми AgNP прерывают синтез и репликацию ДНК. Дополнительно внутриклеточное накопление и распределение Au@Ag NR изучали комбинацией ICP-MS и TEM для дифференциации роли наночастиц и высвобожденных Ag ионов.

Материалы и методы

Клеточная культура и обработка

Человеческая гепатомная клеточная линия HepaRG (Thermo Fisher Scientific) использовалась в исследовании. Клетки культивировали в RPMI 1640 с 10% фетовой говячьей сывороткой (FBS, Австралия, Gibco) и 1% пенициллин-стрептомицин-глутамин (Gibco) во влажной атмосфере 5% CO₂ при 37 °C. Клетки обрабатывали возрастающими концентрациями Au@Ag NR в течение 24 или 72 ч, концентрации определялись согласно IC₅₀, оцененному тестом жизнеспособности. Для изучения роли ROS в генотоксичности 1 мМ N-ацетил-L-цистеина (NAC, Sigma-Aldrich) применяли за 1 ч до обработки Au@Ag NR.

ATP тест роста/жизнеспособности клеток

Клетки посеяли в 96-колодчатую пластину плотностью 5×10³/колодце. После 24-ч инкубации среду аспирировали и экспонировали клетки разным концентрациям Au@Ag NR на 24 или 48 ч. Подготавливали широкий спектр концентраций, 4 колодца на обработку за период. Цитоксичность Au@Ag NR изучали ATP тестом (CellTiter-Glo® 2.0, Promega), измеряющим клеточную метаболическую активность путем количественного определения ATP, важного метаболического параметра живых клеток. Люминесцентные сигналы, отражающие количество живых клеток, детектировали VICTOR Multilabel Plate Reader (PerkinElmer), IC₅₀ оценивали как концентрацию Au@Ag NR для полумаксимальной жизнеспособности программой Prism 7 (GraphPad). Коэффициент жизнеспособности:

Viability Ratio (%) = RLU_sample / RLU_vehicle × 100%

где RLU — относительная световая единица (среднее 4 колодцев), RLU_vehicle — необработанные клетки, RLU_sample — обработанные разными концентрациями Au@Ag NR.

Определение концентрации серебра и золота в клетках

Клеточные образцы минерализовывали азотной кислотой в микроволновой системе. После минерализации образцы готовили в смеси 1% HNO₃ и HCl. Количество Ag и Au определяли ICP-MS (NexION300X, PerkinElmer). TEM анализ определял наличие Au NR и Au@Ag NR в клетке. Образцы фиксировали в смеси 2,5% глутаральдегида и 2% параформальдегида 2 ч при 4 °C. Клеточные пеллеты промывали 3 раза фосфатным буфером (pH 7,4) и постфиксировали 1% оксидом осмия 2 ч при 4 °C. Последующие промывки дистиллированной водой 3 раза и обезвоживание 15 мин в растворах этанола (50%, 70%, 90%, 100%) последовательно. Затем пропиленоксид 1:1 и 1:3 разбавления к смоле при 20–26 °C 2 ч. Полимеризация градуированным нагревом: 35 °C 16 ч, 45 °C 8 ч, 55 °C 14 ч, 65 °C 48 ч. Ультратонкие сечения окрашивали уранила ацетатом и цитратом свинца 25 мин и анализировали TEM (H-7650, HITACHI, Япония).

Конвенциональный и модифицированный комет-тест

Клетки посеяли в 12-колодчатые пластины плотностью 2×10⁵/колодце или 3×10⁵/колодце для 24- или 72-ч обработки. Перекись водорода (H₂O₂) 200 мкмоль как положительный контроль экспонировали клеткам на 1 ч. На каждый образец два колодца для конвенциональной и Fpg-обработки. Конвенциональный комет-тест в щелочных условиях (pH>13) как описано ранее. Для Fpg-колодцев дополнительная Fpg-обработка перед размоткой ДНК, стекла погружали в ферментный буфер (0,1 М KCl, 0,5 мМ EDTA, 40 мМ HEPES, 0,2 мг/мл BSA) 3 раза по 5 мин. Fpg (New England Biolabs, UK) разбавляли 1:50 000 с ферментным буфером. 100 мкл разбавленного фермента добавляли на каждый гель на стеклах и инкубировали в влажной камере при 37 °C 30 мин. Остальные шаги как в конвенциональной обработке. Комет-тесты в триplicates. Не менее 50 клеток на образец независимо оценивали никоновским флуоресцентным микроскопом Eclipse 80i, Komet 6.0 (Andor Technology) анализировал средние % ДНК в хвосте и оливковый хвостовой момент (OTM).

Квантификация γ-H2AX фокусов потоковой цитометрией и высокопроизводительным скринингом

Для потоковой цитометрии: клетки в 12-колодчатых пластинах 2×10⁵/колодце или 3×10⁵/колодце для 24/72 ч. Для высокопроизводительного скрининга: 96-колодчатые пластины 6×10³/колодце или 1×10⁴/колодце для 24/72 ч. Положительный контроль: 2 мкМ метилметансульфонат (MMS, Sigma-Aldrich) параллельно с клетками на 1 ч. Клетки промывали TBS, фиксировали 4% параформальдегидом 15 мин при комнатной температуре. После промывки TBS, инкубировали в 50 мкл ледяного метанола 30 мин при -20 °C. Промывка TBS 3 раза, блокирующий реагент (TBS с 0,3% Triton X-100 и 10% козьей сывороткой) 1 ч. Первичный антитело (мышиный анти-фосфо-H2AX Ser139, Millipore) разбавлен 1:200 с блокирующим реагентом, инкубация с клетками overnight при 4 °C. Промывка TBS 3 раза, вторичное антитело (Alexa Fluor 488 козье анти-мыши, Life Technologies) разбавлено 1:20 с блокирующим реагентом. Образцы в темноте при комнатной температуре 1 ч, 2 мкг/мл DAPI (Invitrogen) 20 мкл/колодце. Флуоресценция измеряли потоковой цитометрией (FACSCalibur, BD Bioscience) или High Content Analysis System (Operetta CLS, PerkinElmer). Для цитометрии: данные от ≥10 000 клеток на группу, триplicates. Для высокопроизводительного: 20 визуальных полей на колодце, ≥5 колодцев на группу.

Цитокинезис-блок микронуклеус цитоме (CBMN-cyt) тест

CBMN-cyt по процедуре Fenech с соавт. Клетки в 12-колодчатых пластинах 2×10⁵/колодце или 3×10⁵/колодце для 24/72 ч. 0,2 мкг/мл Митомицин C (MMC, Tokyo Chemical Industry, Япония) положительный контроль 24 ч. 3 мкг/мл цитокалазин B после 24/72 ч для блока цитокинезиса, сбор через 40 ч. Окраска 5% Гимза после гипотонического 0,075 моль/л KCl и фиксации 3:1 метанол/уксусная кислота. Триplicates, ≥1000 бинуклеарных клеток на колодце.

Измерение МДА, общего ГШ и СОД

Клетки в 12-колодчатых пластинах 5×10⁵/колодце или 3×10⁵/колодце для 24/72 ч. Сбор, промывка 3 раза PBS. МДА в гомогенатах — тиобарбитурновый метод (Nanjing Jiancheng Bio-engineering). Общее глутатион (ГШ) и супероксиддисмутаза (СОД) — наборы для количественного определения (Dojindo Molecular Technologies, Япония). Оптические плотности (O.D) — VICTOR Multilabel Plate Reader (PerkinElmer).

Потоковая цитометрия клеточного цикла

Клетки в 6-колодчатых пластинах 1×10⁶/колодце или 5×10⁵/колодце для 24/72 ч, фиксация 70% этанолом при 4 °C overnight. Промывка PBS 3 раза, окраска PI/Rnase буфером (BD Biosciences) 15 мин при комнатной температуре. Популяции G0/G1, S, G2/M среди 20 000 клеток определяли регионами FL2 площадь vs FL2 ширина. Анализ потоковой цитометрией (FACSCalibur, BD Bioscience) и FlowJo (BD Bioscience), триplicates.

Потоковая цитометрия апоптоза

Клетки в 6-колодчатых пластинах 1×10⁶/колодце или 5×10⁵/колодце для 24/72 ч. Промывка 2 раза PBS, разбавление 500 мкл 1× связывающего буфера (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I, BD Bioscience) до ~1×10⁶ клеток/мл, 100 мкл разбавления + 5 мкл FITC Annexin V + 5 мкл PI. Окраска 15 мин при комнатной температуре, ≥10 000 клеток для определения раннего и позднего апоптоза регионами FL1H vs FL2H потоковой цитометрией (FACSCalibur, BD Bioscience) и FlowJo, триplicates.

Вестерн-блот анализ

Клетки в 75 см² колбе 1×10⁷/колбе и 6×10⁶/колбе для 24/72 ч. Лизис RIPA буфером с протеазным ингибитором (PMSF), концентрация белков BCA набором (Beyotime Biotechnology, Китай). Концентрации выравнивали RIPA буфером перед денатурацией 95 °C 3 мин. Белки разделяли электрофорезом в 12% SDS ПААГ и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Millipore). Блокировка 5% обезжиренным молоком 30 мин, инкубация с первичными p53 (SC-137174, Santa Cruz), p21 (SC-6246, Santa Cruz), β-актин (sc-47778, Santa Cruz) и вторичными козьими анти-мыши IgG(H+L)-HRP (SE131, solabio). Экспрессия визуализировала усиленная хэмилюминесценция (ECL) и анализировала ImageJ (NIH).

Статистический анализ

Данные как среднее ± SEM. Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) для статистической значимости различий между негативным контролем и обработанными группами, затем тест Даннета на множественные сравнения (SPSS 22, IBM), значимость при P<0,05. Графики GraphPad Prism 7 для Windows.

Результаты

Характеристика Au NR и Au@Ag NR

Золотые нанородики (Au NR), ядра Au NR и нанородики с Ag оболочкой (Au@Ag NR) инженирированы, приготовлены и охарактеризованы как описано ранее. Кратко: средние диаметры и длины 15,0±2,5 нм, 66,7±2,5 нм для Au NR и 26,2±3,0 нм, 72,7±8,9 нм для Au@Ag NR. Толщина Ag оболочки ~5 нм. Зета-потенциалы PDDAC-покрытых Au NR и Au@Ag NR в воде 37,7±1,6 мВ и 52,5±1,4 мВ. Ag/Au массовое отношение приготовленных Au@Ag NR оценили как 2,3. Результаты характеристики на Рис. 1.

Жизнеспособность клеток

Цитоксичность Au@Ag NR к HepaRG изучена ATP тестом (Табл. 1), клетки экспонировали Au@Ag NR 24 или 48 ч при концентрациях 0,125–160 мкг/мл. Au@Ag NR индуцировали значимые цитотоксические эффекты время- и дозо-зависимо после 24 и 48 ч экспозиции, с % жизнеспособности IC₅₀ 20 мкг/мл и 6 мкг/мл, аппроксимированных GraphPad Prism 7.0. Учитывая общую цитоксичность, периоды обработки скорректировали на 24 и 72 ч, концентрации — 0,8, 4 и 20 мкг/мл. Добавили Au NR как инертный контроль, Au содержание в группе Au NR такое же, как в 20 мкг/мл Au@Ag NR — 16 мкг/мл. В противовес, 1 мМ NAC претретмент в группе Au@Ag NR + NAC как контроль окислительного стресса (концентрация Au@Ag NR 20 мкг/мл).

Клеточное распределение Au NR и Au@Ag NR

Распределение Au и Ag в HepaRG анализировали ICP-MS. Табл. 2,3: Ag содержание растет дозо-зависимо. Однако антиоксидант NAC как радикаловой очиститель может ограничивать клеточное поглощение наночастиц, так как при той же концентрации Au@Ag NR (20 мкг/мл) наблюдалось меньшее Ag содержание. Спад Ag/Au отношения с 24 до 72 ч указывает на непрерывное высвобождение Ag⁺ из оболочки Au@Ag NR. Клеточное поглощение Ag значительно больше Au (Табл. 4). TEM данные: большинство Au NR и Au@Ag NR удерживались в клетках как агломераты. Структуры нанородиков четко видны внутри клеток при экспозиции Au NR или Au@Ag NR без проникновения в ядро (Рис. 2).

Повреждение ДНК

ДНК повреждение Au@Ag NR оценено комет-тестом и γH2AX тестом (Рис. 3). Комет-тест: 0,8–20 мкг/мл Au@Ag NR вызывали значимое ДНК повреждение. После 24- или 72-ч экспозиции % хвостовой ДНК и OTM клеток увеличивались время- и концентрационно-зависимо. Дополнительно ДНК повреждение, ассоциированное с окислительным стрессом, наблюдалось в клетках с 20 мкг/мл Au@Ag NR Fpg-модифицированным комет-тестом (Рис. 3a,b). Для оценки двухцепочечных разрывов (высокая корреляция с канцерогенезом) анализировали γ-H2AX-позитивные клетки и средние флуоресцентные интенсивности в γ-H2AX-позитивных клетках. После 24-ч экспозиции разницы между группами в γ-H2AX-позитивных клетках нет. Однако 4 мкг/мл Au@Ag NR вызвали значительный рост после 72-ч обработки. Значительные увеличения флуоресцентных интенсивностей во всех группах Au@Ag NR после 72 ч vs контроль (Рис. 3c-e, P<0,05).

Хромосомные повреждения

Формирование микронуклеусов — значимый биомаркер хромосомных повреждений, более критического для генетического материала, чем разрывы ДНК. Отношение бинуклеарных клеток с микронуклеусом оценено (Рис. 4c). Au@Ag NR увеличивали формирование микронуклеусов концентрационно-зависимо. После 24-ч экспозиции отношения микронуклеусов в клетках с 4 и 20 мкг/мл Au@Ag NR — 1,133±0,145% и 1,567±0,318%, оба значительно выше контроля. После 72-ч экспозиции отношение при 4 мкг/мл — 1,767±0,233% (значимо выше контроля); при 20 мкг/мл — 2,167±0,252% (значимо выше контроля и 16 мкг/мл Au NR — 0,700±0,153%). В противовес, разницы между 20 мкг/мл Au@Ag NR + NAC и контролем нет, указывая на участие ROS в хромосомных разрывах Au@Ag NR.

Влияние Au@Ag NR на формирование ROS

Для изучения роли ROS в ДНК/хромосомных повреждениях Au@Ag NR оценивали МДА, ГШ, СОД. Значительный рост МДА (P<0,05) наблюдался после экспозиции 20 мкг/мл Au@Ag NR на 24 и 72 ч (Рис. 5a). ГШ и СОД в клетках с Au@Ag NR показали значительное снижение (P<0,05) время- и концентрационно-зависимо. Результаты указывают на дисбаланс между оксидцией и антиоксидцией, генерируемым Au@Ag NR (Рис. 5b,c).

Влияние Au@Ag NR на клеточный цикл и апоптоз

После 72-ч экспозиции Au@Ag NR рост клеток в фазе G2/M наблюдался в группах 4 мкг/мл, 20 мкг/мл Au@Ag NR и Au@Ag NR + NAC: 32,63±1,77%, 32,267±2,17%, 32,967±4,25% — значительно выше контроля (22,37±0,92%) (Рис. 6a,b). Апоптоз Au@Ag NR наблюдался после 72 ч, поздний апоптоз при 20 мкг/мл Au@Ag NR и 20 мкг/мл Au@Ag NR + NAC — 78,90±1,19% и 70,20±4,50% (Рис. 6c,d). Au@Ag NR индуцировали больше позднего апоптоза, чем раннего, NAC смягчал поздний апоптоз.

Экспрессия p21 и p53 вестерн-блотом, похожий паттерн. Уровни p53 и p21 в клетках с 4 и 20 мкг/мл Au@Ag NR были выраженно повышены (P<0,05) и значительно снижены в клетках с 20 мкг/мл Au@Ag NR + NAC (P<0,05 vs 20 мкг/мл Au@Ag NR, Рис. 6e-h). Известно, что p53 — ключевая молекула, медиатор активации G2/M чекпоинта в ответ на ДНК повреждение, p21 — p53-зависимый ингибитор клеточного цикла. Таким образом, Au@Ag NR могли мешать репликации ДНК и препятствовать ДНК ремонту через остановку клеточного цикла.

Обсуждение

На данный момент роли высвобожденных Ag⁺ и AgNP в генерации генотоксичности далеки от ясности. Предыдущие исследования нашей группы и других показали, что хотя Ag⁺ — главный источник токсичностей, наночастицы также могут быть высокотоксичны. Например, AgNP способствуют генотоксичности индуцируя гидроксильные радикалы. Более тяжелые хромосомные повреждения, окислительный стресс и апоптоз вводились AgNP по сравнению с Ag⁺ в одиночестве, предполагая участие разных путей. Мы использовали Au@Ag NR как модель для понимания форм и распределения AgNP в клетках, количества внутриклеточных Ag и Au определили ICP-MS. Ag/Au массовое отношение приготовленных Au@Ag NR оценили как 2,3. Однако после 24-ч экспозиции оно резко возросло до 16,5 в клетках с Au@Ag NR, указывая на то, что большое количество Ag высвободилось из оболочки Au@Ag NR в этот период. При продлении экспозиции до 72 ч Au/Au отношение снизилось до 1,7, показывая, что Ag⁺ высвободилось из клетки и нанородик был основной формой Au@Ag NR в клетке на этом этапе. Следовательно, можно сделать вывод: как только Au@Ag NR входит в клетку, Ag⁺ быстро растворяется из оболочки в течение 24 ч и постепенно высвобождается во внеклеточную среду, в то время как Au@Ag NR удерживается в клетке дольше.

Окислительный стресс считается одним из важнейших токсикологических механизмов наночастиц. N-ацетилцистеин (NAC) — тиол, муколитик и предшественник L-цистеина, восстанавливающий глутатион. NAC также источник сульфидрильных групп в клетках и проявляет активность очистителя ROS взаимодействием с OH· и H₂O₂. В исследовании ГШ и СОД значимо снизились после экспозиции Au@Ag NR, МДА вырос концентрационно- и время-зависимо, указывая на введение Au@Ag NR окислительного стресса в клетках.

Потенциалы Ag и Au@Ag NR в вмешательстве в генетический материал изучали серией генотоксических тестов. Важно: совместная культура NAC с Au@Ag NR смягчала ROS формирование, что поддерживает участие окислительного стресса в генотоксичности Au@Ag NR. Комет-тест и γ-H2AX подтвердили, что Au@Ag NR взаимодействует с ДНК и индуцирует определенное ДНК повреждение, ремонтная эндонуклеаза Fpg включена в комет-тест для идентификации окислительного ДНК повреждения. Fpg распознает окисленные пиримидины и удаляет окисленные пурины (8-оксигуанин), создавая апуринические/апиримидинические позиции, вводящие разрывы в цепях ДНК. Окислительное стресс-индуцированные разрывы ДНК затем определяются повторным комет-тестом. Дальнейшие разрывы ДНК, детектированные дополнительным Fpg в комет-тесте, предполагают, что Au@Ag NR вызывает ДНК повреждение. Mei с соавт. наблюдали, что 5-нм AgNP индуцировали окислительные лезвие-специфические ДНК повреждения hOGG1, EndoIII и Fpg эндонуклеазами в комет-тесте. Li с соавт. также предложили, что PVP- и силика-покрытые AgNP (15–100 и 10–80 нм) вызывали значительный рост ДНК разрывов в гепатоцитах мышей при hOGG1 и EndoIII. Формирование γ-H2AX фокусов — ранняя клеточная реакция на генотоксический стресс, самый чувствительный и специфичный биомаркер двухцепочечных разрывов. В работе γ-H2AX фокусы в клетках с Au@Ag NR выраженно возросли после 24 ч, дальнейший рост после 72 ч. Снижение в группе 20 мкг/мл может быть из-за цитоксичности HepaRG при высокой концентрации. Похожие результаты для AgNP с разными покрытиями. Результаты также показывают, что Au@Ag NR индуцирует хромосомные повреждения в HepaRG — микронуклеусные частоты значимо возросли. Это согласуется с пред. исследованиями, где AgNP увеличили частоту микронуклеусов в HaCaT и TK6 клетках. Напротив, добавление NAC ингибировало формирование микронуклеусов Au@Ag NR. Вместе данные указывают на участие окислительного стресса в кластогенном риске AgNP in vitro.

Предыдущие работы изучали остановку клеточного цикла и цитоксичность AgNP. С удлинением экспозиции влияние AgNP на цикл и апоптоз может усиливаться и усугублять цитоксичность и генотоксичность. Обычно чекпоинты клеточного цикла (G2/M) инициируются клетками при ДНК повреждении, предотвращая вход в митоз (M фаза). G2/M остановка означает, что растущий процент клеток задерживается в G2 для ДНК ремонта. Клетки с успешным ремонтом переходят к митозу; с фатальными повреждениями — необратимая G2/M остановка и апоптоз. Мы наблюдали, что Au@Ag NR задерживают большинство HepaRG в G2/M, индуцируют поздний апоптоз и повышают экспрессию p53 и p21 — важных белков регуляции клеточного цикла. p53 также индуцирует апоптоз, когда ДНК не может быть отремонтирована, p21 может косвенно участвовать в апоптозе через остановку цикла p53-зависимым путем via down-regulating ICBP90 для ДНК репликации и регуляции цикла. Апоптоз и G2/M остановка активацией p53/p21 сообщались в HepG2 после чесночного экстракта. Таким образом, можно заключить: окислительный стресс-триггерные ДНК/хромосомные повреждения могут стимулировать экспрессию p53 и p21, что индуцирует остановку клеточного цикла. Удлинение экспозиции Au@Ag NR к ДНК/хромосомам во время репликации может дальше усугубить генотоксичность или апоптоз.

Заключение

Генотоксичность, индуцируемая AgNP, может быть обусловлена окислительным стрессом наночастиц и высвобожденными ионами. Исследование использовало Au@Ag NR как модель для определения распределения и поведения высвобождения Ag после входа наночастиц в клетки. Учитывая различные формы Au@Ag NR в клетке, после экспозиции Ag⁺ быстро растворялся из серебряной оболочки. Ag⁺ и Au@Ag NR вводили цитоксичность и генотоксичность (кластогенность) в клетках, а Au@Ag NR, задерживающиеся в ядре, могут дальнейшим высвобождать Ag⁺ для усугубления повреждений, вызванных преимущественно остановкой клеточного цикла и формированием ROS (сводно на Рис. 7). Совокупно данные раскрывают корреляцию внутриклеточного накопления, высвобождения Ag⁺ и потенциальной генотоксичности AgNP.

Доступность данных и материалов

Все данные и материалы доступны без ограничений.