Оптимизация размера капель эмульсии и ПВА сурфактанта для повышения стабильности квантово-точечных мицеллярных нанокристаллов

Аннотация

Метод интерфациальной нестабильности — универсальный подход для создания нанокристалл-содержащих мицелл (мицеллярных нанокристаллов), ценных для биосенсорики, визуализации и терапии. Используя флуоресцентные CdSe/ZnS квантовые точки (QD) как модель, мы систематически изучили, как размер капель эмульсии и сурфактант поливиниловый спирт (ПВА) влияют на формирование, сохранение флуоресценции и коллоидную стабильность QD-нагруженных поли(стирол-б-этиленгликоль) (PS-PEG) мицелл. Обнаружено, что ПВА необходим для формирования капель эмульсии и, следовательно, для производства мицелл. Крупные капли (~25 мкм) генерируют две популяции: коллоидально стабильную фракцию PS-PEG мицелл и коллоидально нестабильную фракцию ПВА мицелл, теряющую флуоресценцию со временем. В то же время малые капли (~3 мкм или меньше) производят только стабильные PS-PEG мицеллы с устойчивой флуоресценцией. Эти выводы дают четкую структуру для оптимизации процесса интерфациальной нестабильности и продвижения мицеллярных нанокристаллов для биомедицинского применения.

Введение

Флуоресцентные квантовые точки, сверхпарамагнитные оксидные наночастицы железа и золотые наночастицы давно изучаются для биомедицинских применений. Недавние исследования смещаются к механистическому пониманию фабрикации, структурно-свойственным отношениям и трансляционным вызовам. Техника интерфациальной нестабильности, впервые сообщенная Zhu и Hayward (2008), предлагает простой, масштабируемый маршрут для инкапсуляции нанокристаллов в амфифильные блок-кополимерные мицеллы. Метод основан на эмульсии «масло в воде», которая при испарении растворителя дестабилизируется и приводит к самоорганизации PS-PEG мицелл вокруг гидрофобных нанокристаллов.

Материалы и методы

Материалы

Ядро-оболочка CdSe/ZnS QD (эмиссия 600 нм) приобретены у Ocean Nanotech. PS-PEG (PS 9,5 кДа, PEG 18 кДа) и PS-PEG-COOH получены от Polymer Source. ПВА (13–23 кДа, 87–89 % гидролизован) закуплен у Sigma-Aldrich. Все растворители были реактивного класса; деионизированная вода очищена системой Millipore Milli-Q.

Фабрикация мицелл методом интерфациальной нестабильности

Типичный протокол: смешивают 0,1 мкМ QD (0,1 мл) с 10 мг/мл PS-PEG (20 мкл) в хлороформе, затем добавляют 0,6 мл воды, содержащей 5 мг/мл ПВА. Формируют эмульсию «масло в воде» либо ручным встряхиванием (1 мин), либо ванной соникацией (30 с). Размер капель эмульсии контролируется методом эмульгирования: встряхивание дает ~25 мкм капли; соникация — ~3 мкм капли. После разбавления (×4 ультрачистой водой) и мягкого перемешивания (100 об/мин) в вытяжке хлороформ испаряется, образуя мицеллярные QD, которые выглядят прозрачными.

Альтернативная генерация эмульсии

Также изучали водорастворимый тетрагидрофуран (THF) как масляную фазу (без ПВА) и электроспрей для получения субмикронных капель. THF дает стабильные мицеллы, но с широким распределением размеров. Электроспрей дает равномерные субмикронные капли и хорошо контролируемую морфологию мицелл.

Характеризация

Передаточная электронная микроскопия (TEM) (JEOL JEM-2100) и динамическое рассеяние света (DLS) оценивали морфологию и размер. Флуоресцентные спектры записывали на спектрофотометре Hitachi F-4600. Цитотоксичность оценивали MTT-тестом на линейках клеток A549, MCF-7 и HeLa. Пептидная конъюгация (Tat или RGD) использовала химию EDC/сульфо-NHS. Визуализация живых клеток проводили на спиннинг-диск конфокальной системе (Andor) с ядерной окраской Hoechst 33342.

Результаты и обсуждение

Роль размера капель эмульсии

И встряхивание, и соникация в конечном итоге дают прозрачные, однородные дисперсии мицелл, подтверждая успешное формирование. Световая микроскопия показывает различный размер капель: ~25 мкм для встряхивания, ~3 мкм для соникации. Флуоресцентная стабильность в течение 40 дней при 4 °C показывает выраженную разницу: мицеллы, полученные встряхиванием, теряют ~50 % флуоресценции через 10 дней, тогда как мицеллы, полученные соникацией, сохраняют флуоресценцию. Потеря в случае встряхивания коррелирует с видимым выпадением осадка, указывая на коллоидную нестабильность. Напротив, соникация дает коллоидально стабильные мицеллы.

Влияние механического воздействия

Удлиненная соникация (1–2 мин) снижает интенсивность флуоресценции без влияния на коллоидную стабильность, что указывает на формирование поверхностных дефектов на QD из-за длительного механического напряжения. Контрольные эксперименты с QD в хлороформе подтверждают этот эффект.

Механизм коллоидной нестабильности

Мицеллы, полученные встряхиванием, выпадают в осадок при стоянии, но мягкое встряхивание восстанавливает флуоресценцию, указывая на то, что осадки инкапсулированы в мицеллоподобные структуры, а не являются свободными QD. TEM осадков показывает кластеры QD внутри неправильных сборок, согласующихся с ПВА мицеллами. Диализационные эксперименты (отсев 200 кДа) демонстрируют, что PS-PEG мицеллы остаются стабильными, в то время как ПВА мицеллы агрегируются, подтверждая, что нестабильная фракция исходит от ПВА-инкапсулированных QD. Следовательно, крупные капли (~25 мкм) производят смешанную популяцию стабильных PS-PEG мицелл и нестабильных ПВА мицелл, в то время как малые капли (~3 мкм) способствуют исключительной PS-PEG инкапсуляции.

Валидация альтернативными методами

Использование THF (без ПВА) дает стабильные мицеллы, но с переменным размером и формой, указывая на то, что нулевые капли дают плохую морфологию. Электроспрей (с ПВА) производит малые капли и хорошо определенные, стабильные мицеллы, подчеркивая важность контроля размера капель.

Схематическое резюме

Каждая капля эмульсии функционирует как микрореактор. Без ПВА капли не формируются, и производство мицелл терпит неудачу. Крупные капли дают двойную популяцию (стабильные PS-PEG и нестабильные ПВА мицеллы). Малые капли (<3 мкм) производят только стабильные PS-PEG мицеллы, обеспечивая долгосрочное сохранение флуоресценции.

Биологическое доказательство концепции

MTT-тесты показывают низкую цитотоксичность QD-инкапсулированных PS-PEG мицелл по трем клеточным линиям. Пептидная функционализация через PS-PEG-COOH позволяет конъюгацию Tat или RGD пептидов. Tat-конъюгированные мицеллы эффективно интернализируются клетками HeLa, накапливаясь перинуклеарно в течение 24 ч. RGD-конъюгированные мицеллы специфически связываются с α_vβ₃ интегрином-гиперекспрессирующими клетками U87MG, в то время как контролы (MCF-7 или неконъюгированные мицеллы) показывают пренебрежимое связывание.

Заключение

Наше систематическое исследование демонстрирует, что размер капель эмульсии и наличие ПВА являются ключевыми в фабрикации QD-нагруженных мицеллярных нанокристаллов методом интерфациальной нестабильности. Контроль размера капель до <3 мкм и минимизация ПВА-инкапсулированных фракций дает высокостабильные, флуоресцентные мицеллы, пригодные для биомедицинской визуализации и таргетированной терапии.