Икариин-загруженные mPEG наночастицы: усиленная защита от ЛПС-индуцированной кардиотоксичности в клетках H9c2

Аннотация

Икариин (ICA), флавонол-гликозид из Epimedium, проявляет кардиопротекторные, антиоксидантные и противовоспалительные свойства, но страдает от плохой водорастворимости, быстрого клиренса и низкой оральной биодоступности. Мы синтезировали гидрофильный конъюгат полиэтиленгликоль моноэтиловый эфир (mPEG) (mPEG-ICA) через сукциновый ангидрид-опосредованное этерифицирование, а затем инкапсулировали свободный ICA в полимер диализом для формирования наночастиц (NP), загруженных ICA mPEG-ICA. Фурье-преобразование инфракрасной спектроскопии (FT-IR) и протонное ядерное магнитное резонанса (¹H-NMR) подтвердили успешное конъюгирование. Динамическое рассеяние света (DLS) выявило средний гидродинамический диаметр 220 ± 13,7 нм с ζ-потенциалом +2,30 ± 1,33 мВ, в то время как передающий электронный микроскоп (TEM) показал равноморфную сферическую морфологию. В фосфатно-буферном растворе (PBS) при pH 7,4 наночастицы высвободили 52,8 ± 1,7% ICA за 72 ч; при pH 6,8 высвобождение ускорилось до 75,7 ± 0,2% за 48 ч. In vitro наночастицы сохраняли живучесть клеток H9c2, снижали утечку лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и ингибировали аоптоз, индуцированный липополисахаридом (ЛПС). Более того, мРНК уровни про-воспалительных цитокинов TNF-α, IL-1β и IL-6 были заметно подавлены. Эти результаты демонстрируют, что ICA-загруженные mPEG-ICA NP предлагают перспективную наномедицинскую платформу для смягчения ЛПС-медированного миокардиального повреждения.

Введение

Кардиальная перестройка после миокардиального повреждения во многом движима устойчивым воспалительным сигналом, особенно через TNF-α, IL-1β, IL-6 и IL-18. Эти цитокины запускают оксидативный стресс, активацию фибробластов и аоптоз кардиомиоцитов, в конечном итоге компромиссируя сердечную функцию. Икариин (C₃₃H₄₀O₁₅) широко сообщался как оказывающий иммуномодуляторные, антиоксидантные и противопроапоптотические эффекты в доклинических моделях, однако его терапевтический потенциал ограничен гидрофобностью, быстрым системным клиренсом и плохим оральным абсорбцией. Нанопереносчики — такие как мицеллы, липосомы и полимерные наночастицы — возникли как эффективные стратегии для улучшения растворимости лекарств, продления времени циркуляции и достижения целевой доставки к воспаленным сердечным тканям, используя усиленный эффект проницаемости и удержания (EPR).

Полиэтиленгликоль моноэтиловый эфир (mPEG) предлагает превосходную гидрофильность, биосовместимость и минимальную иммуногенность по сравнению с линейным PEG. Ковалентно присоединяя ICA к mPEG-COOH через эфирную связь, мы создаем гидрофильно-гидрофобный амфифил, способный к самоассемблированию в наночастицы. Эфирная связь кислота-лабильна, позволяя pH-реактивное высвобождение ICA в слабокислой микросреде (pH ≈ 6,8), характерной для воспаления миокарда. Это исследование детализирует синтез mPEG-ICA, инкапсуляцию ICA в наночастицы, физико-химическую характеристику, in vitro профиль высвобождения и оценку кардиопротекторной эффективности против ЛПС-индуцированного повреждения в клетках H9c2.

Материалы и методы

Экспериментальные инструменты

Ключевые аналитические инструменты включали электронные весы JA302, ротационный испаритель RE52CS‑1, магнитный агитатор 78HW‑1, сушилку 101‑OA, FT-IR спектрометр NEXUS670, UV-Vis спектрофотометр, TEM Glacios, ультразвуковой диспергатор JP‑010S, систему real-time qPCR, фермент-связанный флуоресцентный анализатор, инвертированный микроскоп Olympus, флуоресцентный микроскоп Leica и CO₂ инкубатор Thermo.

Экспериментальные реактивы

Аналитического класса реактивы закупались у коммерческих поставщиков: Икариин (95%, 1 г, DL070208), ЛПС (55 мг, Sigma, Z06J9Y52452), mPEG-Me (250 г, Sigma, MKBT7172), дихлорметан (500 мл, Синфарм), 4-диметиламинопиридин (100 г, Aladdin), N-гидроксисукцинимайд (100 г, Ruiyong), набор FastKing cDNA синтеза (Tiangen), набор аоптозы Biyuntian, набор SYBR Green qPCR (QIAGEN) среди прочих.

Синтез mPEG-COOH

mPEG (5 г), сукциновый ангидрид (0,40 г) и DMAP (0,50 г) реагировали в 50 мл дихлорметана при 60 °C в течение 2 ч под рефлюксом. Смесь испаряли, и полученный белый твердый продукт очищали диализом (2 кДа MWCO) против воды в течение 48 ч. Сублимированный продукт дал mPEG-COOH.

Синтез полимера mPEG-ICA

mPEG-COOH (0,37 г) активировали NHS (0,024 г) и DMAP (0,026 г) в 10 мл сухого DMSO, затем реагировали с 100 мг ICA (растворенным в 5 мл сухого DMSO) под азотом при комнатной температуре в течение 48 ч. После экстенсивного диализа против воды и сублимации, полимер mPEG-ICA был получен.

Приготовление ICA-загруженных mPEG-ICA наночастиц (NP)

mPEG-ICA (5 мг) растворяли в 2 мл DMSO и смешивали с 5 мг ICA в DMSO, за чем следовало добавление 5 мл дистиллированной воды. После 15 мин помешивания при комнатной температуре смесь диализировали (3500 Da MWCO) в течение 24 ч с частыми сменами воды, затем фильтровали для получения ICA-загруженных mPEG-ICA NP.

Фурье-преобразование инфракрасной спектроскопии

Образцы смешивали с KBr, пресовали в таблетки и сканировали от 4000 до 4400 см⁻¹ для подтверждения функциональных групп трансформаций.

Ядерное магнитное резонанса водородного спектра

Образцы растворяли в DMSO-d₆ и анализировали на 500 МГц NMR спектрометре для подтверждения химических сдвигов, согласованных с этерификацией.

UV-Vis спектр

Калибровочная кривая ICA при 270 нм генерировалась; концентрации полимера и наночастиц количественно определялись с использованием этой кривой.

Характеризация ICA-загруженных mPEG-ICA NP

Детектирование динамического рассеяния света

Распределение размера частиц и ζ-потенциал измерялись на Zetasizer 3000hs после лиофилизации и передиспергации в воде; каждый образец анализировался в триplicates.

Наблюдение морфологии TEM

1,0 мг/мл NP суспензия наносилась на углерод-покрытые медные сетки, окрашивалась 2% фосфовольфрамной кислотой и образовывалась при 80 кВ.

Измерение стабильности

NP лиофилизировали с 5% маннитолом, передиспергировали в воде и размер/PDI мониторили для оценки стабильности хранения.

Определение загрузки лекарства и эффективности инкапсуляции

Загрузка лекарства (EE%) и эффективность инкапсуляции (LC%) рассчитывались из UV-Vis абсорбции используя формулы: EE = масса лекарства в NP / общая масса NP × 100%; LC = масса лекарства в NP / начальная масса лекарства × 100%.

In vitro высвобождение лекарства

NP помещали в 25 мл PBS (pH 7,4 или 6,8) при 37 °C с 100 об/мин агитацией. Образцы (2 мл) забирали на определенных интервалах, заменяли свежим средством и анализировали UV-Vis при 270 нм. Кумулятивное высвобождение (%) рассчитывалось стандартным уравнением.

Клеточный эксперимент

Клетки крысиных кардиомиобластов H9c2 культивировали в DMEM + 10% FBS при 37 °C/5% CO₂. Клетки посевали в 96-колодчатых пластинках (10⁴ клеток/колодец) для живучести, ЛДГ, аоптоза и qPCR анализа.

Лечение клеток ЛПС или ICA-наночастицами

Клетки делили на пять групп: (1) контроль (без лечения), (2) ЛПС (10 мкг/мл) в течение 24 ч, (3) ICA (20 мкМ) + ЛПС, (4) полимер mPEG-ICA (20 мкМ) + ЛПС, (5) ICA-загруженные mPEG-ICA NP (20 мкМ) + ЛПС.

MTT

После 24 ч лечения 0,5 мг/мл MTT добавляли на 4 ч. Формазан растворяли в DMSO и абсорбцию измеряли при 570 нм.

Высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

Активность ЛДГ в культуральных супернатантах количественно определялась коммерческим набором; абсорбция считывалась при 490 нм.

Окрашивание Hoechst 33342

Ядерная морфология изучалась после 15 мин окрашивания Hoechst 33342 (1 мкг/мл) и образовывалась под флуоресцентным микроскопом. Аоптотический индекс = аоптотические ядра/общее количество ядер × 100%.

TUNEL анализ

Фрагментация ДНК детектировалась с использованием TUNEL набора; аоптотические ядра считались как зеленая флуоресценция относительно общих DAPI-окрашенных ядер.

Потоковая цитометрия для детектирования аоптоза

Двойное окрашивание Annexin V-FITC/PI выполнялось; ранние и поздние аоптотические популяции количественно определялись потоковой цитометрией.

Обратная транскрипция количественная полимеразная цепная реакция (RT-qPCR)

РНК извлекалась TRIzol, обратная транскрипция и амплификация на системе Bio-Rad CFX96 с использованием SYBR Green. Генетическая экспрессия TNF-α, IL-1β, IL-6 и актина (хаусокипинг) нормализовывалась к актину. Последовательности праймеров перечислены в оригинальной рукописи.

Результаты и обсуждение

FTIR и ¹H NMR спектры

FT-IR спектры показывали характерные эфирные карбонилные абсорбции при 1700 и 1740 см⁻¹, подтверждая успешное конъюгирование. ¹H-NMR выявил фенольные гидроксильные сигналы при 12,6 ppm, ароматические протоны при 7,5 ppm и метиленовые протоны PEG цепи при 3,5 ppm, подтверждая присутствие как ICA, так и mPEG моиетов.

Размер частиц, дзета-потенциал и TEM

Основные полимерные NP в среднем составляли 145 ± 15,2 нм (PDI = 0,277), в то время как ICA-загруженные NP расширились до 220 ± 13,7 нм (PDI = 0,119). Дзета-потенциалы сместились от +0,44 ± 0,26 мВ до +2,30 ± 1,33 мВ при загрузке, указывая на улучшенную коллоидную стабильность. TEM изображения подтвердили сферическую, равномерную морфологию (рис. 2).

Загрузка лекарства и эффективность инкапсуляции

UV-Vis анализ дал загрузку лекарства 21,9 ± 0,013% и эффективность инкапсуляции 54,9 ± 0,032% для ICA-загруженных NP, превосходя полимерные NP (загрузка = 16,5%; EE = 41,3%). Эти значения согласованы с желаемой терапевтической нагрузкой.

Определение стабильности

После лиофилизации с 5% маннитолом, передиспергированные NP показали небольшое увеличение размера до 255 нм (PDI = 0,326), но сохранили приемлемую равномерность, подтверждая стабильность хранения (рис. 3).

In vitro высвобождение mPEG-ICA-ICA лекарства

В pH 7,4 PBS свободный ICA высвободил 77,2% за 12 ч, в то время как mPEG-ICA NP высвободили 44,1% за 72 ч. ICA-загруженные NP высвободили 52,8% за 72 ч при нейтральном pH и 75,7% за 48 ч при pH 6,8, отражая pH-реактивное ускоренное высвобождение (рис. 4).

Живучесть клеток H9C2 и высвобождение лактатдегидрогеназы

MTT анализы не выявили цитотоксичности ICA, mPEG-ICA или ICA-загруженных NP при 20 мкМ. После воздействия ЛПС живучесть упала до 50,0% (контроль = 100%). Лечение ICA, mPEG-ICA и ICA-загруженными NP восстановили живучесть до 55,9%, 61,0% и 65,4% соответственно (p < 0,05) (рис. 5, 6).

ЛДГ анализы показали значительный рост ферментативной утечки после лечения ЛПС; ICA, mPEG-ICA и ICA-загруженные NP заметно снизили высвобождение ЛДГ, с наиболее выраженным эффектом для ICA-загруженных NP (рис. 7).

Аоптоз клеток, индуцированный ЛПС

Окрашивание Hoechst 33342 выявило хроматиновую конденсацию и фрагментацию в ЛПС-обработанных клетках; ICA-загруженные NP значительно атенировали аоптотическую морфологию (рис. 8). TUNEL анализ количественно определил скорости аоптоза: ЛПС индуцировал 47,6% аоптоза, который снизился до 35,5% (ICA), 26,5% (mPEG-ICA) и 17,9% (ICA-загруженные NP). Потоковая цитометрия подтвердила эти находки, показывая общий аоптоз 35,9% в ЛПС против 16,7% (ICA-загруженные NP) и 19,2% (mPEG-ICA) (рис. 9-10).

мРНК воспалительных цитокинов в ЛПС-индуцированных клетках H9c2

RT-qPCR продемонстрировал, что ЛПС заметно повысил транскрипты TNF-α, IL-1β и IL-6. Лечение ICA, mPEG-ICA и ICA-загруженными NP подавлю эти цитокины, с ICA-загруженными NP достигая наиболее существенного подавления (рис. 11).

Эти находки подтверждают, что ICA-загруженные mPEG-ICA NP обеспечивают усиленную кардиопротекцию, доставляя ICA напрямую к воспаленному миокарду, снижая оксидативный стресс, аоптоз и производство воспалительных цитокинов.

Заключение

Мы успешно сфабриковали ICA-загруженные mPEG-ICA наночастицы через гибридный химико-физический подход, который заметно улучшает растворимость ICA, загрузочную способность и устойчивое, pH-реактивное высвобождение. В ЛПС-вызванных клетках H9c2 эти NP восстановили живучесть клеток, атенировали утечку ЛДГ, ингибировали аоптоз и подавлю экспрессию про-воспалительных цитокинов более эффективно, чем свободный ICA или полимер в одиночку. Данные поддерживают потенциал ICA-загруженных mPEG-ICA NP как целевой наномедицины для лечения воспалительного сердечного повреждения.