Простой синтез безлигандных наночастиц иридия и их биосовместимость in vitro

Фон

Наночастицы благородных металлов являются основой новых нанотехнологий благодаря их интересным оптическим, электронным и поверхностным каталитическим свойствам. В наномедицине эти уникальные биоматериалы привлекли значительное внимание из-за способности адаптировать их биологические взаимодействия посредством модификаций поверхности для широкого спектра применений [1]. Золотые наночастицы (AuNP) широко исследовались для сенсорных и терапевтических применений [2, 3], в то время как другие благородные металлы, включая серебро, нашли нишевое применение, например, в качестве антимикробных средств [4]. Однако наночастицы, состоящие из платиноидных элементов, которые обычно используются из-за их поверхностных каталитических свойств [5], еще предстоит тщательно изучить для биомедицинских приложений. Исключительная стабильность поверхности и известная биологическая совместимость этих элементов, а также их потенциальные новые физические свойства в наномасштабе делают их уникальными альтернативами AuNP.

Излучение высоких энергий широко используется в медицине, в том числе в диагностической визуализации и лучевой терапии. Следовательно, функциональные материалы, которые взаимодействуют с излучением, такие как наночастицы с высоким атомным номером и высокой плотностью, могут улучшить характеристики этих модальностей. Большинство химических и технических исследований на сегодняшний день сосредоточено на AuNP для усиления радиационных взаимодействий, хотя висмут и гафний были исследованы для диагностических и терапевтических применений соответственно [6, 7].

Здесь мы представляем синтетический метод получения наночастиц иридия (IrNP), которые, по прогнозам, будут иметь сильное ослабление излучения из-за своей высокой плотности. Иридий - один из наименее реакционноспособных металлов, который считается в целом биологически совместимым, и имеет элементную плотность 22,56 г / см ³ . (уступает только осмию, который, как известно, очень токсичен). Изотоп иридия, ¹⁹² Ir является широко используемым гамма-излучателем для брахитерапии, и успех этого материала отчасти объясняется его высокой плотностью, то есть большим количеством атомов в небольшом объеме материала. В текущем исследовании мы представляем синтез IrNP и их биосовместимость in vitro, а также синтез ионов иридия, который ранее не оценивался на выбранных клеточных линиях. Эти новые IrNP не были легко исследованы в медицинских целях, несмотря на химическую инертность и превосходную плотность материала. Хотя иридий является относительно дорогим материалом, как и другие благородные металлы, его текущая стоимость как товара составляет примерно три четверти цены золота и половину стоимости родия, что делает его интересной экономической альтернативой.

Методы

Синтез IrNP

Все реакции синтеза проводили при комнатной температуре в аэробных условиях в очищенной воде с сопротивлением 18 МОм. Исходный 20 мМ хлорид иридия (III) (Acros Organics) готовили обработкой ультразвуком в ванне и перемешивали в течение не менее 20 мин для получения оптически прозрачного раствора. Раствор 1,0 М боран-морфолина (Alfa Aesar) также готовили обработкой ультразвуком в ванне. Для более крупномасштабных синтезов с общим объемом 500 мл использовали 25 мл раствора хлорида иридия (III) (разбавленный до 1,0 мМ) и добавляли 5,0 мл боран-морфолина (конечная концентрация 10 мМ) при быстром перемешивании. Раствор постепенно менял цвет от темно-коричневого до черного в течение 30 мин. Наночастицам давали возможность стабилизироваться в течение не менее 60 мин. Этот коллоидный раствор непосредственно добавляли в центрифужные центробежные фильтры (Amicon Ultra-4, регенерированная целлюлоза 10k MWCO), и наночастицы собирали при 4000 × g и промывают очищенной водой. Затем наночастицы суспендировали в воде, пропускали через шприц-фильтр (Millex-MP 0,22 мкм EO) и хранили для количественного определения.

Характеристика наночастиц

Для анализа с помощью рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) наночастицы суспендировали в равном объеме азотной кислоты, собирали центрифугированием в пробирке для микроцентрифугирования (5 мин, 17 rcf) и суспендировали в воде перед анализом. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) была выполнена на ПЭМ FEI Tecnai F-20, работающем при 200 кВ. Очищенные IrNP были отлиты методом капельного литья на решетку ТЕМ с дырчатым углеродом, поддерживаемую Cu (Ted Pella), и высушены при комнатной температуре в течение ночи. Анализ дифракции линий выполняли с использованием программного обеспечения ImageJ для анализа. Для анализа дифракции рентгеновских лучей (XRD) концентрированные IrNP наносили каплей на предметное стекло и сушили при комнатной температуре. Данные XRD были собраны в геометрии сфокусированного луча (Брэгга – Брентано) на рентгеновской дифракционной системе Rigaku Ultima IV с использованием монохроматизированного графита Cu Kα-излучения. Сканирование проводилось в диапазоне углов 20–80 ° 2θ со скоростью сканирования 0,1 ° / мин при комнатной температуре. Динамическое рассеяние света (DLS) выполняли на Malvern Nano ZSP в одноразовых кюветах из полистирола. Наночастицы были взвешены в воде, и данные представлены в разбивке по номерам. Спектры поглощения в УФ-видимой области были получены на Tecan M200 Pro в черном 96-луночном планшете и при общем объеме раствора 100 мкл. Концентрации иридия были скорректированы для иллюстрации пиков относительной абсорбции. XPS-анализ проводился на приборе PHI Versaprobe II, оснащенном полусферическим электронным анализатором и источником рентгеновского излучения на основе алюминия Kɑ (1486,7 эВ). Спектральный анализ проводился с использованием пакета программ Multipak. Калибровку энергии связывания выполняли с использованием пика C1s при 284,6 эВ, и аппроксимация пика была основана на асимметричных пиках и повторяемом фоне Ширли, в результате чего значение хи-квадрат составляло 1,13. Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) IrNPs и раствора хлорида иридия (III) была оценена до анализа биологической токсичности. Пятьдесят микролитров каждого раствора IrNP переваривали в 50 мкл царской водки (3:1 M концентрированная азотная кислота к соляной кислоте) в течение ночи при 70 ° C в пробирке для переваривания. Затем образцы разбавляли 5,0 мл 1% азотной кислоты для анализа. ИСП-МС выполняли на Agilent 7900 с использованием гелия в качестве газа для столкновений. Калибровочные кривые были построены с использованием исходных растворов иридия 100–0,1 мкг / мл (в 1% HCl), и все образцы были разбавлены таким образом, чтобы концентрации измерялись в диапазоне десятков частей на миллиард.

Анализ цитотоксичности

Клеточные линии HepG2 и J774A.1 высевали в количестве 2 × 10 ⁵ . клеток на лунку (100 мкл) в 96-луночном планшете (DMEM с 10% FBS) и дали отстояться в течение 24 часов. Наночастицы иридия, соль иридия, воду или ДМСО добавляли в объеме 10% (дополнительный объем 10 мкл). Затем клетки инкубировали в течение 24 или 48 часов. Для анализа жизнеспособности среду удаляли, и клетки промывали один раз в PBS. Сто микролитров питательной среды с 10% Alamar Blue (Thermo Scientific) инкубировали с клетками в течение 2 часов . Затем среду повторно помещали в черный 96-луночный планшет и считывали флуоресценцию (ex530 / em590) на Tecan M200 Pro. Все данные были выполнены в четырех экземплярах, и эксперименты повторялись в независимые дни для подтверждения общих тенденций. Гемолитический анализ был выполнен, как сообщалось ранее [8].

Результаты

Синтез и характеристика наночастиц иридия

В этом синтезе мы формируем элементарные IrNP из хлоридной соли иридия (III) восстановлением 10-кратным молярным избытком боран-морфолина в воде. Реакция легко масштабируется до нескольких литров, а частицы образуются при комнатной температуре в аэробных условиях. Этот метод синтеза позволяет получать небольшие (2–3 нм) однородные IrNP (рис. 1a) с высокой степенью кристалличности, что наблюдается с помощью изображений ПЭМ с высоким разрешением. Дифрактограммы, полученные с помощью ПЭМ, дополнительно подтверждают идентичность нанокристаллов с шагом между линиями 0,22 нм, что указывает на дифракционную решетку иридия (рис. 1b). Картина дифракции рентгеновских лучей очень похожа на дифрактограмму элементарного иридия (номер карты PDF:9008470, рис. 1c). После синтеза IrNP коллоидно стабильны в воде и остаются суспендированными в растворе в течение нескольких месяцев при комнатной температуре (рис. 1d).

а Наночастицы иридия имеют размер 2–3 нм по данным ПЭМ-изображения, причем b с высококристаллическим параметром решетки. c Спектр XRD соответствует элементарному иридию, и d частицы имеют гидродинамический размер 5 нм в воде по методике DLS

Нанокристаллы образуются в течение 30 минут, что наблюдается по изменению цвета от светло-желтого предшественника иридия (III) до темно-черного раствора наночастиц (рис. 2). При воздействии основной среды эти IrNP образуют предполагаемый оксид иридия, который выглядит синим. Кислые условия, такие как инкубация в чистой азотной кислоте, не влияют на кристалличность частиц или целостность материала; однако он вызывает флокуляцию и осаждение. Кроме того, в течение нескольких часов наблюдалась агрегация в биологически релевантных растворах (фосфатно-солевой буфер и среды для культивирования тканей), что позволяет предположить, что для будущих биомедицинских применений потребуется дальнейшая модификация поверхности. Рентгеновский фотоэлектронный спектроскопический анализ IrNP, промытых в азотной кислоте и суспендированных в воде, выявляет преобладающую поверхность иридия (0), хотя анализ соответствия пиков данных указывает на 20% -ное окисление поверхности (рис. 3). Никакой предпочтительной ориентации кристаллитов частиц не наблюдается ни с помощью XRD, ни с помощью XPS. В качестве альтернативы введение тиолового поверхностно-активного вещества в реакционный раствор во время процесса синтеза (до зародышеобразования) привело к ингибированию образования частиц.

Хлорид иридия (III) выглядит бледно-желтым с пиками поглощения при 324 и 386 нм. IrNP являются поглотителями широкого спектра и кажутся черными. Оксид иридия (прогнозируемый), полученный из окисленных IrNP, обработанных в основном растворе, выглядит сине-пурпурно-пурпурным с пиком поглощения при 584 нм

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS) IrNPs с преобладающим поверхностным состоянием элементарного иридия с примерно 20% загрязнением поверхности оксидом

Цитотоксичность иридия

Мы оценили биологическую совместимость незащищенных IrNP in vitro и сравнили ее с хлоридной солью иридия (III) в двух типах клеток млекопитающих. HepG2, клеточная линия карциномы гепатоцитов, была использована для оценки потенциальной токсичности для печени. Клетки макрофага J774A.1 использовали для оценки токсичности для мононуклеарной фагоцитарной системы. Клетки инкубировали с IrNP или хлоридом иридия (III) (нормализованным для общей концентрации иридия) в течение 24 или 48 часов и промывали для удаления внеклеточного иридия, а метаболическую активность оценивали с помощью анализа Alamar Blue (рис. 4). Клетки HepG2 демонстрируют повышенную метаболическую активность в присутствии иридия (III) через 24 часа (до 115% жизнеспособности), но ответ смягчается к 48 часам, а 500 мкМ иридия (III) снижают жизнеспособность до 90%. Клетки HepG2 имели пониженную клеточную жизнеспособность с 94 до 78% в присутствии 50 мкМ IrNP через 24 и 48 часов. Интересно, что клетки J774A.1 показывают увеличение метаболической активности в ответ на IrNPs при концентрации 50 мкМ с жизнеспособностью 122% через 24 часа; однако через 48 часов нормальная клеточная функция восстановилась (жизнеспособность 98%), что свидетельствует о временной метаболической стимуляции в ответ на наноматериалы. Клетки J774A.1, инкубированные с 500 мкМ IrNP в течение 24 часов, демонстрируют явно нейтральный метаболический ответ, но снижение жизнеспособности при этой концентрации через 48 часов предполагает, что это результат токсичности и метаболической стимуляции, который проявляется как нейтральный ответ жизнеспособности. Кроме того, мы оценили биосовместимость IrNP с кровью in vitro с помощью гемолитического анализа и обнаружили, что IrNP не вызывает значительного гемолиза при инкубации с эритроцитами в PBS при 37 ° C в течение 1 часа (дополнительный файл 1:рисунок S1).

Жизнеспособность клеток HepG2 и J774A.1, инкубированных с наночастицами Ir (0) или солью Ir (III) в течение 24 или 48 часов. * Статистически значимые значения ( p <0,05) по сравнению с необработанными клетками

Обсуждение

Были исследованы различные синтетические процессы для получения наноразмерного иридия для каталитических применений, включая восстановление солей иридия гидридами и газообразным водородом [9,10,11,12,13], УФ- и гамма-излучением [14,15,16,17], и восстановление полиола или спирта [18,19,20]. Однако многие из этих синтетических методов предназначены для интеграции иридия на подложку или основу для химических реакций и несовместимы с биологическими приложениями [21]. Недавно было выпущено ¹⁹² в виде аэрозоля. Ir был использован в качестве модельных наноразмерных материалов для легочной токсичности и был выбран из-за его исключительной инертности [22, 23]. Основная цель этих исследований заключалась в изучении выведения и перемещения вдыхаемых мелких частиц из легких; однако это также подчеркивает биосовместимость этого элемента.

Мы оценили биологическую совместимость незащищенных IrNP in vitro и сравнили ее с хлоридной солью иридия (III) в двух типах клеток млекопитающих, которые, как ожидается, будут накапливать самые высокие концентрации введенных наночастиц. Токсичность иридия (III) в клетках J774A.1 соответствует нормальной кривой доза-ответ токсичности; 100 мкМ иридия (III) снижает жизнеспособность клеток до 93 и 66%, а 500 мкМ приводит к 40 и 10% жизнеспособности клеток через 24 и 48 часов соответственно. Эти данные отражают интересный клеточно-специфический ответ на иридий (0) и иридий (III), и мы ожидаем дальнейшего изучения этих эффектов in vivo. Ожидается, что меньшие по размеру IrNP и другие плохо растворимые неорганические наноматериалы будут перемещаться в почки и печень с коротким временным пребыванием в почках и более длительным пребыванием в печени, что может дополнительно повлиять на профили специфической для клеток токсичности. Ожидается, что более крупные частицы иридия выводятся через фекалии, хотя мы ожидаем, что чрезвычайно маленький размер этих IrNP может быть легко отфильтрован через почечную систему, если может быть сохранена коллоидная стабильность in vivo [23].

При подготовке к применению in vivo совместимость IrNP с кровью оценивали с помощью гемолитического анализа. Используя цельную кровь мышей, мы оценили влияние этих IrNP на разрыв эритроцитов и возможное высвобождение гемоглобина. Хотя необходимо будет провести углубленные исследования окончательного IrNP с модифицированной поверхностью, существующие строительные блоки IrNP не вызывают детектируемого гемолитического ответа до тех пор, пока не будут достигнуты чрезвычайно высокие концентрации (500 мкМ).

Выводы

На основании этих исследований мы пришли к выводу, что нанокристаллы иридия (0) могут быть легко синтезированы путем простого восстановления хлорида иридия (III) водным борогидридом, что приводит к образованию высококристаллических наночастиц размером 2–3 нм, которые коллоидно стабильны в воде с гидродинамическими параметрами примерно 5 нм. размер. Во время острого воздействия эти частицы нетоксичны при концентрациях до 50 мкМ иридия (по сравнению с 10 мкМ для хлорида иридия) в гепатоцитах, стимулируют метаболическую активность в клетках макрофагов и не вызывают гемолитического ответа при практических концентрациях. Эти безлигандные наночастицы могут служить строительными блоками или ядрами для последующих поверхностно-модифицированных IrNP для использования в биологических и медицинских приложениях. Дальнейшее исследование функциональных свойств этих наноматериалов высокой плотности в присутствии рентгеновских лучей или другого излучения открывает возможность для новых терапевтических и диагностических агентов.

Сокращения

AuNP:

Золотая наночастица

DLS:

Динамическое рассеяние света

ICP-MS:

Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой

IrNP:

Наночастица иридия

PDF:

Файл порошковой дифракции

UV:

Ультрафиолет

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

XRD:

Рентгеновская дифракция