Легкое приготовление in situ и антибактериальная активность in vitro мицелл серебросодержащего сополимера на основе PDMAEMA

Введение

В последние несколько десятилетий ряд традиционных противомикробных средств широко использовался для лечения инфекционных заболеваний. По данным Всемирной организации здравоохранения, быстрое появление микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью становится все более серьезной глобальной проблемой, которая входит в тройку лидеров в списке основных угроз для здоровья человека [1,2,3,4,5]. Следовательно, необходимо разработать новые противомикробные средства с хорошей безопасностью, эффективными антибактериальными свойствами, не вызывающими устойчивости к бактериям. Наночастицы серебра (AgNP) как один из лучших антимикробных агентов с древних времен широко использовались в потребительских товарах из-за их превосходных характеристик против различных бактериальных и грибковых патогенов, относительно низкой токсичности для клеток млекопитающих и ограниченной устойчивости бактерий [6,7, 8,9,10]. AgNP способны улучшать проницаемость мембран бактерий, проникать в цитоплазму, денатурализовать бактериальные белки и нарушать репликацию бактерий, что приводит к гибели бактерий [11,12,13]. Большое количество препаратов серебра было использовано для выяснения антибактериальной активности AgNPs [14,15,16,17], например, повязка на рану через цвиттерионный поликарбоксибетаиновый гидрогель вместе с антибактериальными AgNPs в качестве основного компонента, предложенного Zhang et al. i>. [18], многофункциональные поверхности, полученные путем многокомпонентного покрытия для совместной иммобилизации AgNP, предложенные Морено-Куранжу и др. [19] .

Однако большая удельная поверхность и высокая поверхностная энергия привели к агрегации AgNP, которая стала большим узким местом для их применения. Таким образом, для стабилизации AgNP необходима полимерная матрица или внешний стабилизатор. Как известно, полимерная матрица является наиболее распространенным методом решения проблемы агрегации. В настоящее время используются несколько методов стабилизации AgNP с полимерной матрицей, такие как метод химического восстановления, электрохимический метод, фотохимический метод и микроволновый метод. Среди них химическое восстановление - распространенный и эффективный метод. Нитрат серебра восстанавливается до AgNP путем добавления восстановителей, таких как гидразингидрат (N ₂ H ₄ ), боргидрид натрия (NaBH ₄ ), цитрат натрия и аскорбиновая кислота в растворе [20,21,22,23]. Например, Hoda et al. готовая полистирол-блок-полиакриловая кислота (PS- b -PAA) обратные мицеллы, нагруженные 20 нм AgNP под действием восстановителя N ₂ H ₄ , а блоки ПС играли внешний слой в толуоле [24]. Группа Лю сообщила, что наночастицы самоорганизующихся мицелл были приготовлены из поли (ε-капролактон) -блок-поли (аспарагиновой кислоты) (PCL- b -PAsp). Хорошо диспергированные AgNP были приготовлены с AgNO ₃ в качестве предшественника и NaBH ₄ как редуктор [25]. Однако указанные выше методы не были экологически безопасными, а добавление избыточных восстановителей приводило к образованию побочных продуктов, что затрудняло очистку AgNP и ограничивало их применение противомикробных препаратов для борьбы с инфекционными заболеваниями.

Между тем, сообщалось, что полимеры, содержащие аминогруппу, можно использовать как в качестве восстановителя, так и в качестве стабилизатора для получения AgNP in situ. Например, Lang et al. синтезировали шестилучевые звездчатые полимеры, состоящие из PCL, 2- (диметиламино) этилметакрилата (DMAEMA) и метакрилата метилового эфира полиэтиленгликоля (PEGMA). Система напрямую восстанавливала нитрат серебра до AgNP без добавления какого-либо другого восстановителя в водную фазу [26]. Хотя упомянутые выше AgNPs обеспечивают легкую модификацию поверхности без дополнительного восстановителя, по сравнению с наночастицами золота [27, 28], влияние топологии полимера на восстановление и стабильность наночастиц серебра наряду с их применением в антибактериальной активности на основе мицелл меньше учился.

В этой работе был разработан мягкий, простой и экологичный подход к борьбе с бактериальными инфекциями, использующий преимущества полимерных мицелл, самоорганизующихся из линейных или четырехзвенных звездчатых триблочных сополимеров с такой же молекулярной массой и степенью полимеризации, что и наноплатформа. для украшения АгНЧ (схема 1). При таком подходе триблок-сополимеры, состоящие из DMAEMA, 2-гидроксиэтилметакрилата (HEMA) и PEGMA, могут генерировать самоорганизующиеся мицеллы в водном состоянии, что является хорошим шаблоном для получения и стабилизации AgNP. Блоки PDMAEMA с третичными аминогруппами могут легко поглощать Ag ⁺ ионы посредством координационного взаимодействия, а затем in situ генерируют AgNP без какого-либо восстановителя. Блоки HEMA и PEGMA с высокой гидрофильностью можно использовать в качестве стабилизаторов в водной фазе для дальнейшего улучшения стабильности AgNP. Следовательно, нитрат серебра может самопроизвольно координироваться и раскисляться на ядре самоорганизующихся мицелл сополимера с образованием AgNP. Они были встроены в мицеллярное ядро ​​и могли привести к разрушению бактериальной мембраны. Здесь недостаточно полно исследовано, как линейная или четырехлепестковая топология звездообразного сополимера влияет на максимальную длину волны поглощения, морфологию, размер частиц, дзета-потенциал, стабильность, а также на антибактериальную эффективность AgNP. Таким образом, исследование взаимосвязи между структурой и свойствами может дать подробное объяснение гибридных наночастиц серебра для лечения бактериальных инфекций. Кроме того, он предоставит конструктивные идеи и техническую основу для получения AgNP с более стабильной структурой и контролируемым размером частиц.

Схематическое изображение образования линейных / звездообразных сополимеров, стабилизированных мицеллами AgNP, обеспечивающих превосходную антибактериальную активность

Материалы и методы

Материалы

Пентаэритрит ( J&K Scientific Ltd.) перед использованием сушили при пониженном давлении в течение 24 часов. 2- (Диметиламино) этилметакрилат (DMAEMA,> 98%), 2-гидроксиэтилметакрилат (HEMA, 99%) и метакрилат метилового эфира полиэтиленгликоля (PEGMA, M _n =300 Да, 99%), все от Aldrich, очищали путем пропускания через колонку, содержащую нейтральный оксид алюминия, для удаления ингибитора. За счет использования гидрида кальция (CaH ₂ ), тетрагидрофуран (THF) и толуол от Aldrich сушили, а затем перегоняли при пониженном давлении перед использованием. Этил-2-бромизобутират (EBiB, 98%, Alfa Aesar), 2-бромизобутирилбромид (BIBB, 98%, Alfa Aesar), 1,1,4,7,10,10-гексаметилтриэтилентетрамин (HMTETA, 99%), нитрат серебра (AgNO ₃ , 99,9%), бромид меди (CuBr ₂ ), метанол, триэтиламин (TEA), дихлорметан (DCM), ацетон, n -гексан, диметилсульфоксид (ДМСО), октоат олова (Sn (Oct) ₂ ), карбонат натрия (Na ₂ CO ₃ ), бикарбонат натрия (NaHCO ₃ ), хлорид натрия (NaCl), сульфат натрия (Na ₂ SO ₄ ) и все другие реагенты, полученные от J&K Химическая компания использовалась в полученном виде.

Общая характеристика и инструментарий

Протонный ядерный магнитный резонанс ( ¹ H ЯМР) спектры линейных или четырехзвенных триблочных сополимеров были обнаружены в CDCl ₃ , и D ₂ O при 25 ° C через спектрометр Bruker ADVANCE 400 МГц (Мэдисон, Висконсин, США). Измерения спектров инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) линейных сополимеров, звездообразных сополимеров и их стабилизированных мицеллами AgNP проводили с использованием спектрофотометра FT IR (Nicolet Nexus для Европы, США), оборудованного режимом пропускания при 25 ° C. Гранулированные образцы были приготовлены после измельчения с бромидом калия (KBr) и последующего прессования. Для получения спектра предварительно были установлены спектральные условия с длиной волны от 4000 до 400 см ⁻¹ . (32 сканирования) и разрешение 8 см ⁻¹ . Дзета-потенциалы линейных и звездообразных сополимеров, стабилизированных мицеллами AgNP при различных молярных соотношениях, измеряли с помощью электрофоретического измерения с помощью прибора Malvern Zetasizer Nano S (Malvern, WR, UK), в котором каждый образец тестировали три раза при 25 ° C. Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ, FEI Tecnai-G20), работающая при 200 кВ, была проведена для наблюдения морфологии AgNP, стабилизированных мицеллами линейных и звездообразных сополимеров при различных молярных соотношениях. Процесс приготовления продукта для ПЭМ был следующим:10 мкл раствора образца сначала капали на медную сетку, покрытую углеродом, а затем сушили на воздухе. УФ-видимые спектры линейных и звездообразных сополимеров, стабилизированных мицеллами НЧЧ при различных молярных соотношениях, определяли с использованием спектрофотометра УФ-видимого диапазона (UV-2450, Shimadzu, Kyoto, Japan). Термогравиметрический анализ (ТГА) проводили на приборе NETZSCH (STA409PC, Германия). Все образцы высушенных порошков (линейные сополимеры, звездообразные сополимеры и их стабилизированные мицеллами AgNP) нагревали от 25 до 600 ° C со скоростью 10 ° C / мин в условиях азота.

Синтез PDMAEMA- b -PHEMA- b -ПЭГМА

Активаторы непрерывного действия, регенерированные радикальной полимеризацией с переносом атома с переносом электрона (AGERT ATRP) DMAEMA, HEMA и PEGMA, проводили в соответствии с процедурой, модифицированной из Zhang et al. [29, 30]. Вкратце, после добавления CuBr ₂ (10 мг, 0,045 ммоль), из сухой трехгорлой колбы на 100 мл откачивали воздух и трижды промывали аргоном. С помощью вспомогательного средства в виде дегазированного шприца в контейнер последовательно вводили безводный толуол (25 мл), EBiB (88 мкл, 0,24 ммоль), DMAEMA (5,15 мл, 30,5 ммоль) и лиганд HMTETA (62 мкл, 0,24 ммоль), 10-минутное перемешивание. После инъекции Sn (окт.) ₂ (78 мкл, 0,24 ммоль) с толуолом (2 мл) в качестве раствора, реакцию проводили при 70 ° C на масляной бане в течение 8 часов. Последовательный блок HEMA (2,32 мл, 18,4 ммоль) вводили на следующие 8 часов реакции после того, как раствор стал намного гуще. Наконец, с участием третьего мономера ПЭГМА (8,89 г, 55,6 ммоль) мы наблюдали 72-часовую непрерывную реакцию до охлаждения колбы почти до комнатной температуры. В контейнер вводили ТГФ (30 мл), и затем реакционную смесь пропускали через колонку с нейтральным оксидом алюминия для удаления катализатора. Изделие ПДМАЭМА- б -PHEMA- b -ПЭГМА был осажден десятикратным избытком холода n -гексан, фильтровали и окончательно сушили под вакуумом в течение 48 ч при 35 ° C.

Синтез (PDMAEMA- b -PHEMA- b -ПЭГМА) ₄

Инициатор с концевым бромом звездообразного типа (Br) ₄ был синтезирован этерификацией концевых гидроксильных групп, присутствующих в пентаэритрите, 2-бромизобутирилбромидом с использованием ТГФ в качестве растворителя и ТЭА в качестве связывающего кислоту агента. Обычно после загрузки пентаэритрита (2,72 г, 2 ммоль) из трехгорлой колбы на 100 мл откачивали воздух и трижды промывали аргоном после последовательного введения по каплям безводного ТГФ (120 мл) и TEA (12,51 мл, 90 ммоль). . В условиях ледяной воды в интенсивно перемешиваемый раствор по каплям вводили 2-бромизобутирилбромид (11,12 мл, 90 ммоль) после 4-часовой реакции при 0 ° C, а затем 20 часов при 25 ° C. Для очистки продукта смесь сначала пропускали через колонку с нейтральным оксидом алюминия. Неочищенный продукт последовательно промывали водой, 10% Na ₂ . CO ₃ , насыщенный NaHCO ₃ , и насыщенный NaCl, затем последовательно сушили через Na ₂ SO ₄ на ночь, профильтровали и сконцентрировали, прежде чем вылить в десятикратный избыток холода n -гексан для осаждения продукта и, наконец, сушку под вакуумом в течение 24 ч для получения продукта.

Пути синтеза и количества (PDMAEMA- b -PHEMA- b -ПЭГМА) ₄ проводился с использованием той же процедуры, что и PDMAEMA- b -PHEMA- b -ПЭГМА.

Получение AgNP с использованием линейных или звездообразных сополимерных мицелл

PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA или (PDMAEMA- b -PHEMA- b -ПЭГМА) ₄ водный раствор (pH 7,0) был получен первым, в котором AgNO ₃ раствор был добавлен при запуске реакции восстановления DMAEMA с помощью Ag ⁺ с образованием AgNP in situ в мицеллярном ядре. Принятие мольного соотношения DMAEMA и AgNO ₃ равно 9, во-первых, PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA или (PDMAEMA- b -PHEMA- b -ПЭГМА) ₄ с таким же количеством [DMAEMA] =4,8 мМ, перемешивают в ацетоне (5 мл) в течение 4 часов, после чего добавляют дистиллированную воду (20 мл) при перемешивании в течение ночи с образованием стабильных мицелл. Тогда AgNO ₃ раствор (220 мкл, 48 мМ) по каплям вводили в указанный выше раствор и перемешивали при 25 ° C в темноте в течение 48 часов. Наконец, стабилизированные линейными или звездообразными полимерными мицеллами AgNP были получены путем сбора и сушки вымораживанием перед хранением при -20 ° C для следующих экспериментов.

Антибактериальный анализ

Антибактериальные исследования AgNP, стабилизированные полимерными мицеллами, были проведены против Escherichia coli DH5alpha ( E . кишечная палочка DH5α) с использованием среды Лурия-Бертани (LB) в качестве носителя для приготовления различных концентраций растворов AgNP, стабилизированных полимерными мицеллами, с помощью ультразвука. Моноклональный E . кишечная палочка DH5α культивировали в течение ночи в среде LB (5 мл) при 37 ° C на шейкере при 200 об / мин, прежде чем бактериальная суспензия была разбавлена ​​до 1 × 10 ⁵ КОЕ / мл в среде LB. После смешивания равного объема разбавленных бактерий с различными концентрациями сополимерных мицелл или стабилизированных мицеллами AgNP и инкубации при 37 ° C в течение 16 ч изменение оптической плотности на длине волны 600 нм было охарактеризовано микропланшетным ридером (Multiskan Spectrum, Thermo Scientific, Вантаа, Финляндия). Каждый анализ повторяли шесть раз.

Оценка жизнеспособности ячейки

Для оценки жизнеспособности клеток был проведен анализ 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) с клетками гепатоцеллюлярной карциномы печени (HepG2). Перед посевом клеток клетки HepG2 сначала инкубировали в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ при 37 ° C в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллина (100 мкл / мл) и стрептомицина (0,1 мг / мл). Затем клетки HepG2 высевали в свежую среду DMEM на 96-луночный планшет с плотностью 1 × 10 ⁴ . на лунку и культивировали в течение 1 дня. После замены среды DMEM на заранее приготовленные мицеллы сополимера или стабилизированные мицеллами растворы AgNPs (100 мкл) при различных концентрациях, клетки продолжали культивировать в течение следующих 24 часов. После трехкратной промывки буфером PBS добавляли 20 мкл реагента МТТ (5 мг / мл) и 180 мкл свежего DMEM и инкубировали еще 4 часа. Наконец, раствор заменяли 200 мкл ДМСО и планшет осторожно встряхивали в течение 10 мин. Поглощение при 570 нм измеряли с помощью вышеупомянутого ридера для микропланшетов. Были усреднены данные шести параллельных экспериментов.

Моделирование динамики диссипативных частиц

Для анализа процесса роста AgNP было проведено моделирование динамики диссипативных частиц (DPD), основанное на крупнозернистых моделях, с использованием модуля мезоцита Materials Studio 8.0 (Accelrys Inc., Сан-Диего, Калифорния, США, США). США). Как показано в Дополнительном файле 1:Рисунок S1, шесть видов шариков составляли сополимеры PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA или (PDMAEMA- b -PHEMA- b -ПЭГМА) ₄ :оранжевая подставка для центра, светло-зеленый для MAA1 (метакрилат рядом с боковой цепью этиламина), зеленый для DMA (аминоэтильная боковая цепь), розовый для HEMA, голубой для MAA2 (метакрилат рядом с боковой цепью PEG) и синий для ПЭГ. Небольшой кластер с кристаллом элементарной ячейки (длина решетки:3,87 Å) состоял из четырех атомов серебра, отмеченных серебряной бусиной (золотого цвета). При этом каждая капля воды (W) черного цвета содержала пять молекул воды. Согласно нашей предыдущей работе, Дополнительный файл 1:Таблица S1 показывает результат расчета параметров взаимодействия [31, 32]. 30 × 30 × 30 r _c ³ кубический блок моделирования с периодическими граничными условиями использовался во всех направлениях с общим числом шагов моделирования 100 000 и временным шагом интегрирования 0,05 нс.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием двухвыборочного критерия Стьюдента t тест с неравной дисперсией. p <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика линейных / звездообразных сополимеров

Линейные сополимеры ПДМАЭМА- b -PHEMA- b -ПЭГМА и звездообразные сополимеры (ПДМАЭМА- b -PHEMA- b -ПЭГМА) ₄ были синтезированы ARGET ATRP-полимеризацией DMAEMA, HEMA и PEGMA с CuBr ₂ / HMTETA в качестве катализатора, Sn (окт.) ₂ в качестве восстанавливающего агента и EBiB или пентаэритритол, который ранее был ацилирован BIBB в качестве инициатора в толуоле (схема 2). Структура и состав целевых полимеров подтверждены ¹ H ЯМР. Полимерные мицеллы были самоорганизованы из PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA или (PDMAEMA- b -PHEMA- b -ПЭГМА) ₄ с DMAEMA в качестве функционального блока, где Ag ⁺ ионы были привлечены и восстановлены в AgNP без участия дополнительного восстановителя. Влияние топологической структуры сополимеров на AgNP обсуждалось и оценивалось по физико-химическим свойствам, антибактериальной и противоопухолевой активности.

Синтетические маршруты а PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA и b (PDMAEMA- b -PHEMA- b -ПЭГМА) ₄

Химическая структура линейных / звездообразных сополимеров подтверждена ¹ H ЯМР. Во-первых, концевые гидроксильные группы пентаэритрита были полностью перенесены на концевую группу брома (Br) ₄ , как показано на ¹ Спектр ЯМР 1Н (Дополнительный файл 1:Рисунок S2). Пик при 4,33 м.д. был отнесен к -C H ₂ О- в пентаэритрите, а новый - (C H ₃ ) ₂ - появился сигнал при 1,94 ppm. И значения коэффициента интегрирования пиков от 1,94 до 4,33 частей на миллион были около 3. Как показано в Дополнительном файле 1:Рисунок S3 и S4, пик -C (C H ₃ ) ₂ - появился на уровне 1,94 промилле. Сигналы при 1,83 м.д., 1,00 м.д. были отнесены к -C H ₂ - и -CC H ₃ - в основных цепях метилметакрилата соответственно. Пики при 2,58 и 4,08 частей на миллион принадлежали характеристическим резонансам двух соседних протонов метилена -C H ₂ C H ₂ - в блоке DMAEMA, и пик при 2,29 м.д. был отнесен к протонам метила -C H ₃ -, который был присоединен к третичной аминогруппе. Наличие -C H ₂ C H ₂ - метиленовые протоны, связанные с концевой гидроксильной группой в HEMA-звене, появляются при 4,08 м.д. и 3,57 м.д., соответственно. Характерные пики ПЭГ -OC H ₂ C H ₂ - и терминал -C H ₃ протоны появлялись при 3.67 и 3.39 м. д. соответственно. Пики двойной связи при 5,5–6,1 м.д. исчезли в ¹ Спектры ЯМР 1Н. Вычислено из значений коэффициента интегрирования сигнала (f) - (a) ( I _f / Я _а ), сигнал (g) - (a) ( I _g / Я _а ) и сигнал (h) - (a) ( I _h / Я _а ) соответственно PDMAEMA _19.3 - b -PHEMA _12,5 - b -ПЭГМА _24,6 и (PDMAEMA _5.0 - b -PHEMA _5.6 - b -ПЭГМА _5.0 ) ₄ были получены.

Получение и характеристика AgNP, стабилизированных линейными / звездчатыми сополимерными мицеллами

Процесс образования AgNP показан на схеме 1. Неподеленная пара электронов на атоме N, принадлежащая к группе третичного амина в молекулярной цепи PDMAEMA, обладающая способностью к координации и восстановлению, поэтому ее можно использовать как в качестве улавливающего агента. и восстановитель. Во-первых, ионы серебра были захвачены PDMAEMA из-за комплексообразования между Ag ⁺ и атом N, образуя (Ag ⁺ ) -PDMAEMA комплекс. Впоследствии Ag ⁺ восстанавливались in situ с образованием атомов серебра на стадии зародышеобразования. После этого зарождение Ag продолжилось с ростом кристалла Ag, что привело к образованию AgNP [26]. Гидрофильный блок ППЭГМА действует как мицеллярная оболочка, которая обеспечивает устойчивый защитный слой и дополнительно повышает стабильность AgNP. Эффект стерической стабилизации самоорганизованных мицелл внутри системы определялся термодинамическим равновесием мицелл при стабилизации AgNPs и агломерации AgNPs. В случае небольшого количества AgNP, стерическая стабилизация сополимера может предотвратить дальнейшую агрегацию AgNP. С увеличением количества Ag устойчивость мицелл к AgNPs будет ослаблена, и тогда вероятность столкновения между частицами будет возрастать, что приведет к увеличению размера AgNPs. Воспользовавшись преимуществами пространственной стабилизации мицелл, полученные нами AgNP имеют контролируемый размер частиц, что имеет большой потенциал для антибактериального применения.

Моделирование DPD было выполнено для исследования процесса роста и распределения AgNP с теми же концентрациями, что и в реальном эксперименте (PDMAEMA / AgNO ₃ молярное соотношение =1/1, объемные доли линейных сополимеров, Ag и водных шариков составляют 10%, 0,23% и 89,77% соответственно). На рисунке 1 показано, что шарики из PDMAEMA- b -PHEMA- b -ПЭГМА и AgNP изначально показали неравномерное распределение в водном растворе. По прошествии времени восемь самоорганизующихся мицелл сополимера, наконец, сформировались и равномерно диспергировались, в то время как все шарики Ag были загружены в мицеллы. Можно видеть, что AgNPs в равновесии могут быть стабилизированы в мицеллах сополимера без дальнейшей агрегации, что указывает на то, что самоорганизованные мицеллы были способны предотвратить дальнейшую агрегацию AgNPs, а затем достигли цели контроля размера и распределения их частиц.

DPD-моделирование процесса роста и распределения AgNP с помощью PDMAEMA- b -PHEMA- b -ПЭГМА при PDMAEMA / AgNO ₃ молярное отношение =1/1 в разное время моделирования. а Молекулы воды были скрыты для наглядности. б Были показаны только AgNP

Характеристики линейных / звездообразных сополимеров и их стабилизированных мицеллами AgNP были показаны в Дополнительном файле 1:Рисунок S5. Очевидно, что по сравнению с простыми линейными / звездообразными сополимерами валентное колебание -COOR при 1730 см ^-1 и изгибная вибрация связи C-N в PDMAEMA при 1457 см ^-1 уменьшилось после образования AgNPs, указывая на то, что AgNPs были успешно загружены на мицеллы сополимера. Кристаллическая природа AgNP, стабилизированных мицеллами линейных / звездчатых сополимеров, была подтверждена спектром дифракции рентгеновских лучей (дополнительный файл 1:Рисунок S6). Значения дифракционных пиков 38,5 °, 44,8 °, 64,2 ° и 78,0 ° соответствовали кристаллическим граням (111), (200), (220) и (311) гранецентрированной кубической (ГЦК) кристаллической структуры. наночастиц, содержащих Ag [33, 34]. Были измерены дзета-потенциалы линейных / звездчатых сополимеров, стабилизированных мицеллами AgNP. Как показано на рис. 2, дзета-потенциалы этих стабилизированных мицеллами сополимера AgNP были около 15,0–23,2 мВ. Более того, с увеличением количества AgNO ₃ дзета-потенциал AgNP, стабилизированных мицеллами, заметно увеличился из-за декорирования большего количества AgNP. Для дальнейшего исследования дисперсии AgNP и стабилизирующего действия мицелл на AgNP, моделирование DPD линейных / звездообразных сополимеров мицелл стабилизировало AgNP при различных PDMAEMA / AgNO ₃ молярные отношения. Как показано на рис. 2, результаты также продемонстрировали, что размеры AgNP были пропорциональны отношениям, в которых количество агрегированных небольших AgNP увеличивалось, а расстояние между ними уменьшалось, что приводило к увеличению вероятности столкновения и агломерации.

Дзета-потенциалы и поперечные сечения a линейный и b звездчатые сополимеры, стабилизированные мицеллами AgNPs. Данные были собраны с разными PDMAEMA / AgNO ₃ молярные отношения:(a) 1/1, (b) 3/1, (c) 6/1, (d) 9/1

Спектры четырех линейных сополимеров, стабилизированных мицеллами наночастиц Ag, имели небольшую разницу в максимальном пике поглощения, расположенном около 437 нм, который был характерным пиком поглощения поверхностного плазмонного резонанса (ППР) сферических / почти сферических наночастиц Ag, связанных как с резонансным возбуждением, так и с межзонным переходом их (рис. 3а). Результат доказал, что группа третичного амина в линейных сополимерах может реагировать с нитратом серебра и образование AgNP практически не зависит от стерических затруднений мицелл линейных сополимеров. Впоследствии в звездообразных сополимерах с аналогичной степенью блокирования и полимеризации при тех же условиях размер частиц AgNP уменьшался, когда PDMAEMA / AgNO ₃ молярное соотношение увеличилось. Это отражалось через гипсохромный сдвиг в УФ-видимых спектрах, где максимальные пики поглощения приходились на 429 нм, 426 нм, 421 нм и 414 нм, соответственно, из-за разного количества AgNP, образованных за счет координационного восстановления на третичном амине. мицелл звездчатого сополимера (рис. 3б). Другими словами, стерическая стабилизация звездчатых сополимеров могла бы лучше стабилизировать AgNPs и предотвратить его дальнейшую агрегацию при небольшом количестве AgNPs. Напротив, увеличение количества AgNP ослабило стабилизирующий эффект, что предоставило больше возможностей для столкновения AgNP и, наконец, привело к увеличению AgNP. Сравнивая рис. 3a с рис. 3b, пики поглощения при 437 нм AgNP в мицеллах линейного сополимера имеют более широкое распределение длин волн, в то время как AgNPs в мицеллах звездчатого сополимера имеют примерно 422 нм. При этом не наблюдалось синего сдвига в спектрах линейных сополимеров, что можно объяснить тем, что блоки мицелл линейных сополимеров более слабо влияют на стерическое препятствие для AgНЧ, что приводит к увеличению вероятности столкновительной агломерации между AgNPs.

УФ-видимые спектры a линейный и b звездчатые сополимеры, стабилизированные мицеллами AgNP при различных PDMAEMA / AgNO ₃ молярные отношения:(a) 1/1, (b) 3/1, (c) 6/1, (d) 9/1

Затем были проведены измерения ПЭМ для определения размера, распределения по размерам и морфологии AgNP. ПЭМ-изображения AgNP зависели от AgNO ₃ пропорции подачи показаны на рис. 4. Когда PDMAEMA / AgNO ₃ молярные отношения составляли 6 и 1, рассчитанные с использованием программного обеспечения ImageJ, размер частиц AgNP, стабилизированных мицеллами линейных сополимеров, составлял 11,1 нм и 25,7 нм, в то время как диаметр AgNP, стабилизированных мицеллами звездообразных сополимеров, составлял 3,7 нм и 6,4 нм, соответственно. Увеличение AgNO ₃ Содержание привело к большему количеству атомов серебра в мицеллах, более высокой поверхностной энергии, и количество агрегированных наночастиц Ag увеличивается соответственно с увеличением размера наночастиц Ag. Было ясно, что стабилизированные мицеллами AgNPs были монодисперсными и сферическими с несколько неровными из линейных стабилизированных мицелл сополимера AgNPs. Размеры стабилизированных мицеллами наночастиц AgNP дополнительно дополняли результаты в УФ-видимой области.

ТЕМ-изображение a , b линейные сополимеры и c , d звездчатые сополимеры, стабилизированные мицеллами AgNP при различных PDMAEMA / AgNO ₃ молярные отношения: a , c 6/1, б , d 1/1

Стабильность AgNP, стабилизированных мицеллами линейных / звездообразных сополимеров

The stability of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs is of great influence for the development of biomedical field. Obviously, the SPR peak in UV-Vis spectra (Fig. 5) of star copolymer micelles stabilized AgNPs did not display any significant changes for at least 1 month even after further diluted by one time, three times, and six times, indicating that the prepared AgNPs appeared well long-term colloidal stability within the experimental concentration range. However, the results of linear copolymer micelles stabilized AgNPs showed that the UV absorption wavelength decreased slightly as the increase of dilution ratios. And the micelles concentration of linear copolymer decreased after 1 month of placement may lead to insufficient provision of steric hindrances to stabilize AgNPs.

UV-Vis spectra of a linear copolymers and b star copolymers micelles stabilized AgNPs solution at PDMAEMA/AgNO₃ molar ratio =6/1 after 1 month at the diluted times of 1 (a), 3 (b), and 6 (c), respectively

From the thermogravimetric analysis curves in Fig. 6, it was shown that the initial decomposition temperature (T _начало ) of linear copolymers micelles was 217 °C, which shifted to 172 °C after silver loading, suggesting that the linear copolymer micelles stabilized AgNPs showed lower thermal stability than the pure linear copolymers micelles. It may be due to the fact that the chemical structure of PDMAEMA in the molecular chain changes and the catalytic effect of AgNPs in the thermal degradation process cannot be ignored [35]. As for star copolymers and their stabilized AgNPs, T _начало were around 213 °C. The two T_onset of star copolymers micelles and their micelles stabilized AgNPs showed very few gaps, which could be speculated that the more stable star-shaped copolymers have better effect on stabilizing AgNPs than the linear copolymers. Combined the results of UV-Vis, TEM, and TGA measurements, it could be inferred that compared to the linear copolymers, the star copolymers have superior advantages in topology for stabilizing AgNPs, such as better stability, more uniform dispersion, slower nucleation rate during reduction, and the better product with a smaller and more uniform size of AgNPs.

TGA curves of a linear copolymers and b star copolymers micelles and their micelles stabilized AgNPs at PDMAEMA/AgNO₃ molar ratio =6/1

Antibacterial Activity and Cell Viability

To evaluate the antibacterial activities of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs by optical density (OD₆₀₀ ) measurements, E . coli DH5α was selected as the Gram-negative bacterial model. The absorbance at 600 nm after incubation was tested by incubating the bacteria with the eight different concentrations of micelles and micelles stabilized AgNPs at 37 °C. Results shown in Fig. 7a illustrated that the bacterial growth curves were highly correlated with the AgNPs concentration in the LB medium. The inhibition of linear/star copolymers micelles on the growth of bacteria was weak, which was not fatal to bacteria. However, as the concentration of linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs increased, the survival rate of E . coli DH5α was significantly inhibited, indicating a strong antibacterial efficacy of AgNPs against E . coli DH5α. The concentrations of linear copolymers micelles stabilized AgNPs preventing the bacterial growth in the experiments were relatively higher than those of star copolymers micelles stabilized AgNPs, which might due to the fact that bigger size of AgNPs could lead to a lower antibacterial performance because of the inefficient exposure of bacteria to AgNPs and relatively slow release behavior of AgNPs.

а Antibacterial activity and b cell viability of linear copolymers and star copolymers micelles stabilized AgNPs at PDMAEMA/AgNO₃ molar ratio =6/1. * p <0.05, two-tailed Student t тест

Cancer is an uncontrollable disease of cell growth that can occur in any part of the body. The most common cancers are liver cancer, breast cancer, colorectal cancer, and lung cancer. Among them, the liver cancer has the much higher prevalence in both developed and developing countries. Therefore, the toxicity experiments of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs on HepG2 cells were carried out, in which HepG2 cells were incubated with linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs at different concentrations (10, 50, 100, 200, 400 mg/L, respectively) for 48 h and the cell viability with MTT assay was the most intuitive data to evaluate the biocompatibility of the composite material. As shown in Fig. 7b, the percentage of viable cells for the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs exhibited negligible cytotoxicity, and was about 90% viability even at the highest concentration applied (400 μg/mL) after 48-h incubation, indicating the advantageous cytocompatibility of the micelles stabilized AgNPs within a relatively wide range of concentration.

Заключение

In conclusion, PDMAEMA-based linear and star copolymer micelles as effective delivery carriers for silver-bearing antimicrobials were developed, and their in vitro antimicrobial efficacy and cell viability were investigated. Being a reducing agent and a stabilizer simultaneously, the micellar PDMAEMA core acted as loading platform for AgNPs in situ translated from the precursor silver nitrate. In silico simulation and experimental results indicated that both types of the copolymer micelles could generate monodisperse and spherical AgNPs. Compared with linear copolymers sliver-bearing micelles, the fabricated star copolymers micelles stabilized AgNPs exhibited smaller average size, better stability against dilution and pyrogenic decomposition, and enhanced antibacterial activities against E . coli DH5α due to the serious damage of bacterial membrane caused by loaded AgNPs. Moreover, both types of copolymer micelles stabilized AgNPs possessed great cytocompatibility toward HepG2 cells. Therefore, these studies may provide some guidance for the construction of more effective AgNPs weapon with well-defined and feasible polymer topology for combating the multiple bacteria-induced infections.

Доступность данных и материалов

The datasets used and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

Сокращения

AgNPs:

Наночастицы серебра

DMAEMA:

2-(dimethylamino) ethyl methacrylate

HEMA:

2-hydroxyethyl methacrylate

PEGMA:

Poly (ethylene glycol) methyl ether methacrylate

CuBr₂ :

Cupric bromide

¹ H NMR:

Proton nuclear magnetic resonance

FTIR:

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

KBr:

Potassium bromide

УФ-видимый:

Видимость в ультрафиолете

MTT:

3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид

HepG2:

Liver hepatocellular carcinoma

DPD:

Dissipative particle dynamics

SPR:

Surface plasmon resonance

XRD:

Рентгеновская дифракция