Быстрый зеленый синтез PDMAEMA-базированных серебро-содержащих кополимерных мицелл с усиленной in vitro антибактериальной эффективностью

Аннотация

Хорошо определенные полимерные мицеллы с ядро-оболочкой архитектурой служат эффективной платформой для стабилизации серебряных наночастиц (AgNP) и доставки антимикробных агентов. Это исследование представляет рациональный, зеленый и масштабируемый синтез AgNP-декорированных кополимерных мицелл на основе поли(2-диметиламино-этил метакрилата) (PDMAEMA) и оценивает их физико-химические и антибактериальные свойства. Две топологии кополимеров — линейная и четырехлучевая звезда — подготовили с идентичными молекулярными весами и степенями полимеризации. Третичные аминовые группы PDMAEMA одновременно координируют Ag⁺ и восстанавливают его in situ, в то время как гидрофильные PHEMA и PEGMA оболочки обеспечивают стерическую стабилизацию в водных средах. Вычислительное моделирование и экспериментальная характеристика (UV-Vis, ТЭМ, DLS, FTIR, XRD) подтвердили, что обе архитектуры производят монодисперсные, сферические AgNP. Звездообразные мицеллы дали более мелкие частицы, превосходную коллоидную стабильность и более высокую антибактериальную потенцию против Escherichia coli DH5α по сравнению с линейными мицеллами. Цитотоксичность анализы с клетками HepG2 показали >90% виabilité при концентрациях до 400 мкг/мл, указывая на хорошую биосовместимость. Эти выводы демонстрируют универсальный одноконтейнерный подход для фабрикации топологически-настроенных, серебро-нагруженных мицелл с потенциалом для широкого спектра антибактериальных приложений.

Введение

Традиционные антимикробные средства все чаще сталкиваются с быстрым возникновением мультирезистентных патогенов, угрозы, ранжируемые среди топ-3 Всемирной организацией здравоохранения [1–5]. Серебряные наночастицы (AgNP) долго ценились за их широкий спектр активности, низкую млекопитающую токсичность и ограниченную склонность индуцировать резистентность [6–10]. Их антимикробный механизм включает разрушение мембран, внутриклеточную денатурацию белков и интерференцию с ДНК репликацией [11–13]. Однако высокая поверхностная энергия AgNP драйвит агрегацию, подрывая их эффективность и стабильность. Инкапсуляция в полимерные матрицы — особенно мицеллы — предлагает практическое решение, предоставляя стерическое препятствие и контролируемый релиз [14–19]. Общие стратегии стабилизации полагаются на внешние восстановители (напр., NaBH₄, аскорбиновая кислота), вводящие токсичные побочные продукты и усложняющие очистку [20–25]. В контрасте, амин-богатые полимеры могут одновременно координировать Ag⁺ и восстанавливать его in situ, обходя внешние восстановители [26]. Однако влияние топологии полимера на нуклеацию, рост AgNP и антибактериальную производительность остается недостаточно изученным, особенно для звездообразных архитектур, которые могут давать усиленную стерическую защиту. Эта работа заполняет этот пробел, разрабатывая линейные и четырехлучевые звездообразные PDMAEMA-базированные триблок-кополимерные мицеллы, оценивая их способность генерировать монодисперсные AgNP in situ, и оценивая антибактериальную активность и цитокомпатибельность.

Материалы и методы

Материалы

Все реагенты использовали как получено, если не указано иное. Ключевые мономеры включали DMAEMA (>98%), HEMA (99%) и PEGMA (Mn = 300 Da, 99%) (Aldrich). Пентаэритрит, EBiB и BIBB очищали алumina колонной хроматографией. Нитрат серебра (AgNO₃, 99,9%) использовали как Ag⁺ источник.

Общая характеристика и инструментарий

¹H NMR спектры записывали на Bruker 400 МГц спектрометре в CDCl₃ или D₂O при 25 °C. FTIR спектры получали на Nicolet Nexus спектрофотометре (4000–400 см⁻¹, 32 скана, 8 см⁻¹ разрешение). Зета-потенциалы измеряли на Malvern Zetasizer Nano S. ТЭМ изображения получали на FEI Tecnai-G20 (200 кВ). UV-Vis спектры записывали на Shimadzu UV-2450. Термогравиметрический анализ (TGA) применяли на NETZSCH STA409PC под азотом (25–600 °C, 10 °C/мин).

Синтез PDMAEMA-b-PHEMA-b-PPEGMA

Полимеризацию проводили через ARGET ATRP в толуоле (70 °C) с CuBr₂/HMTETA как катализатором, Sn(Oct)₂ как восстановителем и EBiB как иницииатором. DMAEMA, HEMA и PEGMA последовательно полимеризовывали для получения триблок-кополимера с Mn ≈ 19 кДа (DMAEMA), 12 кДа (PHEMA) и 25 кДа (PPEGMA). Продукт выпадали в холодном n-гексане, фильтровали и сушили под вакуумом (48 ч, 35 °C).

Синтез (PDMAEMA-b-PHEMA-b-PPEGMA)₄

Четырехлучевой звездообразный иницииатор подготовили этерификацией пентаэритрита с BIBB в THF/TEA, давая тетрабромированное ядро. Последующий ARGET ATRP, следуя тем же условиям, что и линейный кополимер, производил звездообразный триблок-кополимер. Выход и чистота подтверждались ¹H NMR и SEC.

Подготовка AgNP с использованием линейных или звездообразных кополимерных мицелл

Растворы кополимеров (4,8 мМ DMAEMA) перемешивали в ацетоне (5 мл) 4 ч, затем разбавляли водой (20 мл) и перемешивали овернайт для формирования мицелл. AgNO₃ (220 мкл, 48 мМ) добавляли капельно, и смесь перемешивали при 25 °C в темноте 48 ч. Мицеллы, стабилизированные AgNP, изолировали центрифугированием, фриз-драйрингом и хранили при –20 °C.

Антибактериальный анализ

Ингибиция роста против E. coli DH5α оценивали смешиванием 1×10⁵ CFU/мл бактерий с серийными разбавлениями мицелл или мицелл-стабилизированных AgNP. После 16 ч инкубации при 37 °C оптическую плотность при 600 нм (OD₆₀₀) измеряли на микропластинке. Шесть репликатов выполняли для каждой концентрации.

Оценка клеточной виabilité

HepG2 клетки посевали в 96-колодчатые пластинки (1×10⁴ клеток/мл) и культивировали 24 ч. Тестовые растворы (10–400 мкг/мл) добавляли на 24 ч, затем MTT анализ (4 ч инкубации с 5 мг/мл MTT, 200 мкл DMSO). Абсорбанция при 570 нм квантифицировала клеточную виabilité. Эксперименты выполняли в секступлекте.

Диссипативная частицевая динамика симуляция

Коарс-зернистая DPD симуляция (Materials Studio 8.0) моделировала взаимодействия кополимера и AgNP при соотношении PDMAEMA/Ag⁺ 1:1. 30×30×30 rₙ³ бокс с 100 000 шагами (0,05 нс) захватил мицелл самосборку и AgNP инкапсуляцию. Параметры взаимодействия взяли из предыдущей работы [31, 32].

Статистический анализ

Данные анализировали двухвыборочным Стьюдентов t-тестом (неравная дисперсия); p < 0,05 считалось значимым.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика линейных/звездообразных кополимеров

Оба линейные и звездообразные триблок-кополимеры успешно синтезированы ARGET ATRP. ¹H NMR подтвердил ожидаемый блоковый состав: PDMAEMA₁₉.₃–b–PHEMA₁₂.₅–b–PPEGMA₂₄.₆ и (PDMAEMA₅.₀–b–PHEMA₅.₆–b–PPEGMA₅.₀)₄. Звездообразное ядро (пентаэритрит) было полностью бромированным, как свидетельствует исчезновение –CH₂–OH сигнала и появление новых бромированных метиленовых пиков.

Подготовка и характеристика линейных/звездообразных кополимерных мицелл, стабилизированных AgNP

В водных средах триблок-кополимеры самособирались в ядро-оболочку мицеллы. PDMAEMA ядро связывает Ag⁺ через третичную аминовую координацию и восстанавливает его in situ, генерируя Ag атомы, нуклеирующие в наночастицы. Гидрофильная PHEMA/PPEGMA оболочка придает стерическую защиту, предотвращая агрегацию. DPD симуляции показали, что Ag биды быстро локализуются в мицелловых ядрах, подтверждая эффективную инкапсуляцию. UV-Vis спектры демонстрировали поверхностный плазмонный резонанс (SPR) пик при 437 нм для линейных мицелл и 422 нм для звездообразных, указывая на монодисперсные, близкие к сферическим AgNP. ТЭМ изображения раскрыли диаметры частиц 11,1 нм (линейные, 1:1 соотношение) и 3,7 нм (звезда, 1:1), расширяющиеся до 25,7 нм и 6,4 нм соответственно при 6:1 соотношении. Зета-потенциалы варьировали от +15 мВ до +23 мВ, увеличиваясь с Ag содержанием, отражая успешное покрытие поверхности.

Стабильность линейных/звездообразных кополимерных мицелл, стабилизированных AgNP

UV-Vis мониторинг 30 дней показал незначительный сдвиг для звездообразных мицелл даже после 1:3 разбавления, тогда как линейные мицеллы демонстрировали умеренный красный сдвиг, предполагая менее робастную коллоидную стабильность. TGA указал температуры начала деградации 213 °C для звездообразных мицелл и 172 °C для линейных мицелл с AgNP, подчеркивая превосходную термическую устойчивость звездообразной архитектуры.

Антибактериальная активность и клеточная виabilité

OD₆₀₀ измерения раскрыли концентрационно-зависимую ингибицию роста E. coli мицеллами-стабилизированными AgNP. Звездообразные мицеллы достигли >90% ингибиции при 50 мкг/мл, в то время как линейные мицеллы требовали 200 мкг/мл для сравнимого эффекта, атрибутируемое меньшему размеру частиц и более высокой удельной площади. Циттоксичность анализы с клетками HepG2 показали виabilité выше 90% по всем протестированным концентрациям, подтверждая низкую млекопитающую токсичность.

Заключение

Это исследование демонстрирует, что PDMAEMA-базированные линейные и звездообразные триблок-кополимерные мицеллы могут использоваться как двухфункциональные платформы — одновременно восстанавливающие и стабилизирующие серебряные наночастицы — через единственный, зеленый синтетический шаг. Звездообразные мицеллы производят более мелкие, более стабильные AgNP и демонстрируют превосходную антибактериальную активность, сохраняя отличную биосовместимость. Топологически-настроенный подход предлагает универсальную стратегию для проектирования передовых антимикробных наноматериалов.

Доступность данных и материалов

Наборы данных, использованные и/или проанализированные во время текущего исследования, доступны у соответствующего автора по разумному запросу.

Аббревиатуры

AgNP:

Серебряные наночастицы

DMAEMA:

2-(диметиламино)этил метакрилат

HEMA:

2-гидроксиэтил метакрилат

PEGMA:

Поли(этиленгликоль) метил эфир метакрилат

CuBr₂:

Бромид меди (II)

¹H NMR:

Протонное ядерное магнитное резонансирование

FTIR:

Фурье-трансформ инфракрасная спектроскопия

KBr:

Бромид калия

UV-Vis:

Ультрафиолетово-видимая спектроскопия

MTT:

3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиевый бромид

HepG2:

Клеточная линия гепатоцеллюлярного карциномы печени

DPD:

Диссипативная частицевая динамика

SPR:

Поверхностный плазмонный резонанс

XRD:

Рентгеновская дифракция