Улучшенная доставка генов с помощью золотых наночастиц, функционализированных хитосаном, N-ацилированным хитосаном и олигосахаридом хитосана

Аннотация

Золотые наночастицы (AuNP) все чаще используются в биомедицинских исследованиях благодаря их уникальным оптическим свойствам, высокой плотности и простоте поверхностной модификации. Здесь мы представляем невирусную платформу доставки генов, комбинирующую AuNP с тремя хитосанопроизводными полимерами: нативным хитосаном (CO), N-ацилированным хитосаном (Acyl-CO) и олигосахаридом хитосана (COS). Исследовали два синтетических пути: конвенциональное химическое восстановление гидридом натрия и зеленый одноконтейнерный синтез, где COS одновременно восстанавливает и стабилизирует AuNP. Полученные нанокомпозиты полностью характеризовали UV-Vis спектроскопией, ζ-потенциалом, FTIR и трансляционной электронной микроскопией (ТЭМ). Агарозная гель-электрофорез подтвердила надежную комплексацию плазмидной ДНК (пДНК), а эффективность трансфекции в клетках HEK-293 оценивали через β-галактозидазную активность и EGFP флуоресценцию. Транфекционные эффективности 27%, 33% и 60% достигнуты с CO-AuNP, Acyl-CO-AuNP и COS-AuNP соответственно, демонстрируя, что зеленая COS-базированная формуляция предлагает превосходную доставку генов, избегая токсичных восстановительных агентов.

Предыстория

Генная терапия опирается на доставку терапевтического генетического материала в целевые клетки. В то время как вирусные векторы дают высокую трансфекционную эффективность, они страдают от иммуногенности, ограниченной грузоподъемностью и производственной сложности. Невирусные носители, в контрасте, безопаснее, легче в производстве и стабильнее при хранении. Хитосан, природно встречающийся полисахарид, полученный из хитина, стал перспективным невирусным вектором благодаря своему положительному заряду, низкой токсичности и способности защищать ДНК от энзиматического деградации. Однако нативный хитосан слабо растворим при физиологическом pH и высоковязок в разбавленных кислотных растворах, ограничивая биомедицинское применение. Химические модификации, такие как N-ацилирование, увеличивают гидрофобность и настраивают степень деацетилирования, в то время как олигомеризация (COS) снижает вязкость и улучшает клеточное поглощение из-за более коротких длин цепей.

Золотые наночастицы, с их настраиваемым размером, поверхностным плазмонным резонансом и сильным сродством к аминовым, тиоловым и цианидным группам, являются идеальными кандидатами для построения мультифункциональных наноносчиков. Катионные полимеры, как хитосан, могут быть иммобилизованы на AuNP для создания положительно заряженных поверхностей, электростатически связывающих плазмидную ДНК, облегчая клеточную интернализацию. Более того, высокая плотность AuNP способствует быстрому клеточному поглощению, а их оптические свойства позволяют real-time мониторинг доставки.

Предыдущие работы демонстрировали, что хитосан-AuNP конъюгаты могут достигать более высокой трансфекционной эффективности, чем липосомы или полимерные наночастицы. Однако большинство синтезов полагаются на токсичные восстановительные агенты, такие как гидрид натрия или цетилтриметиламмоний бромид (CTAB). В этой работе мы вводим зеленый синтетический путь, использующий COS как одновременно восстанавливающий и стабилизирующий агент, устраняя опасные химикаты, сохраняя при этом благоприятные физико-химические свойства нанокомплексов.

Методы

Синтез нанокомпозитов

Три различных AuNP формулировки подготавливали (Рис. 2). CO-AuNP и Acyl-CO-AuNP синтезировали химическим восстановлением с NaBH₄, в то время как COS-AuNP производили зеленым одноконтейнерным методом, где COS одновременно восстанавливает Au³⁺ и капсулирует наночастицы.

Схематический диаграмма для каждого синтеза: a–b химический синтез для CO-AuNP и Acyl-CO-AuNP; c–f зеленый синтез для COS-AuNP.

Материалы

Хлорид золота (III) тригидрат (HAuCl₄·3H₂O), гидрид натрия (NaBH₄), низкомолекулярный хитосан (50–190 кДа, 75% деацетилирования) и COS (5 кДа) приобрели у Sigma-Aldrich. Вся стеклянная посуда чистили королевской водой 24 ч и промывали Milli-Q водой для удаления металлических следов.

CO-AuNP

CO (2 мг/мл) растворяли в 1% уксусной кислоте и выдерживали овернайт. Раствор фильтровали (0,22 мкм) и смешивали с 10 мМ HAuCl₄ (1 мл) под интенсивным перемешиванием 30 мин. NaBH₄ (100 мМ, 0,4 мл) добавляли капельно; цвет менялся от желтого на винно-красный, указывая на формирование наночастиц. Перемешивание продолжали 2 ч.

Acyl-CO-AuNP

Ацилирование низкомолекулярного хитосана выполняли капройл хлоридом по модифицированному протоколу. Полученный гель выпадали ацетоном, вымывали метанолом и сушили. Гель (0,33% в 0,1 М HCl) смешивали с 10 мМ HAuCl₄ (1 мл) и перемешивали 1 ч. NaBH₄ (100 мМ, 0,4 мл) затем добавляли, производя розово-красный раствор, полностью окрашивающийся в течение 2 ч перемешивания.

COS-AuNP

Для зеленого синтеза COS (100–200 мг) добавляли к HAuCl₄ (0,003–0,017 м.%) и перемешивали при 80 °C 60 мин. Подготовили четыре варианта, отличающиеся количеством COS и золотой концентрацией (Таблица 1). Наночастицы очищали центрифугированием (12 000 g, 30 мин).

Характеризация

FTIR

FTIR спектры (Perkin Elmer Spectrum One) подтвердили наличие амидных полос и успешное ацилирование Acyl-CO. Степень замещения (DS) рассчитали как 75% через отношение абсорбанций при 1651 см⁻¹ и 3350 см⁻¹.

ζ-Потенциал

ζ-потенциал измерения (Malvern Nano Z) раскрыли положительные поверхностные заряды (43–55 мВ) для всех композитов, подтверждая их пригодность для ДНК связывания. После комплексации значения падали, указывая на успешную адсорбцию плазмиды.

UV-Vis

UV-Vis спектры (400–700 нм) показывали локализованные поверхностные плазмонные резонансы (LSPR) при 534 нм (CO-AuNP), 507 нм (Acyl-CO-AuNP) и 533–536 нм (COS-AuNP). Спектры оставались неизменными после 150 дней, свидетельствуя о коллоидной стабильности.

ТЭМ

ТЭМ изображения (JEOL JEM-1010) раскрывали сферические наночастицы с диаметрами 3–15 нм. Распределения размеров были уже для COS-AuNP, отражая превосходную монодисперсность.

Формирование комплексов и связывание ДНК

Плазмиды pSV-β-Gal (6,82 кб) и pIRES2-EGFP (5,3 кб) очищали щелочным лизисом. ДНК (200–400 нг) смешивали с каждым нанокомпозитом в DMEM, и агарозная гель-электрофорез (0,8% агароза, 90 В, 60 мин) демонстрировал полное удержание ДНК в колодках, подтверждая электростатическую комплексацию.

Клеточная трансфекция

Клеточная культура

HEK-293 клетки посевали 12 000 клеток на колоду в 96-колодчатых пластинках, достигая ~90% конфлюэнтности через 24 ч.

EGFP Трансфекция

Комплексы (15 мкл, 200 нг ДНК) добавляли к клеткам на 2 ч, затем 48 ч инкубации в полном DMEM. GFP экспрессию квантифицировали флуоресцентной микроскопией (Carl Zeiss Axio Vert.A1).

β-Галактозидазная трансфекция

После 24 ч инкубации клетки фиксировали и инкубировали с X-gal раствором. Синее окрашивание, указывающее на β-галактозидазную активность, наблюдали светло-польной микроскопией (Motic AE2000). LipofectAMINE™ 2000 служил позитивным контролем.

Клеточная виabilité

Исключение трипан-синим (0,2%) оценивали виabilité 2 ч пост-трансфекции. Концентрационные диапазоны: 0,1–3 мМ для CO-AuNP и Acyl-CO-AuNP, 0,5 мМ для COS@3-AuNP и COS@4-AuNP, и 0,1 мМ для COS@1-AuNP и COS@2-AuNP.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика нанокомпозитов

Зеленые COS-AuNP произведены без опасных реагентов, демонстрируя выполнимость полностью биосовместимого синтетического пути. UV-Vis спектры (Рис. 3) подтвердили формирование AuNP, с LSPR пиками, консистентными по всем формулировкам. Стабильность тесты после 150 дней не показывали спектрального сдвига, указывая на отличную коллоидную робастность.

UV-Vis спектры нанокомпозитов. LSPR максимумы: CO-AuNP 534 нм, Acyl-CO-AuNP 507 нм, COS-AuNP 533–536 нм.

Стабильность

UV-Vis спектры после 150 дней: CO-AuNP (a), Acyl-CO-AuNP (b), COS-AuNP (c).

FTIR

FT-IR спектры хитосана, Acyl-хетосана и COS. Ключевые полосы: 1651 см⁻¹ (амид I), 1591 см⁻¹ (амид II).

ζ-Потенциал

Таблица 2 перечисляет ζ-потенциал значения: CO-AuNP 43,3 мВ, Acyl-CO-AuNP 40,2 мВ, COS-AuNP 46,3–55,3 мВ. Все значения оставались положительными после ДНК связывания, подтверждая комплексацию.

ТЭМ

ТЭМ микрографы: (a) Acyl-CO-AuNP 4,7 нм, (b) CO-AuNP 3,5 нм, (c–f) COS-AuNP 7,4–15,6 нм.

ДНК комплексация

Агарозные гели (Рис. 7) показывали полное удержание ДНК во всех нанокомплексах, тогда как свободная плазмида мигрировала на дно. COS-AuNP демонстрировали сильнейшее связывание, удерживая до 350 нг плазмиды до насыщения.

Агарозная гель-электрофорез пДНК комплексов.

Трансфекционная эффективность

В клетках HEK-293 COS-AuNP достигли наивысших трансфекционных скоростей: 60% с β-галактозидазой и 48% с EGFP. Acyl-CO-AuNP и CO-AuNP достигли 33% и 27% соответственно. Превосходная производительность COS-AuNP атрибуируется их более высокому хитосан/золото соотношению и оптимальному размеру частиц.

Трансфекционные анализы в клетках HEK-293.

EGFP флуоресцентная визуализация.

Проценты трансфекционной эффективности.

Клеточная виabilité

Исключение трипан-синим раскрыло высокую виabilité (>90%) для COS-AuNP, тогда как LipofectAMINE™ 2000 и CO-AuNP показывали более низкие выживаемости (61% и 78%). COS-AuNP таким образом комбинируют высокую трансфекционную эффективность с минимальной цитотоксичностью.

Проценты клеточной виabilité.

Заключение

Мы успешно изготовили золотонаночастично-хетосановые конъюгаты через конвенциональные и зеленые пути. COS-AuNP, синтезированные без токсичных реагентов, продемонстрировали превосходную трансфекционную эффективность (до 60%) и отличную цитокомпатибельность (>93%). Их узкое распределение размеров и положительный поверхностный заряд обеспечивают надежное плазмидное связывание и эффективное клеточное поглощение. Эти выводы позиционируют COS-AuNP как перспективную, экологически дружественную платформу доставки генов, подходящую для дальнейшей доклинической разработки.

Доступность данных и материалов

Все наборы данных, поддерживающие выводы этого исследования, включены в основной текст.

Аббревиатуры

Acyl-CO:

Ацилированный хитосан

AuNP:

Золотые наночастицы

CO:

Хитосан

COS:

Олигосахарид хитосана

DMEM:

Модифицированное среднее Эйгла Дюльбекко

FTIR:

Фурье-трансформ инфракрасный

PBS:

Фосфатно-буферный салайн

pDNA:

Плазмидная дезоксирибонуклеиновая кислота

TEM:

Трансляционная электронная микроскопия