Биотинированные редох-чувствительные хитозановые наночастицы, обложенные фикоцианином, для адресной доставки куркумина

Аннотация

В данной работе разработаны наночастицы на основе биотина, функционализированные фикоцианином (PC) и загруженные куркумином (CUR), на основе олигогитозана-дитиодипропионовой кислоты-куркумина (BCSC), названные CUR-BCSC@PCs. Они предназначены для повышения биосовместимости куркумина. Структура BCSC подтверждена методом ¹H-NMR. Наночастицы CUR-BCSC@PCs со средним гидродинамическим диаметром 160,3 ± 9,0 нм благодаря биомиметическому белковому короне обладают отличной стабильностью и способностью избегать адсорбции белков в кровотоке. Ин витро эксперименты по высвобождению подтвердили, что CUR-BCSC@PCs с редох-чувствительной оболочкой чувствительны к высоким концентрациям глутатиона. Кроме того, CUR-BCSC@PCs эффективно повышают ингибиторную активность на пролиферацию клеток A549 за счет усиления внутриклеточного захвата CUR. Эти результаты указывают на большие перспективы применения CUR-BCSC@PCs в ракетерапии как эффективных носителей лекарств.

Введение

Олигогитозан (COS) со структурой β-(1-4)-связанных D-глюкозаминов является продуктом деполимеризации, получаемым в основном путем деацетилизации и ферментативного гидролиза хитозана или хитина, которые производятся из внешних скелетов членистоногих или клеточных стенок грибов. Стоит отметить, что тяжелые металлы и красители могут быть удалены хитозаном и его модифицированными формами, где хитозан выступает адсорбентом. Ряд исследований показал, что COS обладает рядом биологических свойств: антиканцерогенным, противовоспалительным, антиоксидантным и иммуностимулирующим. COS считается нетоксичным материалом-носителем лекарств благодаря своей биосовместимости, высокой водорастворимости и химической модифицируемости.

Для улучшения растворимости гидрофобных противоопухолевых препаратов и снижения токсичности для нормальных тканей медицинские исследователи изучают кополимеры, способные самоорганизовывать в мицеллы определенного размера. Эти кополимерные сборки могут пассивно или активно достигать и проникать в опухоль. Мицеллы состоят из двух функциональных частей: гидрофобного ядра, инкапсулирующего препарат, и внешней оболочки (короны), контролирующей фармакокинетические свойства in vivo. Ван и соавт. присоединили дезоксихолевую кислоту к цепям COS через химическую модификацию, образуя амфифильные блочные кополимеры, самоорганизующиеся в мицеллы в недорогих неорганических растворителях. Гидрофобное ядро мицелл содержало кверцетин, что значительно улучшило водорастворимость противоопухолевых препаратов и, следовательно, биодоступность кверцетина.

Куркумин (CUR) — один из основных химических компонентов куркумы. В последние годы многие исследователи изучают противоопухолевые свойства CUR, и множество работ подтвердили, что это вещество влияет на рост опухолевых клеток через различные сигнальные пути и усиливает иммунную систему. Кроме того, CUR является фотосенсибилизатором с хорошими фотодинамическими свойствами. Таким образом, CUR — перспективный препарат для ракетерапии. Однако его плохая растворимость, стабильность и биодоступность ограничивают клиническое применение. Для преодоления этих недостатков многие исследователи улучшали биодоступность CUR через системы доставки лекарств. Например, Чен и соавт. разработали новый тип двойного pH-чувствительного носителя, который повысил водорастворимость CUR и улучшил его эффект на лечение опухолей.

Фикоцианин (PC), получаемый в основном из синебактерий, известен как водорастворимый пигментно-белковый комплекс, захватывающий свет и переносящий его в химическую энергию при фотосинтезе. PC обладает множеством биологических свойств: антиканцерогенными, противовоспалительными и антиоксидантными, что привлекло внимание в пищевой и медицинской промышленности. Хао и соавт. обнаружили, что PC ингибирует рост клеток неклеточного рака легких путем регуляции вниз адаптера, содержащего домен белка Toll/интерлейкин-1 рецептора (TIRAP). Кроме того, PC используется в фотодинамической терапии (ФДТ) опухолей как отличный агент без побочных эффектов. Использование PC в качестве флуоресцентных зондов требует конъюгации с специфическими идентифицирующими элементами, такими как биотин, антитела и стрептавидин. Биотин, водорастворимый витамин, является важным микронутриентом в организме человека и обладает свойствами опухолевой мишени. Белки-рецепторы к биотину, такие как авидин, невравидин и стрептавидин, гиперекспрессированы на поверхности ряда раковых клеток по сравнению с нормальными. Таким образом, биотинилированные наночастицы широко изучаются как система доставки лекарств через рецептор-медиативную эндоцитоз.

В настоящем исследовании построен новый тип наноносителя, функционализированного PC, и препарирование CUR-BCSC@PCs представлено на рис. 1. Дисульфидная связь между COS и CUR обеспечивает редукционную чувствительность амфифильного носителя. CUR располагается в гидрофобном внутреннем ядре, защищенном оболочкой COS/PC. Взаимодействие между биотином и PC и электростатическое взаимодействие между положительно заряженным COS и отрицательно заряженным PC использовались для модификации PC на поверхности CUR-BCSCs. Ожидается, что CUR-BCSC@PCs достигнут опухолевых тканей благодаря улучшенной проницаемости, эффекту усиленной проницаемости и удержания (EPR) и таргетингу рецепторов к биотину. В микросреде опухоли, где концентрация глутатиона выше, чем в нормальных клетках, CUR-BCSC@PCs распадаются через реакции тиол-дисульфидного обмена, достигая высокой концентрации препарата в опухолевых клетках. Описанная нано-доставочная система не только улучшает биодоступность CUR, но и имеет потенциал для эффективной клинической терапии опухолей.

Материалы и методы

Материалы

CUR приобретен у Zhanyun Chemical Co., Ltd. (Шанхай, Китай). COS закуплен у Shandong Weikang Biomedical Science and Technology Co., Ltd. PC получен от Zhejiang Binmei Biotechnology Co., Ltd. 3,3'-Дитиодипропионовая кислота получена от Adamas Reagent Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Углекислый карбодиимид гидрохлорид (EDCI), диметиламино пиридин (DMAP), тетрагидрофуран (THF), оксалил хлорид и биотин приобретены у Aladdin Chemistry Co., Ltd. L-глутатион (GSH) и Hoechst 33342 куплены у Sigma-Aldrich (Шанхай, Китай). Диализационные мешки (MWCO 300 Da) получены от Beijing Biotopped Technology Co., Ltd. Формамид подготовлен Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. Деионизированная вода подготовлена в лаборатории.

Клеточная линия A549 (человечные клетки карциномы легких) (Bena Culture Collection (Пекин, Китай)) использовалась для оценки цитотоксичности нового наноносителя. Клетки A549 культивировали в DMEM (Saiersi Biotechnology Co., Ltd. (Шаньдун, Яньтай, Китай)). Фетальная телячья сыворотка (FBS) получена от Hyclone (Логан, штат Юта, США). Пенициллин и стрептомицин приобретены у Sigma-Aldrich (Шанхай, Китай). 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2H-тетразолиевый бромид (MTT) также закуплен у Sigma-Aldrich (Шанхай, Китай).

Синтез CUR-BCSC@PCs

Синтетические маршруты для приготовления CUR-BCSC@PCs показаны на рис. 2. Подробные экспериментальные процедуры описаны ниже.

Синтез COS-S-S-CUR

3,3'-Дитиодипропионовая кислота-функционализированный COS синтезирован путем этерификации, катализируемой хлоридом кислоты, в двухступенчатой реакции.

Этап 1: 3,3'-Дитиодипропионовая кислота (42,05 мг, 0,25 ммоль) и сухой THF (4 мл) загружены в бурую круглодонную колбу с магнитным мешалкой для растворения кислоты. Затем оксалил хлорид (0,3 ммоль), разбавленный THF, добавлен в колбу, помещенную в ледяную баню. Реакция велась при 35 °C. После 3 часов мешивания нереагировавший оксалил хлорид удален ротационной эвапорацией. Продукт 1 получен вышеописанными этапами. CUR растворен в 3 мл THF, содержащем 34 мкл триэтиламина, капально добавлен в колбу с продуктом 1 в условиях ледяной бани и помешан 15 мин. Затем смесь мешала при 50 °C в атмосфере азота 6 часов. Полученный продукт подвергли ротационной дистилляции для удаления триэтиламина и THF, а затем очистили колонной хроматографией для получения чистого продукта HOOC-S-S-CUR.

Этап 2: Чистый продукт HOOC-S-S-CUR активирован EDCI (1,2 экв.) и DMAP (1,2 экв.) в формамиде 2 часа. Затем COS, растворенный в 4 мл формамида, добавлен и помешан при 55 °C 12 часов. После завершения реакции раствор диализировали в диализационном мешке (MWCO 300 Da) и сублимировали 12 часов.

Синтез BCSC и Биотин-COS

Кратко, биотин, EDCI и DMAP растворили в 3 мл формамида и перенесли в бурую круглодонную колбу. После помешивания 2 часа при 30 °C COS-S-S-CUR, растворенный в 3 мл формамида, капально добавили в колбу. Реакция велась при 45 °C 2 дня. Конечные продукты диализировали (MWCO 300 Da) в деионизированной воде, подвергли центрифугированию и лиофилизации для получения редох-чувствительного BCSC. Кроме того, синтез биотин-COS проводили тем же способом для связывания биотина с цепями COS.

¹H-NMR COS-S-S-CUR, BCSC и биотин-COS измеряли с использованием смеси DMSO-D₆ и D₂O в качестве растворителя.

Приготовление CUR-загруженных мицелл BCSC (CUR-BCSCs)

CUR-BCSCs приготовили методом самоорганизации. 10 мг BCSC растворили в 4 мл формамида, затем смешали с 1 мл раствора CUR (1 мг/мл) в формамиде. Смесь диализировали в диализационном мешке (MWCO 300 Da) в деионизированной воде 24 часа, меняя воду каждые 2 часа. CUR-BCSCs фильтровали через мембраны Millipore диаметром пор 800, 450 и 220 нм.

Приготовление CUR-BCSC@PCs

Приготовленные CUR-BCSCs смешали с водным раствором PC (1,0 мг/мл) и инкубировали 30 мин при 4 °C. Затем PC удалили с помощью центрифугирующего фильтра 100 кДа и промыли водой три раза. Конечный продукт (CUR-BCSC@PC) хранили при 4 °C в темноте для дальнейшего изучения.

Характеризация

Динамическое лазерное рассеяние (DLS) измеряли на анализаторе частиц Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.) для наблюдения размера частиц, дзета-потенциала и индекса полидисперсности (PI). Морфология CUR-BCSCs и CUR-BCSC@PCs подтверждена передаточной электронной микроскопией (TEM, H-600; Hitachi, Токио, Япония).

Эффективность инкапсуляции (EE) и грузоподъемность (DL)

HPLC (Agilent 1260GB12C) использовали для определения EE и DL наночастиц. Сначала 2 мл CUR-BCSCs или CUR-BCSC@PCs смешали с 3 мл ацетонитрила и деэмульгировали ультразвуком, затем ацетонитрил довели до 10 мл. Перед измерением температуру колонки Phenomenex C18 (250 мм × 4,6 мм, 5 мкм) установили 25 °C, скорость потока подвижной фазы — 1,0 мл·мин⁻¹. Соотношение 0,5% ледяной уксусной кислоты к ацетонитрилу 40:60 (v/v). При длине волны детектирования 425 нм инъецировали 20 мкл образца. Для расчета EE и DL использовали формулы:

EE% = (Масса CUR в наночастицах / Масса загруженного CUR) × 100%

DL% = (Масса CUR в наночастицах / Масса наночастиц) × 100%

Ин витро тест стабильности

Фосфатно-буферный раствор (PBS), содержащий GSH (0, 20 мкМ, 10 мМ), приготовили и обработали CUR-BCSC@PCs 4 часа для наблюдения изменений размера частиц при разных концентрациях глутатиона при 37 °C. Кроме того, гидродинамический диаметр CUR-BCSC@PCs исследовали в растворе PBS на анализаторе частиц Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.) при 37 °C в разные временные точки (4, 8, 12 и 24 часа).

Ин витро высвобождение CUR из CUR-BCSC@PCs

Ин витро поведение высвобождения CUR из CUR-BCSC@PCs изучали методом диализа. Подготовили растворы PBS с глутатионом (GSH: 20 мкмоль/л, 1 ммоль/л, 5 ммоль/л, 10 ммоль/л) и добавили 0,5% Tween 80. 45 мл буфера PBS с разной концентрацией GSH поместили в центрифужные трубки 50 мл, затем в каждую трубку поместили диализационный мешок с 1 мл CUR-BCSC@PCs, которые встряхивали при 37 °C. В разные временные точки (0,2; 1; 4; 8; 12; 24; 48; 72 ч) собирали 2 мл среды высвобождения и доливали свежую среду того же типа для сохранения объема. HPLC использовали для определения концентрации CUR в собранной среде.

Клеточная культура

Клетки человечной карциномы легких A549 культивировали в DMEM с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин, инкубировали при 37 °C в атмосфере 5% CO₂.

Ин витро ингибиция клеточной пролиферации

Ин витро цитотоксичность CUR, мицелл BCSC (BCSCs), CUR-BCSCs и CUR-BCSC@PCs на клеточной линии A549 оценивали стандартным MTT-тестом. Клетки A549 посеяли в 96-колбовые пластинки (5000 клеток на колбо) на 24 часа для адгезии. Исходную среду удалили, затем добавили 100 мкл свежей среды, содержащей свободный CUR, BCSCs, CUR-BCSCs и CUR-BCSC@PCs (0,1; 1; 5; 10; 15 и 20 мкг/мл по CUR) и культивировали 24 часа. Колбы без администрирования использовали как пустые контролы. Клетки подвергли MTT-тесту: удалили среду, добавили 20 мкл раствора MTT (5 мг/мл). После инкубации еще 4 часа при 37 °C в 5% CO₂ раствор MTT заменили 150 мкл DMSO для растворения пурпурного формазана MTT. Затем измерили абсорбцию каждой колбы на 570 нм с помощью фототметра микропластинок (Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA).

Ин витро клеточный захват и локализация

Способность к клеточному захвату CUR-BCSCs и CUR-BCSC@PCs исследовали под флуоресцентным микроскопом (FM, Eclipse E400; Nikon Corporation, Токио, Япония). Клетки A549 посеяли в 24-колбовые пластинки по 4 × 10⁴ клеток на колбо и ко-инкубировали с CUR-BCSCs и CUR-BCSC@PCs (концентрация CUR: 20 мкг/мл) при 37 °C во влажной атмосфере с 5% CO₂ 1, 2 и 4 часа. Клетки A549 промыли PBS три раза после удаления среды с препаратами. Затем добавили PBS с 4% параформальдегидом на 20 мин и промыли PBS еще три раза. Ядра клеток окрасили Hoechst 33342 на 15 мин и наблюдали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа.

Статистический анализ

Все эксперименты проводили минимум три раза и выражали как среднее ± SD. Статистические тесты анализировали с помощью Student's t-теста. P < 0,05 считали статистически значимым, а P < 0,01 — высоко значимым.

Результаты и обсуждение

Характеризация COS, COS-S-S-CUR, Биотин-COS и BCSC

Основные характерные резонансы CUR и CH₂-S-S-CH₂ появились на спектре ¹H-NMR COS-S-S-CUR, подтверждая успешное конъюгирование CUR с цепями COS. По сравнению с пиками COS на рис. 3(A), характерные сигналы CUR, представленные на рис. 3(B), наблюдались в области 6,7–7,5 ppm и при 3,75 ppm (−OCH₃), в то время как резонанс CH₂-S-S-CH₂ при 2,5 ppm остался неизменным. Как показано на рис. 3(C), a, b, пики биотина на спектре ¹H-NMR Биотин-COS составляли 0,99 ppm (−CH₂–) и 3,39 ppm (−CH–S–). Спектр ¹H-NMR BCSC показан на рис. 3(D). Резонансы CUR (рис. 3(D), a, e) видны в соответствующих позициях, а характерный пик CH₂-S-S-CH₂ (рис. 3(D), b) снова наблюдается при 2,5 ppm. Кроме того, появление сигналов при пиках 0,09 ppm и 3,39 ppm (рис. 3(D), c, d) подтвердило существование биотина, связанного с цепями COS-S-S-CUR. Характерные резонансы CUR, CH₂-S-S-CH₂ и биотина, показанные на рис. 3(D), согласуются с теми на рис. 3(B) и 3(C), что указывает на успешный синтез амфифильного материала BCSC.

Характеризация CUR-BCSCs и CUR-BCSC@PCs

Морфологию CUR-BCSCs и CUR-BCSC@PCs изучали передаточной электронной микроскопией (TEM) (рис. 4(A, B)). CUR-BCSCs показывали гладкую сферическую форму (рис. 4(A), a) под электронным микроскопом, в то время как CUR-BCSC@PCs имели примерно сферическую форму с расцветающим слоем, окружающим CUR-BCSC@PCs (рис. 4(B), b). Это указывало на то, что PC сформировал структуру белковой короны, покрывая поверхности CUR-BCSCs. Четкий эффект Тиндалалла CUR-BCSC@PCs наблюдался из-за наличия множества наночастиц (рис. 4(C)). Размер частиц, PI, дзета-потенциал, DL (%), EE (%) CUR-BCSCs и CUR-BCSC@PCs приведены в таблице 1. На рис. 5 средний размер CUR-BCSCs и CUR-BCSC@PCs составлял 97,8 ± 4,2 нм и 160,3 ± 9,0 нм соответственно. Значения PI CUR-BCSCs и CUR-BCSC@PCs были 0,181 ± 0,014 и 0,114 ± 0,024 соответственно, что меньше 0,2, указывая на равномерность их размеров. Дзета-потенциалы CUR-BCSCs и CUR-BCSC@PCs составляли 21,57 ± 0,53 и 12,90 ± 1,93 мВ соответственно. Из-за электроотрицательного покрытия PC дзета-потенциал CUR-BCSCs был выше, чем у CUR-BCSC@PCs. EE CUR-BCSC@PCs был выше, чем у CUR-BCSCs.

Стабильность CUR-BCSC@PCs

Как показано на рис. 6a, из-за редукционной природы дисульфидной связи, она расщеплялась в PBS с 10 мМ GSH, и CUR-BCSC@PCs распадались на полимерные фрагменты, которые аггломерировали, увеличивая размер наночастиц. Однако в PBS с 20 мкМ GSH изменения размера частиц были незначительными, показывая похожий результат, как PBS без GSH. Как проиллюстрировано на рис. 6b, размер частиц измеряли в разное время для изучения стабильности CUR-BCSC@PCs в PBS, и результаты показали, что размер частиц CUR-BCSC@PCs медленно увеличивался со временем.

Редукционный ответ CUR-BCSC@PCs

Хорошо известно, что дисульфидные связи нестабильны в редукционной микросреде опухоли. Исследователи использовали дисульфидные связи для соединения гидрофильных полимеров и гидрофобных препаратов для получения амфифильных фрагментов, которые могут самоорганизовываться в воду, образуя нано-мицеллы. Затем, согласно различиям в физиологической среде и среде опухоли, дисульфидные связи разрываются в месте опухоли для высвобождения препарата. В настоящем исследовании ин витро высвобождение препарата проводили для проверки того, могут ли CUR-BCSC@PCs продемонстрировать ожидаемые свойства высвобождения. Редукционная чувствительность CUR-BCSC@PCs, содержащих дисульфидные связи, изучали после активации GSH. Как показано на рис. 7, высвобождение CUR из CUR-BCSC@PCs в среде с 20 мкМ GSH при pH 7,4, моделирующей внеклеточную среду, было крайне медленным по сравнению со средой с 10 мМ GSH при pH 7,4. Кроме того, по сравнению со средой 20 мкМ GSH, среды 1, 5 и 10 мМ GSH показали значительные различия в поведении высвобождения. С увеличением концентрации GSH высвобождение CUR из CUR-BCSC@PCs также усиливалось, что указывает на то, что высвобождение препарата отвечает на концентрацию GSH.

Ин витро цитотоксичность

MTT-тест проводили для изучения цитотоксических эффектов свободного CUR, BCSCs, CUR-BCSCs и CUR-BCSC@PCs на клеточных линиях A549. Данные жизнеспособности клеток суммированы на рис. 8. Все препараты CUR показывали дозозависимость в терминах ингибиции клеточной пролиферации. Как показано на рис. 8, свободный CUR имел слегко меньшую способность к ингибиции клеточной пролиферации против всех клеток A549 по сравнению с CUR-BCSC@PCs и CUR-BCSCs после инкубации 24 часа. Для клеток A549 антиканцерогенная активность CUR-BCSC@PCs была лучше, чем у BCSCs и CUR-BCSCs, что, вероятно, обусловлено отличным клеточным захватом. Кроме того, CUR-BCSC@PCs показали более высокую цитотоксичность, чем CUR-BCSCs, указывая на то, что PC имеет потенциальный ингибиторный эффект на пролиферацию клеток A549.

Ин витро изучение клеточного захвата

Как показано на рис. 8, флуоресцентные сигналы CUR наблюдались в клетках A549, обработанных CUR-BCSCs и CUR-BCSC@PCs (CUR: 20 мкг/мл) в 1, 2 и 4 часа, с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа. CUR как зеленый флуоресцентный зонд также был противоопухолевым препаратом, который часто использовали как гидрофобную модель препарата для разработки новых и эффективных систем доставки. Как проиллюстрировано на рис. 9a, и CUR-BCSCs, и CUR-BCSC@PCs поглощались линией клеток A549, и эффективность захвата была время-зависимой. Благодаря гиперекспрессированным рецепторам к биотину на поверхности раковых клеток, биотин-загруженные нано-мицеллы имели аффинность к клеткам A549. Флуоресцентные сигналы от CUR-BCSC@PCs были высокими в 4 часа, указывая на высокую скорость клеточного захвата CUR-BCSC@PCs. Флуоресцентные сигналы CUR-BCSC@PCs были выше в 4 часа, чем в 1 или 2 часа; это доказало, что клеточный захват был время-зависимым.

Ядра клеток A549 окрасили Hoechst 33342. Как показано на рис. 9b, зеленые флуоресцентные сигналы виделись в цитоплазме группы CUR-BCSC@PCs 1 час, и флуоресценция постепенно появлялась в ядрах группы CUR-BCSC@PCs 4 часа, что демонстрировало клеточный захват через катавеол-медиативную эндоцитозу.

Заключение

В данном исследовании тип белково-функционализированных наночастиц COS приготовили через конденсационные реакции, поведение самоорганизации и взаимодействие между PC и CUR-BCSCs. После предварительного исследования амфифильные материалы-носители (BCSCs) с редох-чувствительностью успешно синтезировали и верифицировали с помощью ¹H-NMR. Поверхности CUR-BCSCs модифицировали слоем короны фикоцианина, который мог улучшить эффективность клеточного захвата и защитить CUR-BCSC@PCs от адсорбции плазменных белков. Анализ цитотоксичности и клеточного захвата указал, что CUR-BCSC@PCs могут транспортировать CUR в клетки A549 и обладают отличным антипролиферативным свойством. Учитывая эффект ФДТ PC и CUR, мы оценим фотодинамические свойства и противоопухолевую активность CUR-BCSC@PCs под фоттерапией на следующем этапе исследования. Это исследование прокладывает путь к улучшению эффективности противоопухолевых препаратов и введению функциональной белковой короны. В целом, наномедицинский биоматериал-носитель CUR-BCSC@PCs на основе COS с множественными функциями предоставил новую стратегию для лечения опухолей и проявил большие перспективы применения.