Таргетированная химиотерапия: Аптамер-функционализированные мезопористые кремнеземные наночастицы доставляют доксорубицин непосредственно к лейкемическим клеткам

Аннотация

Как эффективно и селективно доставлять химиотерапевтические препараты к опухолевым клеткам для улучшения терапевтической эффективности остается сложной проблемой. Мы здесь конструируем эффективную клеточно-таргетированную систему доставки препаратов (Sgc8-MSN/Dox) на основе аптамер-модифицированных мезопористых кремнеземных наночастиц, которая опирается на опухоль-таргетирующую способность аптамера Sgc8 для доставки доксорубицина (Dox) к лейкемическим клеткам таргетированным образом, тем самым улучшая терапевтическую эффективность и снижая токсичность. В этой работе Sgc8-MSN/Dox показали устойчивое высвобождение Dox, и они таргетировали и эффективно убивали CCRF-CEM человеческие острые Т-лимфоцитарные лейкемические клетки, предполагая потенциал как раковая терапия.

Введение

Острая лимфобластная лейкемия (ALL) — гетерогенная злокачественная опухоль, серьезно угрожающая здоровью человека. Около 6000 случаев острой лимфобластной лейкемии диагностируются ежегодно в США, особенно у детей и подростков. ALL — самый распространенный рак среди детей и самая частая причина раковой смерти до 20 лет.

Химиорадиотерапия и трансплантация костного мозга гематопоэтических стволовых клеток — стандартные лечения ALL. Радиотерапия связана с существенными системными побочными эффектами и оптимальные места облучения неясны. Трансплантация костного мозга часто неосуществима из-за стоимости, возраста пациента и нехватки донорского мозга. Химиотерапия может быть эффективна в устранении дальних очагов и предотвращении рецидива, но только доля большинства противоопухолевых препаратов достигает опухолей через кровоток. Это приводит к низкой биодоступности препарата и плохой селективности к больным клеткам над нормальными, увеличивая риск серьезных неблагоприятных реакций и лекарственной резистентности.

Нано-системы доставки препаратов могут обеспечивать гораздо более эффективную и таргетированную доставку противоопухолевых препаратов, чем препараты сами по себе, включая высвобождение препарата, запускаемое специфическими условиями микросреды опухоли. Среди таких систем мезопористые кремнеземные наночастицы (MSN) привлекли внимание благодаря их большой, модифицируемой поверхности; их регулируемому пористообъему, способному нести разные количества и типы препаратов; и их хорошей биосовместимости. Поверхностные модификации с функциональными отзывчивыми группами позволяют создавать MSN, высвобождающие свой препарат под специфическими условиями, в то время как модификации с таргетирующими молекулами ведут MSN к селективной доставке препарата к желаемой ткани.

Один тип таргетирующих молекул, совместимых с MSN, — аптамеры, которые являются однцепными ДНК или РНК, действующими как «химические антитела» для специфичного и тесного связывания с мишенями. Аптамеры меньше и легче готовить и модифицировать, чем моноclonalные антитела, они лучше проникают в ткань и показывают более низкую токсичность и иммуногенность. Поэтому аптамеры широко используются для опухолевого детектирования и таргетированной химиотерапии. SELEX метод использовался для идентификации аптамера Sgc8, который специфично связывается с CEM человеческими острыми Т-лимфоцитарными лейкемическими клетками. Sgc8 распознает белок тирозин-киназу-7 (PTK-7) на мембране CEM клетки. Добавление Sgc8 к химиотерапевтическим препаратам и определенным наноматериалам может улучшить таргетирование и убийство лейкемических клеток.

Мы спроектировали Sgc8 аптамер-модифицированную флуоресцентную кремнеземную наночастицу систему (Sgc8-FSNPs) для детектирования лейкемических клеток с высокой чувствительностью и специфичностью, что оказалось полезным не только для диагностики лейкемии, но и для таргетированной доставки противо-лейкемических препаратов. Основываясь на этой работе, в настоящем исследовании мы инкапсулировали доксорубицин (Dox) в MSN, которые мы декорировали Sgc8 (Рис. 1). Полученные Sgc8-MSN/Dox показали хорошую морфологию и размер для доставки препаратов, и наночастицы селективно вбирались лейкемическими клетками в культуре, приводя к эффективному убийству опухолевых клеток. Цель этого исследования — попытаться раскрыть, что аптамер-модифицированные мезопористые кремнеземные наночастицы могут не только таргетировать диагностику опухолей, но и убивать опухоли загрузкой препаратов, чтобы дать идеи для опухоль-таргетированных тераностик.

Экспериментальные материалы и методы

Реактивы и материалы

Доксорубицин гидрохлорид (Dox) приобретен у Beijing Huafeng United Technology (Beijing, China). Аналитического класса тетраэтилортсиликат (TEOS) и 3-Триэтоксисилпропиламин (APTES) куплены у Shanghai Chemical Reagent Factory I (Shanghai, China), и цетил-триметиламмоний бромид (CTAB, 99% чистота) от Shanghai Jizhi Biochemical Technology (Shanghai, China). Все остальные реактивы аналитического класса. Карбоксил-модифицированный Sgc8 аптамер (5′-ATCTAACTGCCGCCGCGGGAAAATGTACGGTTAG(T)₁₀-COOH-3′) синтезирован Shanghai Bioengineering (Shanghai, China).

Клеточные линии

Следующие клеточные линии приобретены у Клеточного банка Китайской академии наук (Shanghai, China): линия человеческих острых Т-лимфоцитарных лейкемических клеток CCRF-CEM, линия человеческих Б-лимфом РАМОС, линия человеческих нормальных печеночных клеток L02 и линия человеческих эмбриональных почечных клеток 293T. Все клеточные линии культивировали при 37 °C под 5% CO₂ в DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS, Hyclone) и пенициллин-стрептомицин (Gibco, Grand Island, NY, USA).

Подготовка Sgc8-MSN/Dox

MSN подготовили как описано, растворяя 0,50 г CTAB в 240 мл ультрачистой воды, добавляя 1,75 мл 2 M NaOH раствора и нагревая при 80 °C в масляной бане. Под интенсивным мешанием 2,50 мл TEOS медленно добавляли капельно, и смесь непрерывно мешали 2 ч до получения белого осадка. Затем смесь центрифугировали при 10 000 об/мин 10 мин, надстройку удаляли, осадок вымывали три раза попеременно ультрачистой водой и безводным этанолом, затем осадок сушили в вакуумной печи при 60 °C овернайт для получения MSN.

Sgc8-MSN/Dox получали смешиванием 0,2365 г MSN в трехгорлычном колбе с 23,65 мл абсолютного этанола, добавлением 710 мкл APTES капельно и рефлюксом 24 ч. Смесь вымывали три раза попеременно метанол-HCl раствором (4:1) и деионизированной водой, затем сушили для получения MSN-NH₂. При комнатной температуре MSN-NH₂ материал помещали в 10- мл центрифужную пробирку и диспергировали в подходящем количестве фосфатно-буферизованного раствора (PBS), затем Dox (5 мг/мл) добавляли капельно, и смесь мешали 24 ч. Наконец, карбоксил-модифицированный Sgc8 аптамер (100 нМ/мл) добавляли, и смесь мешали 1 ч, центрифугировали и вымывали PBS до бесцветности, получая Sgc8-MSN/Dox.

Характеризация Sgc8-MSN/Dox

Рентгеновские дифракционные картины (XRD) наночастиц измеряли XRD D4 дифрактометром (Bruker Inc., Germany). N₂ адсорпция-десорпция измеряли विशिष्ट поверхностный площади и пористоразмерным анализатором (TriStar 3000, GA Inc., USA). BET поверхностные площади вычисляли из BET графика. Пористораспределение оценивали из адсорпционной ветви изотермы BJH методом. Размер частиц и электростатический потенциал измеряли нано динамическим световым рассеянием анализатором (Malvern Instruments, UK). Измерения брали трижды для каждого образца и усредняли. Размер частиц и морфологию также оценивали трансляционной электронной микроскопией (H-7650, Tokyo, Japan) при ускоряющем напряжении электронного пучка 100 кВ. Одновременно конъюгация Sgc8 аптамера к поверхности MSN оценивали FT-IR спектроскопией (Nicolet-5700, USA). Для детектирования эффективности аптамер-модифицированного MSN/Dox мы собирали supernatент приготовления Sgc8-MSN/Dox и измеряли УФ абсорбцию при 260 нм, затем используя стандартный кривой метод определяли количество несвязанного аптамера. Так что количество модификации аптамера можно вычислить вычитанием несвязанного количества из общего добавленного.

Высвобождение Dox из Sgc8-MSN/Dox

Высвобождение Dox из Sgc8-MSN/Dox измеряли in vitro следующим образом. Sgc8-MSN/Dox (10 мг) растворили в 10 мл буфера pH 5,0 или 7,4 при 37 °C и встряхивали при 100 об/мин. В предопределенные времена образцы удаляли, центрифугировали при 5000 об/мин 10 мин, и supernatент анализировали на Dox спектрофотометрией как описано Thermo Scientific Microplate Reader (81 Wyman Street, Waltham, USA) при 482 нм.

Таргетирующая способность Sgc8-MSN/Dox

CEM или Ramos клетки (3 × 10⁶) в PBS добавляли в 15- мл центрифужные пробирки и смешивали с Sgc8-MSN/Dox или MSN/Dox (аптамер концентрация, 200 нМ). Пробирки инкубировали при 37 °C 20–30 мин, затем клетки собирали центрифугированием, вымывали 3 раза PBS, фиксировали 4% параформальдегидом 30 мин, и вымывали 3 раза PBS. Клетки инкубировали 5 мин с 1 мг/мл DAPI, вымывали 3 раза PBS и центрифугировали. Клеточный пеллет переподвешивали в PBS и наносили на слайды для анализа флуоресцентной конфокальной микроскопией (Nikon DS-Ri1; Tokyo, Japan).

В отдельных экспериментах CEM и Ramos клетки (3 × 10⁵) в логарифмической фазе роста переподвешивали в смеси 50 мкл PBS, 45 мкл связывающего буфера [PBS с добавлением 5 мМ MgCl₂, 4,5 г/л глюкозы и 1 мг/мл сывороточного альбумина (BSA)], и 10 мкл FBS [PBS с добавлением 1 мг/мл BSA] содержащего указанные материалы при аптамер концентрации 200 нМ. Смесь встряхивали в темноте 30 мин при 4 °C. Клетки вымывали в вымывающем буфере, центрифугировали при 1000 об/мин 5 мин, затем вымывали еще 3 раза. Наконец, клетки переподвешивали в 500 мкл вымывающего буфера и анализировали потоковой цитометрией (Beckman Coulter Epics X L; Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA).

Цитотоксичность MSN

Цитотоксичность MSN без Dox или аптамера оценивали MTT методом. CEM, Ramos, 293T и L-02 клетки в логарифмической фазе роста добавляли в 96-колодчатые пластинки (1,5 × 10⁴/колодка). MSN (100 мкл) добавляли в каждую колодку, и пластинки культивировали в 5% CO₂ инкубаторе при 37 °C 24 или 48 ч. MTT (20 мкл) добавляли в каждую колодку, пластинки инкубировали при 37 °C еще 30 мин, затем пластинки центрифугировали при 1500 об/мин 10 мин, и культуральные supernatенты утилизировали. DMSO (200 мкл) добавляли в каждую колодку, пластинки встряхивали в темноте 10 мин, и затем оптическая плотность (OD) при 570 нм измеряли автоматическим микропластинковым ридером. Каждый образец тестировали с шестью репликатами, и результаты выражали как mean ± SD.

Убийство клеток Sgc8-MSN/Dox

CEM, Ramos, 293T и L-02 клетки в 96-колодчатых пластинках (1 × 10⁵ клеток на колодку) инкубировали 24 ч с свободным Dox, MSN/Dox или Sgc8-MSN/Dox при Dox концентрациях 1, 5, 10, 15 или 20 мкг/мл. Чтобы дополнительно подтвердить, что Sgc8-MSN/Dox действительно таргетированно убивает CEM клетки через аптамер рецептор, мы сначала инкубировали достаточное Sgc8 аптамер с CEM клетками 2 ч, затем инкубировали с Sgc8-MSN/Dox при Dox концентрации 20 мкг/мл 24 ч. Выживаемость сравнивали MTT анализом как описано в разделе «Цитотоксичность MSN».

Статистический анализ

Результаты анализировали статистически используя Стьюдентов t-тест и односторонний дисперсионный анализ с наименее значимой разницей тестом. Все анализы выполняли с GraphPad Prism 6.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Результаты и обсуждение

Характеризация Sgc8-MSN/Dox

XRD данные показывают, что синтезированные наночастицы имеют типичный дифракционный пик гексагональных мезопоров в X диапазоне (Рис. 2a), что подтвердило структуру MSN. Для дальнейшего изучения конкретной поверхностной площади, пористораспределения и мезопористых параметров MSN мы провели азотную адсорпцию-десорпцию тест на MSN. N₂ адсорпция-десорпция изотермы MSN (Рис. 2b) демонстрируют тип IV изотерму характеристику, указывающую на мезопористые характеристики. BET модель вычисленная площадь поверхности 1389 м²/г. BJH кривая показывает, что пористораспределение частиц узкое (Рис. 2b, вставка). Пористый размер 5,23 нм, и пористый объем 2,51 см³/г. Большая конкретная площадь поверхности и пористый объем и богатые мезопоры делают возможным более сильную загрузку препарата и имеют потенциал быть отличным носителем препарата. Электронная микроскопия показала Sgc8-MSN/Dox с хорошей диспергабельностью и равномерным размером, сферической или эллиптической формы (Рис. 3a). Средний дзета-потенциал MSN/Dox в PBS был −26,53 мВ, который снизился до −33,87 мВ в Sgc8-MSN/Dox (Рис. 3b), отражая отрицательный заряд на Sgc8 аптамере. Пористые каналы на поверхности мезопористого кремния наблюдались. В PBS MSN/Dox показывали средний гидратированный размер частиц 98,35 нм, который увеличился до 103,24 нм после связывания Sgc8 аптамера для получения Sgc8-MSN/Dox (Рис. 3c, d). Для дополнительного подтверждения успешной конъюгации Sgc8-MSN/Dox провели FT-IR спектроскопию. Инфракрасный спектр показан на Рис. 3e. Пики 3400 см⁻¹, 1100 см⁻¹ и 500 см⁻¹ — характерные пики кремнезема. Пик около 2400 см⁻¹ — пик CTAB шаблонного агента. Пик около 1600 см⁻¹ — NH₂ пик. Пик, появляющийся около 1700 см⁻¹, считается растягивающим пиком C=O связи кластерной основы Dox загруженного в MSN. Новый пик при 1650 см⁻¹ из-за основания Шиффа (–C=N–) сгенерированного реакцией Sgc8 с NH₂-MSN/Dox. Эти доказательства подтверждают, что Sgc8-MSN/Dox система доставки препаратов успешно приготовлена. Для детектирования эффективности аптамер-модифицированного Sgc8-MSN/Dox мы использовали УФ спектрофотометр для измерения абсорбционной плотности (OD) аптамера при 260 нм и рассчитывали эффективность модификации аптамера к наночастице на основе изменения OD значения до и после модификации аптамера к поверхности наночастицы. УФ-Вис спектры аптамер раствора и supernatента показаны на Рис. 3e. Согласно расчету, количество Sgc8 аптамер модификации к Sgc8-MSN/Dox было около 6,87 нмоль мг⁻¹ Sgc8-MSN/Dox.

In vitro высвобождение Dox из Sgc8-MSN/Dox

MSN/Dox и Sgc8-MSN/Dox высвобождали свой препарат медленно при pH 7,4: не более 50% препарата высвобождалось в течение 96 ч (Рис. 4). Это указывает, что MSN могут поддерживать медленное высвобождение препарата длительностью 96 ч, вероятно, потому что препарат распространяется по внутренним каналам мезопористого кремния. Высвобождение было намного быстрее при pH 5,0, с скоростями высвобождения достигающими 60% к 48 ч и >80% к 96 ч. Кривые высвобождения Dox были почти идентичны для Sgc8-MSN/Dox и MSN/Dox, предполагая, что аптамерная лигация не влияет на наночастичную структуру. Более высокое высвобождение при кислом pH полезно, потому что опухолевые клетки находятся в слабо кислой среде и Sgc8-покрытые наночастицы внутреняются в эндосомы. Наши результаты поддерживают идею, что мезопористый кремний может ускорять высвобождение препарата в кислой среде.

In vitro таргетирование лейкемических клеток Sgc8-MSN/Dox

Мы изучали наночастичный аптайк CEM Т-лимфоцитарных лейкемических клеток как целевых клеток и Ramos Б-лимфомных клеток как нецелевых клеток. Основываясь на потоковой цитометрии, нецелевые клетки интернализировали MSN/Dox в похожем экстенте как Sgc8-MSN/Dox, тогда как целевые клетки интернализировали аптамер-покрытые наночастицы в гораздо большей степени чем MSN/Dox (Рис. 5a). Согласованно с этими результатами, флуоресцентная конфокальная микроскопия показала сильную Dox флуоресценцию (красную) внутри CEM клеток, экспонированных Sgc8-MSN/Dox, но не внутри Ramos клеток, обработанных тем же способом (Рис. 5b). Эти результаты отражают установленную способность Sgc8 аптамера таргетировать лейкемические клетки. Sgc8 распознает PTK-7 на поверхности CEM клеток, рекрутируя наночастицы к поверхности и тем самым делая их аптайк более эффективным. Наши результаты предполагают, что Sgc8-MSN/Dox может таргетировать PTK-7 экспрессирующие раковые клетки на первичных и вторичных сайтах или в циркуляции, делая его полезным для контроля метастазов. Возможно расширить наш MSN подход к другим аптамерам с другими таргетирующими специфичностями.

Цитотоксичность MSN

Учитывая важность биобезопасности для нано-систем доставки препаратов, мы сначала изучали токсичность пустых MSN против CEM, Ramos, 293T и L-02 клеток. Выживаемость всех клеточных линий оставалась выше 90% даже после 48-ч инкубации с до 100 мкг/мл MSN (Рис. 6). Это предполагает, что MSN показывают пренебрежимую цитотоксичность.

Далее мы исследовали способность Sgc8-MSN/Dox убивать целевые опухолевые клетки (CEM клетки) и нецелевые клетки (Ramos, 293T и L-02 клетки). Клетки инкубировали с разными концентрациями свободного Dox, MSN/Dox или Sgc8-MSN/Dox 24 ч, затем выживаемость оценивали MTT анализом. Против целевых CEM клеток свободный Dox показывал слегка большую токсичность чем две MSN формуляции, в то время как Sgc8-MSN/Dox был значительно более токсичен чем MSN/Dox при той же концентрации препарата (Рис. 7). Против Ramos, 293T и L-02 клеток свободный Dox показывал значительно большую токсичность чем MSN формуляции, которые показывали похожую токсичность с или без Sgc8. Чтобы дополнительно подтвердить, что Sgc8-MSN/Dox действительно таргетированно убивает CEM клетки через аптамер рецептор PTK-7, мы сначала инкубировали достаточное Sgc8 аптамер с CEM клетками 2 ч для блокировки места связывания и затем ко-инкубировали с Sgc8-MSN/Dox. MTT анализ показал, что свободный аптамер не имел токсичности к CEM клеткам, и после достаточно Sgc8 аптамера заблокировал место связывания, Sgc8-MSN/Dox показал значительно меньшую токсичность чем свободная Sgc8-MSN/Dox группа (Рис. 7e). Эти результаты подчеркивают способность аптамера таргетировать доставку препарата и усиливать убийство целевых клеток. Такое таргетирование может помочь снизить аптайк препарата нецелевыми клетками как и позволить использование более низких доз; оба эффекта могут снизить риск токсичных побочных эффектов.

Аптамеры могут использоваться как направляющие молекулы для доставки препаратов и различных макромолекул или наноносителей к опухолевым клеткам, иногда аптамер также может работать как терапевтик. Например, AS1411 аптамер может специфически связываться с нуклеолином, и нуклеолин экспрессируется в и на поверхности опухолевых клеток, вовлеченных в клеточное дифференцирование, выживание, воспаление, ангиогенез и опухолевое развитие. AS1411 аптамер может индуцировать ингибицию роста ксеномоделей (почечный рак, легчечный рак, MX1 рак груди и поджелудочный рак) связываясь с нуклеолином. Более того, AS1411 аптамер-функционализированные, доксорубицин-загруженные липосомы (Apt-Dox-Lip) тестировались на раке груди, и результаты показали большой потенциал применения. Аптамеры были успешны в широком диапазоне клинических испытаний благодаря своим отличным свойствам. Первый аптамер был одобрен FDA в 2005, с тех пор все больше аптамеров достигают клинических испытаний. Аптамеры применялись к противоопухолевым клиническим испытаниям, включая рак простаты, рак легких, остраю миелоидную лейкемию и так далее. Несомненно, эти аптамер-связанные клинические испытания дают новую надежду изменить конвенциональный стиль терапии.

В последние годы аптамеры комбинировали с разными наноматериалами для таргетированной терапии опухолей. Можно видеть, что аптамеры обладают экстраординарными молекулярными распознаваниями и таргетирующими возможностями. Однако есть все еще некоторые проблемы, которые нельзя игнорировать в развитии применения аптамеров, такие как влияет ли нуклеаза на стабильность аптамеров in vivo, легко ли аптамеры малых молекулярных веществ, входящие в тело, быстро удаляются почечной системой, и осуществима ли фактическая таргетирующая производительность in vivo. Для использования полного потенциала аптамер-базированных таргетированных наноматериалов, больше in vivo тестирования и клинически релевантных экспериментов остаются фокусом текущих исследований. В то же время, тераностика опухолей — важное направление для будущего развития, и дизайн и подготовка более многофункциональных биологически-функциональных материалов несомненно являются трендом развития.

Заключение

Мы сконструировали аптамер-модифицированную MSN систему доставки, которая может эффективно таргетировать лейкемические клетки и способствовать Dox аптайку. Это таргетирование, в сочетании со способностью MSN высвобождать препарат медленно и предпочтительно под кислыми условиями, может помочь системе доставки накапливаться в местах опухоли и убивать клетки непрерывно. Возможно таргетировать практически любой тип опухолевых клеток с этим MSN подходом путем выбора подходящих аптамеров. Но нельзя игнорировать, что Sgc8-MSN/Dox может также иметь упомянутые выше проблемы, и его in vivo стабильность и таргетирование все еще нуждаются в дальнейшем изучении. В следующем мы объединим предыдущее исследование, чтобы загрузить систему доставки препаратов как диагностическими реактивами, так и препаратами, придавая ей тераностическую функцию таргетированной диагностики и таргетированного лечения.

Аббревиатуры

MSN

Мезопористые кремнеземные наночастицы

Dox

Доксорубицин

Sgc8-MSN/Dox

Аптамер-модифицированная мезопористая кремнеземная система доставки препарата

PTK-7

Белок тирозин-киназа-7

TEOS

Тетраэтилортсиликат

APTES

3-Триэтоксисилпропиламин

CTAB

Цетил-триметиламмоний бромид

CEM

CCRF-CEM клетки

PBS

Фосфатно-буферизованный раствор