Оптимизированная подготовка и физико-химическая характеристика двухлекарственных нанолипосом, инкапсулирующих эрлотиниб и доксорубицин

Аннотация

Синергетическая комбинационная химиотерапия опирается на доставку препаратов с разными механизмами действия в скоординированном режиме. Мы представляем воспроизводимую, не-PEGилированную нанолипосомальную платформу, ко-инкапсулирующую эрлотиниб (ERL) в липидном бислое и доксорубицин (DOX) в водном ядре. Липиды (DSPC, холестерин, POPG) собирали методом тонкой пленки гидратации, за которым следовала зонд-соникация для получения суб-200 нм везикул. DOX загружали с использованием сульфата аммония (AS) или pH-градиентов; AS-градиент дал >90 % эффективность инкапсуляции (EE) против ~17 % для pH-метода. EE ERL достиг 30 %. Проходная электронная микроскопия раскрыла кристаллические ядра DOX-сульфата и менее упорядоченные кристаллы ERL в бислое. Везикулы оставались размерно-стабильными в диапазоне 4–37 °C и высвобождали ERL быстро (<8 ч), в то время как DOX высвобождался медленно, обеспечивая временно-дифференциальный синергетический профиль. Эти находки устанавливают надежную двухлекарственную нанолипосомальную платформу, подходящую для трансляционных исследований.

Введение

Тройно-негативные раки груди и другие стойкие опухоли устойчивы к стандартным монотерапиям из-за переплетенных путей повреждения ДНК и выживания. Комбинационные режимы, сначала праймирующие опухоли ингибитором фактора роста, а затем подвергающие их генотоксическому агенту, показали доклиническую синергию. Для перевода таких in vitro эффектов в клинику необходима доставка, ко-доставляющая оба агента и синхронизирующая их высвобождение, особенно когда фармакокинетика значительно различается.

Нанолипосомы — везикулы из фосфолипидного бислоя — естественно инкапсулируют гидрофильные препараты в ядре и гидрофобные в мембране, достигая ко-локализации и усиленного накопления в опухоли за счет эффекта усиленного проникновения и удержания (EPR). Однако надежные, воспроизводимые протоколы производства и комплексной физико-химических данные остаются редкими, ограничивая клиническую трансляцию.

Методы

Материалы

DSPC, POPG, холестерин (Avanti Polar Lipids), DOX·HCl и ERL свободная база (Boryung Co. / Shanghai Send), сульфат аммония, лимонная кислота (Daejung) и реактивы (Sigma-Aldrich).

Подготовка двухлекарственных нанолипосом

ERL включили в смесь DSPC:холестерин:POPG 27:20:3 (вес/вес/вес) (3:50 вес/вес препарат) и высушили в тонкую пленку. Гидратация 250–400 мМ AS (или 300 мМ лимонной кислоты, pH 3,9) при 65 °C дала многоламеллярные везикулы. Зонд-соникация (5 с вкл/2 с выкл, 20 % амплитуда, 36 Дж/импульс) в ледяной ванне уменьшила размер до ~140 нм. Избыток AS удаляли овернайт диализом против PBS (pH 7,4).

DOX (1,5 мг/мл, 2 мл) добавляли к 8 мл ERL-загруженных липосом и загружали либо pH-градиентом, либо AS-градиентом. Оценивали четыре протокола загрузки DOX (инкубация, соникация, равновесие, диализ) для оптимизации EE.

Характеризация

Динамическое рассеяние света измеряло размер и полидисперсию; TEM (JEM-2100F) визуализировало морфологию и кристаллические структуры. Эффективность инкапсуляции вычисляли из препарата, высвобожденного Тритоном X-100, и kvantифицировали UV-Vis (ERL) или флуоресценцией (DOX). In vitro высвобождение использовали диализные кассеты в PBS (pH 7,4) при 37 °C. Физическую стабильность оценивали мониторингом размера при 4, 25 и 37 °C в течение 21 дня.

Результаты и обсуждение

Контроль размера соникацией

Необработанные ERL липосомы были ~760 нм, уменьшались до ~222 нм в течение 10 мин зонд-соникации; дальнейшая соникация давала незначительные изменения размера. Ванночная соникация достигала похожего уменьшения быстрее, но повышала нагрев, поэтому предпочли ледяное охлаждение. После диализа липосомы в среднем 140 нм.

Эффективность загрузки DOX

AS-градиентная загрузка дала 90 %+ EE, далеко превосходя ~17 % от pH-градиента. Концентрация 350 мМ AS максимизировала EE и минимизировала вариабельность, вероятно, благодаря благоприятной кристаллизации DOX-сульфата. Среди четырех протоколов комбинация 65 °C инкубации, 15 мин зонд-соникации и 30 мин равновесия при комнатной температуре (Группа 2) дала наивысшую EE (~98 %). Более длительная соникация или отложенное равновесие снижали EE, вероятно, из-за утечки AS.

Морфология и кристалличность

TEM изображения подтвердили сферические везикулы <200 нм. Высокоразрешающие TEM и SAED раскрыли высокоупорядоченные кристаллы DOX-сульфата в ядре и менее упорядоченные кристаллы ERL на внешней поверхности бислоя. Одно-лекарственные контроли показывали похожие кристаллические паттерны, подтверждая структурную целостность двухлекарственной системы.

Физическая стабильность

Изменения диаметра были <15 % при 4 °C, <10 % при 25 °C и <6 % при 37 °C за 21 день, указывая на надежную стабильность. Высокая температура фазового перехода DSPC и 40 % холестерин, вероятно, способствовали этой устойчивости.

Временно-дифференциальное высвобождение

В PBS ERL высвободил ~65 % к 48 ч, тогда как DOX ~30 %. Начальное 8-часовое окно показало >4 %/ч высвобождение ERL против <1 %/ч DOX, подтверждая последовательный профиль высвобождения, благоприятный для синергетического действия.

Заключение

Мы установили масштабируемую, не-PEGилированную нанолипосомальную платформу, ко-инкапсулирующую ERL и DOX с высокой EE и контролируемым размером. Зонд-соникация после гидратации пленки оптимально уменьшает диаметр везикул. AS-градиентная загрузка, особенно с 350 мМ AS и кратковременным после-соникационным равновесием, дает наивысшую EE DOX. TEM и SAED подтверждают отдельные кристаллические расположения каждого препарата. Везикулы физически стабильны и демонстрируют временно-дифференциальное высвобождение ERL и DOX, позиционируя их как перспективный вектор для синергетической раковой терапии.

Аббревиатуры

DOX

Доксорубицин

DSPC

1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин

EE

Эффективность инкапсуляции

EPR

Эффект усиленного проникновения и удержания

ERL

Эрлотиниб

PK

Фармакокинетика

POPG

1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфо-(1′-rac-глицерол) (натриевая соль)

SAED

Выбранная область электронной дифракции

SEM

Стандартная ошибка среднего

Tc

Температура фазового перехода

TEM

Проходная электронная микроскопия